專利名稱：一種三乙胺降解菌及其生產(chǎn)的菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種三乙胺降解菌及其生產(chǎn)的菌劑，屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域，是利用微 生物的方法降解廢水中的污染物，適用于現(xiàn)代廢水處理工藝。
二、技術(shù)背景 有機(jī)胺產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥、醫(yī)藥、橡膠、合成染料、石油、制革、洗滌劑以及有機(jī) 合成、無機(jī)化工等行業(yè)中。有機(jī)胺產(chǎn)品種類比較多，每一種產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中都會有殘余的 原料和中間產(chǎn)物進(jìn)入廢水中，這些物質(zhì)大多高氮低碳，有毒有害，難于生物降解，從而給此 類化工廢水的處理帶來了困難。三乙胺是有機(jī)溶劑和化工合成的重要原料，在合成樹脂制造中作為聚碳酸醋光氣 法的催化劑，四氟乙烯的阻聚劑和橡膠硫化促進(jìn)劑；也可用作食品防腐劑、乳化劑；同時還 是制造染料、殺蟲劑的原料。三乙胺(Triethylamine)是一種脂肪族胺，分子式(C2H5)3N，具 有強(qiáng)烈的氨臭味、有刺激性、易燃、易揮發(fā)。濃度為50mg/L的三乙胺可使人產(chǎn)生嚴(yán)重的肺刺 激癥狀。三乙胺廣泛存在于有機(jī)合成、農(nóng)藥、染料等生產(chǎn)廢水中，目前對于含三乙胺廢水的 處理多采用物理化學(xué)方法，其成本較高，且易造成二次污染；而生物修復(fù)技術(shù)因微生物本身 能對各類不同的有機(jī)污染物進(jìn)行降解和轉(zhuǎn)化而具有巨大的潛力。因此，從自然環(huán)境中篩選 得到能夠去除三乙胺的有效菌種具有重大的意義。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于針對生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際問題和需求，開發(fā)研制出一 種三乙胺降解菌劑，使用本菌劑可以降解廢水中的三乙胺，使廢水達(dá)標(biāo)排放，同時降低生產(chǎn) 和使用成本。技術(shù)方案下面為本發(fā)明的主要內(nèi)容本發(fā)明提供一種消除三乙胺的降解菌，其菌株是一株革蘭氏染色反應(yīng)陽性菌R4， 于2010年5月18日保藏于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，地址北京 市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號CGMCCN0. 3855，經(jīng)鑒定 為原玻璃蠅節(jié)桿菌(Arthrobacter protophormiae)。主要生物學(xué)特性為G+，對數(shù)生長期菌 體桿狀，無芽孢，好氧生長。能以三乙胺為唯一碳源、氮源進(jìn)行生長，并將其徹底礦化產(chǎn)生氨 氮。在實(shí)驗(yàn)室搖瓶條件下對100mg/L三乙胺的降解率達(dá)100%。該菌可以用發(fā)酵工業(yè)通用 發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行生產(chǎn)。使用上述三乙胺降解菌生產(chǎn)菌劑的工藝為斜面種一搖瓶種子液一種子罐一產(chǎn)品 (包裝劑型為液體菌劑)。本發(fā)明的詳細(xì)實(shí)施步驟為1)將試管種接種于LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；2)將上述培養(yǎng)好的菌種按10%的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，種子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖(質(zhì)量比，下文同)，(NH4)2SO4O. 05%, K2HPO4O. 15% ,MgSO4O. 01%，蛋白胨 0.05%，pH 7. 2-7.5 ；3)將種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng) 基相同； 4)在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1 0.6-1. 2，攪拌速度 為180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30°C，全流程培養(yǎng)時間為48-60小時，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量 達(dá)到10億個/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑。有益效果本發(fā)明提供了一種消除三乙胺污染的降解菌，實(shí)驗(yàn)室生物降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對 100mg/L三乙胺的降解率達(dá)到100%。該發(fā)明生產(chǎn)的降解菌劑具有生產(chǎn)成本低，使用方便，去除效果好的優(yōu)點(diǎn)，適合在含 有三乙胺的廢水處理中推廣使用。本發(fā)明對于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保護(hù)人類的身體健康，降低廢 水處理成本具有重要的意義。
四

圖1菌株R4菌落照片圖2接種量對三乙胺降解效率的影響圖3溫度對三乙胺降解效率的影響圖4通氣量對三乙胺降解效率的影響圖5氣相色譜檢測三乙胺降解效果
五具體實(shí)施例方式1菌株的分離和鑒定取三乙胺富集菌液，進(jìn)行梯度稀釋。稀釋液涂布于含100mg/L三乙胺的無機(jī)鹽 固體培養(yǎng)基(配方為每升含 1. 5g K2HP04、0. 5g KH2P04、0. 2g MgSO4 · 7H20、1. Og NaCl、 LOg(NH4)2SO4,15g瓊脂，pH 7.0)上，30°C培養(yǎng)數(shù)天。從中挑取單菌落驗(yàn)證其降解效果，將 降解效率較高的一株菌株保存，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。其菌落圖片見圖1，鑒定為原玻璃蠅節(jié)桿菌 (Arthrobacter protophormiae)；命名為R4。主要生物學(xué)特性為G+，對數(shù)生長期菌體為桿 狀，無芽孢，好氧生長。能以三乙胺為唯一碳源、氮源進(jìn)行生長，并將其徹底礦化產(chǎn)生氨氮。 在實(shí)驗(yàn)室搖瓶條件下對100mg/L三乙胺的降解率達(dá)100% (圖5)。該菌可以用發(fā)酵工業(yè)通 用發(fā)酵設(shè)備進(jìn)行生產(chǎn)。2實(shí)驗(yàn)室生物降解實(shí)驗(yàn)2. 1接種量對三乙胺降解效率的影響R4在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)后期，按0. 1,0. 5、1、2、3、5 %的接種量分別接入含 IOOmg/三乙胺的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(無機(jī)鹽培養(yǎng)基配方為每升含1. 5g K2HP04、0. 5gKH2P04、 0. 2g MgSO4 · 7Η20、1· Og NaClU. Og(NH4)2SO4, pH 7. 0)，下文同)中，30°C、160r/min 搖床培 養(yǎng)，20小時后取樣測定三乙胺的含量，結(jié)果如圖2。測定結(jié)果表明，按接種量從低到高排列， 呋喃丹的降解率依次為10%、38%、65%、80%、90%、91%。由此可見，接種量的大小對三乙 胺的降解效率有直接的關(guān)系，當(dāng)接種量小于3%時，提高接種量，三乙胺的降解效率有大幅提高，但接種量達(dá)到5%時，降解率只有微量提高，可能此時酶反應(yīng)已接近飽和。2. 2溫度對三乙胺降解效率的影響R4在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數(shù)后期，按的接種量接到含IOOmg/三乙胺的無機(jī) 鹽培養(yǎng)基中，分別置于15、20、25、30、37°C的溫度下，160r/min搖床培養(yǎng)，28h后測定其中三 乙胺的含量，結(jié)果如圖3所示。在15°C時，R4對三乙胺的降解率為14%;在20°C 30°C的 范圍內(nèi)，隨著溫度的升高降解菌降解呋喃丹性能明顯上升，在30°C時，降解率達(dá)96%。而當(dāng) 溫度達(dá)到37°C時，R4對三乙胺的降解率下降，僅為9%。以上數(shù)據(jù)說明，R4的最適降解溫度 為30°C ；在較低的溫度下仍具有一定的降解能力；而過低或過高的環(huán)境溫度會抑制三乙胺 的生物降解。2. 3通氣量對三乙胺降解效率的影響
在5個2501^的三角瓶中分別裝入30、50、70、100、15011^含IOOmg/三乙胺的無機(jī) 鹽培養(yǎng)基中，以裝液百分比來指示通氣量。R4在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數(shù)后期，按的接 種量接種到上述各培養(yǎng)基中，30°C、160r/m in搖床培養(yǎng)，20小時后測定三乙胺的降解率，結(jié) 果如圖4。20小時的測定結(jié)果表明裝有30、50、70、100、150!^培養(yǎng)液的三角瓶中呋喃丹的 降解率分別為91%、86%、79%、65%和42%，R4降解三乙胺的過程是個好氧過程，大通氣 量有助于三乙胺的降解。2. 4 R4對三乙胺的耐受濃度試驗(yàn)R4在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)后期，按2%接種至不同濃度的三乙胺(100、200、 500U000mg/L)的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，每隔一定時間測定三乙胺的含量，結(jié)果如表1。IOOOmg/ L高濃度三乙胺未對R4生長產(chǎn)生抑制，完全降解100mg/L三乙胺需要32h。表1三乙胺起始濃度對R4降解的影響
"^藝胺的起始濃度(mg/L)三乙胺的含"""
100 8.1 0 0 20083.779.279.2
500393.5390.5390.5
1000890. 6885.6885.63生產(chǎn)實(shí)施將本發(fā)明的微生物三乙胺降解菌R4的原種在培養(yǎng)皿上活化，并測定降解性能， 接種于試管斜面上備用。試管種接種于含200ml LB培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基配方g/L:酵母膏 5. 00，蛋白胨10. 00，NaCl 10. 00，pH 7. 0)的IOOOml搖瓶中，恒溫振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，準(zhǔn)備 接種種子罐。種子罐500升，投料量400升，培養(yǎng)基配方為葡萄糖1%，(NH4)2SO4O. 05%, K2HPO4O. 15% ,MgSO4O. 01%，蛋白胨 0.05%，pH 7.2-7.5。投料完畢后 115°C高壓濕熱滅菌， 冷卻至30°C后，將上述培養(yǎng)好的搖瓶菌種按10%的接種量接入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù) 生長期，攪拌速度為220轉(zhuǎn)/分，無菌空氣通入量為1 0.8。將達(dá)到對數(shù)生長期的種子液 按10%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基成分與種子罐培養(yǎng)基相同。生產(chǎn)罐容 量5噸，投料量4. 5噸。投料后生產(chǎn)罐1. lkg/cm2的壓力下，115°C高壓濕熱滅菌，滅菌后冷卻至30°C以下，通無菌空氣保持無菌狀態(tài)備用。接種后的生產(chǎn)罐溫度控制在30°C，生產(chǎn)罐 的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1 0. 8-1. 0，攪拌速度為240轉(zhuǎn)/分，整個工藝流程培 養(yǎng)時間為48-60小時。發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個/ml以上。
發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直 接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑型。
權(quán)利要求
一種三乙胺降解菌，其特征在于該微生物是革蘭氏染色陽性的原玻璃蠅節(jié)桿菌(Arthrobacter protophormiae)的菌株R4，于2010年5月21日保藏于中國微生物菌種保存管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC NO.3855。主要生物學(xué)特性為G+，對數(shù)生長期菌體為桿狀，無芽孢，好氧生長。能以三乙胺為唯一碳源、氮源進(jìn)行生長，并將其徹底礦化產(chǎn)生氨氮。在實(shí)驗(yàn)室搖瓶條件下對100mg/L三乙胺的降解率達(dá)100％。
2.一種用權(quán)利要求1所述的三乙胺降解菌生產(chǎn)的降解菌劑，是通過以下方法生產(chǎn)而成1)將試管種接種于LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；2)將上述培養(yǎng)好的菌種按10%的接種量接種入500升種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，種 子罐所用的培養(yǎng)基配方為葡萄糖(質(zhì)量比，下文同)，(NH4)2S040. 05%,K2HP040. 15%, MgS040 . 01%，蛋白胨 0. 05%, pH 7. 2-7. 5 ；3)將種子液按10%的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1 0.6-1. 2，攪拌速度為 180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30°C，全流程培養(yǎng)時間為48-60小時，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá) 到10億個/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種消除三乙胺污染的降解菌及降解菌劑，屬于生物高技術(shù)領(lǐng)域。所用菌株為革蘭氏染色反應(yīng)陽性菌R4，經(jīng)鑒定為原玻璃蠅節(jié)桿菌(Arthrobacterprotophormiae)。主要生物學(xué)特性為G+，對數(shù)生長期菌體為桿狀，無芽孢，好氧生長。能以三乙胺為唯一碳源、氮源進(jìn)行生長，并將其徹底礦化產(chǎn)生氨氮。在實(shí)驗(yàn)室搖瓶條件下該菌株對100mg/L三乙胺的降解率達(dá)100％，解決了廢水處理中三乙胺難生物降解的問題。
文檔編號C02F3/34GK101935625SQ20101019925
公開日2011年1月5日 申請日期2010年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月12日
發(fā)明者任倩, 張金, 蔡天明, 陳立偉 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)