專利名稱：膠質(zhì)芽孢桿菌pm13菌株低粘度、高產(chǎn)率的發(fā)酵生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種膠質(zhì)芽孢桿菌PM13菌株低粘度、高產(chǎn)率的發(fā)酵生產(chǎn)方法，特別是莢膜生成能力很強的新誘變菌株P(guān)M13的液體發(fā)酵工藝，該產(chǎn)品可以作為土壤微生物改良劑使用。
背景技術(shù)：
設(shè)施農(nóng)業(yè)由于長期實行高集約化、高復種指數(shù)、高投入、連作重茬的種植模式， 造成設(shè)施土壤結(jié)構(gòu)、理化及生物特性發(fā)生了很大變化，產(chǎn)生土壤鹽漬化、營養(yǎng)失衡、微生物區(qū)系失衡等土壤障礙，成為制約設(shè)施農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要因素(王輝，董元華，安瓊等.高度集約化利用下蔬菜地土壤酸化及次生鹽漬化研究.土壤，2005，37 (005) =530-533 ； Gormen H, Ozkan V K. A research on themicrofungal flora of some greenhouse soils in the vicinity of Lapseki ^anakkale, Turkey. Mycopathologia, 2002,153 (2) 103-112.)。目前土壤修復研究主要集中在土壤改良劑的開發(fā)。膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)是硅酸鹽細菌的一種，具有分解硅酸鹽礦物、溶磷、解鉀、固氮等作用，目前廣泛應(yīng)用于生物肥料(吳小琴.硅酸鹽細菌的應(yīng)用概況.江西科學，1997，15(1) :60-66.)、礦物分解(賀積強，李登煜，張小平等.硅酸鹽細菌的研究進展.西南農(nóng)業(yè)學報，1999，12(1) :102-107.)、污水處理(Lian B, Chen Y， Zhao J, et al. Microbial Flocculation by Bacillusmucilaginosus AppIications and Mechanisms. Bioresource Technology, 2008,99 (11) :4825-4831.)等領(lǐng)域。膠質(zhì)芽孢桿菌在生長過程中生成的有機酸和莢膜多糖使其具有鹽離子吸附能力、土壤顆粒的團聚能力、解磷和解鉀能力，并且當其在土壤中繁殖為優(yōu)勢菌群后，還可以達到抑制病原菌的效果 (孫德四，陳福山，張強.硅酸鹽細菌特性及對硅鋁的活化與吸持研究.蘇州科技學院學報， 2005,18(4) J8-31 ；陳克亮，朱曉東，孫中黨等.鉀細菌在剩余污泥資源化中的應(yīng)用.環(huán)境保護科學，2006，32 O) :46-48 ；程麗娟，來航線，李素儉，等.微生物對土壤團聚體形成的影響.西北農(nóng)業(yè)大學學報，1994，22 ) :93-97.),所以該微生物在改良土壤結(jié)構(gòu)、平衡營養(yǎng)、 去鹽堿化和調(diào)節(jié)微生物區(qū)系失衡等土壤改良方面亦有很大的應(yīng)用潛力，可以作為微生物土壤改良劑的生產(chǎn)菌種。目前，國內(nèi)外關(guān)于膠質(zhì)芽孢桿菌的應(yīng)用研究主要集中在菌體增殖、礦物分解、生物絮凝等方面。這些研究的預期目的不同，進行菌體增殖培養(yǎng)時，目的是獲得高產(chǎn)量的芽孢； 進行礦物分解時，培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件應(yīng)有利于礦物分解和礦物元素的浸出；進行生物絮凝時，主要關(guān)注的是與其莢膜多糖密切相關(guān)的絮凝劑的合成效率，因此膠質(zhì)芽孢桿菌培養(yǎng)過程中考慮的因素、培養(yǎng)條件也各不相同。在菌體增殖培養(yǎng)方面，通過對培養(yǎng)條件的優(yōu)化，目前的研究可以獲得高于5X IO8CfVmL的芽孢產(chǎn)量，達到了我國微生物肥料產(chǎn)品標準所規(guī)定的濃度。吳向華等用液體發(fā)酵法生產(chǎn)膠質(zhì)芽孢桿菌100130菌株的芽孢生成量為 9. 58X IO8CfuAiL(吳向華，劉五星.膠凍樣芽孢桿菌培養(yǎng)條件及發(fā)酵工藝的優(yōu)化.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2006，(4) =155-158) 0胡秀芳等用液體發(fā)酵法生產(chǎn)膠質(zhì)芽孢桿菌021120菌株的芽孢生成量為9.8X108cfu/mL，是目前所報道的最高的芽孢生成量(胡秀芳，應(yīng)飛祥，陳集雙.膠質(zhì)芽孢桿菌突變株021120的培養(yǎng)條件及發(fā)酵工藝優(yōu)化.中國生物工程雜志，2007， 27(9) 58-62)。肥厚的莢膜是膠質(zhì)芽孢桿菌具有土壤調(diào)節(jié)能力的關(guān)鍵因素，膠質(zhì)芽孢桿菌PM13 菌株是一株新誘變的突變菌株，其產(chǎn)莢膜能力遠遠強于未突變菌株，所以PM13菌株在土壤改良方面具有更大的應(yīng)用潛力。但在菌體增殖培養(yǎng)過程中，過多莢膜的生成不僅消耗大量營養(yǎng)，抑制菌體生長，而且莢膜多糖會造成發(fā)酵液變粘稠，進而導致傳質(zhì)和流動困難，所以抑制莢膜的生長是降低發(fā)酵液粘度、促進菌體生長的有力手段。由于在適宜的條件下莢膜可以迅速再生，所以在菌體增殖培養(yǎng)過程中可以通過抑制莢膜生長同時達到降低發(fā)酵液粘度和提高菌體產(chǎn)量的目的。目前，主要是采用含氮培養(yǎng)基來抑制莢膜的生長(陳廷偉.鉀細菌.北京農(nóng)業(yè)出版社，1959. 4-7)，但PM13菌株在傳統(tǒng)的淀粉銨培養(yǎng)基中芽孢生成量極低，只有IO3CfuAiL左右，因此本發(fā)明建立了一種適用于土壤改良的膠質(zhì)芽孢桿菌PM13菌株低粘度、高產(chǎn)率的發(fā)酵生產(chǎn)方法。土壤改良是一個巨大的產(chǎn)業(yè)，市場需求量很大，以膠質(zhì)芽孢桿菌PMl3菌株為出發(fā)菌株生產(chǎn)的微生物土壤改良劑有著廣闊的市場前景。發(fā)明目的及內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對膠質(zhì)芽孢桿菌PM13菌株，采用液體發(fā)酵方法，通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件解決該菌株在生產(chǎn)過程中芽孢生成量較低和發(fā)酵液粘度大的問題，提供了一種低成本、低粘度、高產(chǎn)率，適用于大規(guī)模機械攪拌式發(fā)酵罐的發(fā)酵工藝。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)(1)菌種活化將保存的膠質(zhì)芽孢桿菌PM13菌種作為菌種，劃線接種到斜面培養(yǎng)基中，在30°C 34°C的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M 120h ；(2)種子液制備將步驟⑴得到的膠質(zhì)芽孢桿菌PM13菌種接種到裝有30 60mL 液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在30 34°C、200 250r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)12 24h ；
(3)搖瓶培養(yǎng)將步驟⑵獲得種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行搖瓶培養(yǎng)， 培養(yǎng)工藝參數(shù)為種子液接種量為1 10%，250mL三角瓶裝液量為30 60mL，初始pH為 7. 0 8. 0，發(fā)酵溫度為32 36°C，搖床轉(zhuǎn)速為200 250r/min，發(fā)酵時間為40 48h ；(4)發(fā)酵罐發(fā)酵或?qū)⒉襟E(2)獲得的種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，用機械攪拌式發(fā)酵罐進行發(fā)酵，發(fā)酵工藝參數(shù)為接種量3 10 %，裝液量60 80 %，消泡劑添加量 0. 01% 0. 06%，發(fā)酵溫度32 36°C，攪拌速度200 700r/min，通氣量0. 6 1. OM3A, 罐壓0. 04 0. IMPa，溶氧30 100%，發(fā)酵pH值6. 0 8. 5，發(fā)酵時間35 48h。在上述技術(shù)方案中，各培養(yǎng)基組成分別為斜面培養(yǎng)基用蒸餾水配制，其組成為蔗糖 5g/L，石英砂 lg/L，K2HP042g/L, FeCl3O. 005g/L, MgSO4. 7Η200· 5g/L，CaCO3O. 5g/L，瓊脂15 20g/L，pH值7. 5 ；液體種子培養(yǎng)基用蒸餾水配制，其組成為蔗糖5. 0 15. Og/L, K2HPO4L 0 3. Og/L, MgSO4. 7Η20 0· 0 2. Og/L, NaCl 0· 0 0. 5g/L, CaCO3L 0 5. Og/L, pH值7. 0 8. 0 ；液體發(fā)酵培養(yǎng)基用蒸餾水配制，其組成為糖蜜3. 0 5. Og/L,淀粉1. 0 3. 0g/L,豆粕粉 5. 0 10. 0g/L, CaC034. 0 10. 0g/L, K2HPO4L 0 3. 0g/L, MgSO4. 7H20 1· 0 3. 0g/L, NaCl 0· 0 0· 5g/L, pH 值 7· 0 8· 0。通過上述技術(shù)方案得到膠質(zhì)芽孢桿菌ΡΜ13菌株發(fā)酵液芽孢生成量為0. 8
41. 5乂109(^11/!^，發(fā)酵液稠度系數(shù)低于0. 5Pasn。該技術(shù)具有原料便宜，工序簡單，發(fā)酵周期短等優(yōu)點。PM13菌株發(fā)酵液可以用于土壤改良，改善設(shè)施土壤的土壤鹽漬化、營養(yǎng)失衡、微生物區(qū)系失衡等土壤障礙，因此本發(fā)明具有顯著的經(jīng)濟和社會效益。
具體實施例方式具體實施方式
僅為本發(fā)明部分實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
具體實施方式
中使用的各培養(yǎng)基及其組成分別為斜面培養(yǎng)基用蒸餾水配制，其組成為蔗糖5g/L，石英砂l(fā)g/L，K2HP042g/L, FeCl3O. 005g/L, MgSO4. 7H20 0. 5g/L, CaCO3O. 5g/L,瓊脂 15 20g/L，pH 值 7. 5 ;液體種子培養(yǎng)基用蒸餾水配制，其組成為蔗糖5. 0 15. Og/L, K2HPO4L 0 3. Og/L, MgSO4. 7Η20 0· 0 2. Og/L, NaCl 0· 0 0. 5g/L, CaCO3L 0 5. Og/L, ρΗ 值 7· 0 8. 0 ；液體發(fā)酵培養(yǎng)基用蒸餾水配制，其組成為糖蜜3. 0 5. Og/L，淀粉1. 0 3. Og/ L,豆粕粉 5. 0 10. 0g/L, CaC034. 0 10. 0g/L, K2HPO4L 0 3. 0g/L, MgSO4. 7H20 1· 0 3. Og/L, NaCl 0· 0 0. 5g/L, pH 值 7· 0 8· 0。實施例1(1)膠質(zhì)芽孢桿菌ΡΜ13純菌種接種于斜面培養(yǎng)基，在34°C培養(yǎng)48h，進行菌種活化；(2)將斜面種子接種于裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于32°C以 200r/min轉(zhuǎn)速搖瓶培養(yǎng)15h，即為種子液；(3)將種子液以的接種量接種于裝有50mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于34°C以200r/min的轉(zhuǎn)速搖瓶培養(yǎng)40h，獲得芽孢生成量為1. 2X 109cfu/mL。實施例2(1)膠質(zhì)芽孢桿菌PM13純菌種接種于斜面培養(yǎng)基，在30°C培養(yǎng)120h，進行菌種活化；(2)將斜面種子接種于裝有60mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于30°C以 250r/min轉(zhuǎn)速搖瓶培養(yǎng)Mh，即為種子液；(3)將種子液以3%的接種量接種于裝有30mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于36°C以250r/min的轉(zhuǎn)速搖瓶培養(yǎng)40h，獲得芽孢生成量為1. 4X 109cfu/mL。實施例3(1)膠質(zhì)芽孢桿菌PM13純菌種接種于斜面培養(yǎng)基，在32°C培養(yǎng)96h，進行菌種活化；(2)將斜面種子接種于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于34°C以 200r/min轉(zhuǎn)速搖瓶培養(yǎng)12h，即為種子液；(3)將種子液以10%的接種量接種于裝有60mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于32°C以220r/min的轉(zhuǎn)速搖瓶培養(yǎng)48h，獲得芽孢生成量為1. 0X 109cfu/mL。實施例4(1)膠質(zhì)芽孢桿菌PM13純菌種接種于斜面培養(yǎng)基，在34°C培養(yǎng)40h，進行菌種活化；(2)將斜面種子接種于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于32°C以 200r/min轉(zhuǎn)速搖瓶培養(yǎng)15h，即為種子液；(3) IOL攪拌式發(fā)酵罐內(nèi)加入7L液體發(fā)酵培養(yǎng)基，0. 03%消泡劑，121°C蒸汽滅菌 20min,冷卻至;34°C，按5%接種量接入種子液，罐壓0. 07MPa、通氣量0. 8M3/h，攪拌速度0 6h 為 250r/min，6 35h 為 500r/min，溶氧 30 90%，控制 pH 值為 6. 0 8. 5，發(fā)酵 35h, 獲得芽孢生成量為1. 2X 109cfu/mL。實施例5(1)膠質(zhì)芽孢桿菌PM13純菌種接種于斜面培養(yǎng)基，在30°C培養(yǎng)Mh，進行菌種活化；(2)將斜面種子接種于裝有50mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于30°C以 250r/min轉(zhuǎn)速搖瓶培養(yǎng)Mh，即為種子液；(3) IOL攪拌式發(fā)酵罐內(nèi)加入6L液體發(fā)酵培養(yǎng)基，0. 01%消泡劑，121°C蒸汽滅菌 20min,冷卻至32°C，按3%接種量接入種子液，罐壓0. 04MPa、通氣量0. 6M3/h，攪拌速度0 20h 為 250r/min, 20 34h 為 700r/min, 34 48h 為 200r/min,溶氧 30 80 %，控制 pH 值為6. 0 8. 5，發(fā)酵48h，獲得芽孢生成量為0. 8 X 109cfu/mL。實施例6(1)膠質(zhì)芽孢桿菌PM13純菌種接種于斜面培養(yǎng)基，在30°C培養(yǎng)120h，進行菌種活化；(2)將斜面種子接種于裝有60mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于34°C以 200r/min轉(zhuǎn)速搖瓶培養(yǎng)20h，即為種子液；(3) IOL攪拌式發(fā)酵罐內(nèi)加入8L液體發(fā)酵培養(yǎng)基，0. 06%消泡劑，121°C蒸汽滅菌 20min,冷卻至36°C，按10%接種量接入種子液，罐壓0. IMPa、通氣量1. OM3A,攪拌速度0 18h 為 250r/min，18 ^h 為 500r/min，28 !35h 為 200r/min，溶氧 30 100 %，控制 pH 值為6. 0 8. 5，發(fā)酵40h,獲得芽孢生成量為1. 5 X 109cfu/mL。
權(quán)利要求
1.一種膠質(zhì)芽孢桿菌PM13菌株低粘度、高產(chǎn)率的發(fā)酵生產(chǎn)方法，其具體過程為(1)菌種活化將保存的膠質(zhì)芽孢桿菌PM13菌種作為菌種，劃線接種到斜面培養(yǎng)基中， 在30°C 34°C的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)M 120h ；(2)種子液制備將步驟⑴得到的膠質(zhì)芽孢桿菌PM13菌種接種到裝有30 60mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在30 34°C、200 250r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)12 24h ；(3)搖瓶培養(yǎng)將步驟( 獲得種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)工藝參數(shù)為種子液接種量為1 10 %，250mL三角瓶裝液量為30 60mL，初始pH為7. 0 8. 0，發(fā)酵溫度為32 36°C，搖床轉(zhuǎn)速為200 250r/min，發(fā)酵時間為40 48h ；(4)發(fā)酵罐發(fā)酵或?qū)⒉襟E( 獲得的種子液接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，用機械攪拌式發(fā)酵罐進行發(fā)酵，發(fā)酵工藝參數(shù)為接種量3 10 %，裝液量60 80 %，消泡劑添加量 0. 01% 0. 06%，發(fā)酵溫度32 36°C，攪拌速度200 700r/min，通氣量0. 6 1. OM3A, 罐壓0. 04 0. IMPa,溶氧30 100%，發(fā)酵pH值6. 0 8. 5，發(fā)酵時間35 48h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征是斜面培養(yǎng)基用蒸餾水配制，其組成為蔗糖 5g/L，石英砂 lg/L，K2HP042g/L, FeCl3O. 005g/L, MgSO4. 7Η200· 5g/L，CaCO3O. 5g/L，瓊脂 15 20g/L，pH 值 7. 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征是液體種子培養(yǎng)基用蒸餾水配制，其組成為蔗糖 5. 0 15. Og/L, K2HPO4L 0 3. Og/L,MgSO4. 7Η20 0· 0 2. 0g/L，NaCl 0· 0 0. 5g/ L, CaCO3L 0 5. Og/L, pH 值 7· 0 8· 0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征是液體發(fā)酵培養(yǎng)基用蒸餾水配制，其組成為糖蜜 3. 0 5. Og/L,淀粉 1. 0 3. Og/L,豆粕粉 5. 0 10. 0g/L, CaC034. 0 10. 0g/L, K2HPO4L 0 3. 0g/L, MgSO4 · 7H20 1· 0 3. 0g/L, NaCl 0· 0 0· 5g/L, pH 值 7· 0 8· 0。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征是獲得的膠質(zhì)芽孢桿菌ΡΜ13菌株發(fā)酵液芽孢生成量為0. 8 1. 5Χ 109cfu/mL，發(fā)酵液稠度系數(shù)在0. 5Pasn以下，采用普通的機械攪拌式發(fā)酵罐進行發(fā)酵生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種膠質(zhì)芽孢桿菌PM13菌株低粘度、高產(chǎn)率的發(fā)酵生產(chǎn)方法。將膠質(zhì)芽孢桿菌新突變菌株P(guān)M13經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化和液體種子培養(yǎng)基培養(yǎng)得到種子液，再將得到的種子液接種于適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基中采用搖瓶或發(fā)酵罐培養(yǎng)，得到芽孢產(chǎn)量在0.8～1.5×109cfu/mL，發(fā)酵液稠度系數(shù)在0.5Pasn以下的發(fā)酵液，此發(fā)酵液可以作為微生物土壤改良劑。與其他土壤改良劑相比，本發(fā)明所用菌株為新突變菌株，可采用搖瓶或常規(guī)機械攪拌式發(fā)酵罐生產(chǎn)，具有發(fā)酵時間較短、發(fā)酵成本低、產(chǎn)量高等特點，具有更大的應(yīng)用潛力。
文檔編號B09C1/10GK102260637SQ20101019433
公開日2011年11月30日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者王曉東, 王雪, 袁曉凡, 趙兵 申請人:中國科學院過程工程研究所