專利名稱：一種六六六降解菌及其在降解六六六中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種六六六降解菌及其在降解六六六中的應(yīng)用，特別涉及一株 Sphingobium japonicum菌株及其在降解丙體六六六中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
六六六(Hexachlorocyclohexane，HCH)是一種廣譜性的有機(jī)氯殺蟲劑，主要有 α、β、Y和δ (甲體、乙體、丙體、丁體)等4種異構(gòu)體，其異構(gòu)體的相對持久性與氯原子 在環(huán)己烷結(jié)構(gòu)上的排列方式有關(guān)，持久性順序?yàn)棣?HCH > δ -HCH > Y -HCH > α-HCH。由 于六六六的低水溶性和高氯狀態(tài)，在環(huán)境中非常穩(wěn)定。在斯德哥爾摩公約中，六六六已經(jīng)被 列為12種持久性有機(jī)污染物之一。在這4種異構(gòu)體中，只有丙體六六六(γ-HCH，又稱為林 丹)具有殺蟲活性，主要用來防治農(nóng)作物害蟲。六六六由于其毒性大，難分解，分布廣，危害重，在大量使用的同時也給環(huán)境造成 難以修復(fù)的危害，加之由于其脂溶性大的特點(diǎn)，通過食物鏈的富積對人類自身的影響正在 逐漸的顯現(xiàn)出來并加大。隨著人們認(rèn)識的加深和替代品的出現(xiàn)，20世紀(jì)80年代后，大部分 發(fā)達(dá)國家包括一些發(fā)展中國家禁止生產(chǎn)和使用混合六六六，六六六的總含量明顯降低。20 世紀(jì)90年代后，六六六的主要來自印度。同時，相當(dāng)數(shù)量的未使用的混合六六六存在自然 界中，包裝容器的損壞和滲漏給人類和野生生命造成了嚴(yán)重的威脅。中國曾是生產(chǎn)和使用 六六六的大國，自20世紀(jì)60年代初開始生產(chǎn)有機(jī)氯農(nóng)藥，到1983年停止生產(chǎn)，產(chǎn)量呈逐年 持續(xù)增長趨勢。這一時期六六六的大量使用造成了該類農(nóng)藥在土壤和農(nóng)作物中的大量積 累，在沒有使用過農(nóng)藥的地區(qū)，如西藏南迦巴瓦峰土壤和西藏庫拉崗日峰地衣、苔蘚中都檢 測到了六六六。自1983年禁止生產(chǎn)六六六后，食物中的殘留量有了明顯降低，但這并不意 味著六六六的危害不存在了。據(jù)對水體中的農(nóng)藥檢測，黃河部分河段、白洋淀地區(qū)端村水域 生態(tài)系統(tǒng)、珠江三角洲地區(qū)都檢測到了一定濃度的六六六。研究表明，六六六為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有類雌激素行為，干擾體內(nèi)正常內(nèi)分泌 物質(zhì)的合成與代謝，可導(dǎo)致生殖和發(fā)育障礙，殘留的六六六對人類和動物的健康構(gòu)成了嚴(yán) 重的威脅。但目前對于已經(jīng)施用過六六六的環(huán)境綜合治理，一直未見有比較成熟的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的本發(fā)明的目的在于針對環(huán)境保護(hù)和生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際問題和需求， 提供一種從長期受農(nóng)藥污染土壤中篩選分離的，能以林丹為唯一碳源和能源生長，并可以 高效降解丙體六六六(林丹)的菌株。本發(fā)明所提供的菌株，是Sphingobium japonicum HZ-Al0Sphingobium japonicum HZ-Al已于2009年12月28日保藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， 中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC N2 3539。本發(fā)明的Sphingobium japonicum HZ-A1，是從長期受六六六和滴滴涕等有機(jī)氯農(nóng)藥污染的土壤中分離篩選的。HZ-Al的形態(tài)和生理生化特征為在LB平板上30°C培養(yǎng)4 天后形成黃色扁平的.具有清晰邊緣、不透明的菌落該菌有極生鞭毛，G—，直或彎桿狀，具有 接觸酶和氧化酶活性，產(chǎn)黃色色素.菌體周圍產(chǎn)莢膜，能利用葡萄糖、半乳糖、海藻糖和阿 拉伯糖氧化產(chǎn)酸。Sphinobium japonicum HZ-Al CGMCC Na 3539在降解六六六中的應(yīng)用也屬于本 發(fā)明的保護(hù)范圍。所述應(yīng)用中，所述六六六為丙體六六六。其中，所述降解六六六的方法是將所述 Sphingobium japonicum HZ-Al CGMCC Ns . 3539接種到含有六六六的體系中培養(yǎng)。所述培養(yǎng)的溫度為15-45 °C，優(yōu)選為30°C。所述Sphingobium japonicum HZ-AICGMCC Na 3539 的接種量為 105cfu/g 以上，優(yōu)選為 105_106cfu/g。該菌能以林丹為唯一碳源和能源生長，并可以在12小時內(nèi)完全降解20mg/l的林 丹。實(shí)驗(yàn)證明，使用PH值為7的無機(jī)鹽培養(yǎng)液按10%接種量接種本發(fā)明的六六六降解菌， 在30°C對10 100mg/l的林丹有良好的降解效果。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn)表明該菌在 30天內(nèi)可以降解土壤中20mg/kg的林丹，對污染的土壤中有良好的降解效果，具有應(yīng)用于 田間修復(fù)六六六污染的土壤和水體的潛力。


圖1為菌株HZ-Al對20mg/l γ -六六六的降解曲線2為菌株HZ-Al降解Y-六六六的產(chǎn)物的色譜和質(zhì)譜圖(Α:色譜圖；B:l，2， 4-TCB質(zhì)譜圖；C γ -PCCH質(zhì)譜圖)圖3為PH值對菌株HZ-Al降解、-六六六的影響圖4為溫度對菌株HZ-Al降解γ -六六六的影響圖5為底物濃度對菌株HZ-Al降解γ -六六六的影響圖6為HZ-Al在土壤中對Y-HCH(20mg/kg)的降解曲線圖( -接菌的熏蒸樣品；■-接菌的未經(jīng)熏蒸樣品；▲-未接菌的熏蒸樣品；χ-未接菌的未熏蒸樣品)
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例1、Sphingobiumjaponicum HZ-AICGMCC Na 3539 的分離、純化及鑒定。本發(fā)明的發(fā)明人從長期受六六六和滴滴涕等有機(jī)氯農(nóng)藥污染的土壤中分離篩選 一株對Y-HCH具有降解作用的菌株，具體步驟如下將從北京宋家莊地區(qū)附近采集的長期 受六六六和滴滴涕等有機(jī)氯農(nóng)藥污染的活性土樣接種以到以Y_HCH(50mg/l)作為唯一碳 源的無機(jī)鹽溶液中振蕩培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接培養(yǎng)6次后，菌懸液以10倍梯度稀釋接種到含Y-HCH 的無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，30°C恒溫箱培養(yǎng)。選取生長快，菌落規(guī)則，傳代穩(wěn)定的菌落，純化 2 3次后得到純菌株；將分離出的5株菌作為復(fù)篩菌株在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至相同的 OD600nm值1. 0，以10% (105cfu/g)的接種量接入含有20mg/l y -HCH的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中， 于30°C，ISOrpm搖床培養(yǎng)48h，以不接菌的培養(yǎng)基作為對照，用氣相色譜(GC-EOT)定量測 定降解率(降解率(％ )=(對照組六六六含量一樣品組六六六含量)/對照組六六六含量X 100)，最終篩選到降解效率最高的一株菌，將該菌株命名為HZ-A1，轉(zhuǎn)入牛肉膏蛋白胨 斜面保存。
上述無機(jī)鹽培養(yǎng)液是按下述比例配制的在IOOOml水中，K2HPO4,1. 5g/l ；KH2PO4,
0.5g/l ； (NH4)2S04，0. 5g/l ；NaCl，0. 5g/l ；MgSO4, 0. 2g/l ；CaCl2,0. 05g/l ；FeSO4, 0. 02g/l ； 酵母粉，0.002g/l，ρΗ7.0，12 高壓滅菌20min。無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基是將上述無機(jī)鹽培養(yǎng) 液加入占無機(jī)鹽培養(yǎng)液總重量的1. 5 2. 0% (g/Ι)的瓊脂。上述LB培養(yǎng)基與文獻(xiàn)(微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]，北京，高等教育出版社，1988，75-78) 中相同。上述所用的氣相色譜的檢測條件為惠普5890II型氣相色譜(Hewlett-Packard 5890series II)，ECD 檢測器，毛細(xì)柱為 0V-1701，柱長 25m，內(nèi)徑 0. 32mm,膜厚 0. 25 μ m，檢 測器溫度300°C，進(jìn)樣口溫度250°C，柱溫210°C，載氣為氮?dú)?，柱?. 7psi，柱流速5. 4ml/ min。在這些檢測條件下，Y-HCH的保留時間分別為4. 7min。將測得的每個樣品對應(yīng)的峰 面積代入預(yù)先建立的峰面積_濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以計(jì)算出Y -HCH的濃度。采用安捷倫公司的氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC 6890N-MSD 5973N)分析Y-HCH的降解產(chǎn)物。 色譜條件色譜柱J&W HP-5石英毛細(xì)柱(30mX0. 25mmX0. 25μπι)；升溫程序；80°C保持
1.5min,以 20°C /min 升至 190°C，保持 Omin，以 5°C /min 升至 230°C，保持 Omin，以 25°C / min升至290°C，保持Omin ；載氣(He)流速1. OmL/min,進(jìn)樣量2 μ L，進(jìn)樣口溫度250°C。質(zhì) 譜條件電子轟擊(EI)離子源；電子能量70eV ；傳輸線溫度280°C ；離子源溫度230°C ；四 級桿溫度150°C。將HZ-Al采用美國BIOLOG微生物分類鑒定系統(tǒng)對降解菌進(jìn)行分類鑒定。將純化 的HZ-Al菌株在Biolog培養(yǎng)基上培養(yǎng)16-24h ；采用干管法以GN/GP-IF制備菌懸液，調(diào)整 濁度52% T ；菌懸液以每孔150 μ 1接種于GN-Microplate鑒定板，測定每個孔的吸光度 值，測定的結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對，由軟件自動給出鑒定結(jié)果。經(jīng)BIOLOG技術(shù)鑒定該菌株為 Sphingobium japonicum。Sphingobium japonicum HZ-Al已于2009年12月28日保藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微 生物研究所)，保藏登記號為=CGMCC Na . 3539。本發(fā)明提供的Sphingobium japonicum HZ-A1的形態(tài)和生理生化特征為在LB平 板上30°C培養(yǎng)4天后形成黃色扁平的.具有清晰邊緣、不透明的菌落該菌有極生鞭毛，G-, 直或彎桿狀，具有接觸酶和氧化酶活性，產(chǎn)黃色色素.菌體周圍產(chǎn)莢膜，能利用葡萄糖、半 乳糖、海藻糖和阿拉伯糖氧化產(chǎn)酸。本發(fā)明提供的六六六降解菌HZ-Al的代謝特性為該菌能以林丹為唯一碳源和能 源生長，并可以在12小時內(nèi)完全降解20mg/l的林丹。使用pH值為7的無機(jī)鹽培養(yǎng)液按 10% (ν/ν)接種量接種本發(fā)明的六六六降解菌，在30°C對10 100mg/l的林丹有良好的降 解效果。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn)表明該菌在30天內(nèi)可以降解土壤中20mg/kg的林丹，對 污染的土壤中有良好的降解效果，具有應(yīng)用于田間修復(fù)六六六污染的土壤和水體的潛力。實(shí)施例2、對本發(fā)明提供的六六六降解菌HZ-Al的降解性能進(jìn)行測定。一、六六六的降解和菌株生長實(shí)驗(yàn)HZ-Al的單菌落先在LB培養(yǎng)基中30°C擴(kuò)大培養(yǎng)16h，培養(yǎng)至OD6tltlnm值為1. 5，培養(yǎng)物4°C、6000rpm離心5min，用無菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)液(成分如實(shí)施例1中所述)洗滌菌 體沉淀，并用無機(jī)鹽培養(yǎng)液配置成菌懸浮液，以10%的接種量(1.5 XlO5CfVg)分別接入 含有 20mg/l y -HCH 的無機(jī)鹽培養(yǎng)基(K2HPO4,1. 5g/l ；KH2PO4,0. 5g/l ； (NH4) 2S04，0. 5g/l ； NaCl,0. 5g/l ；MgSO4,0. 2g/l ；CaCl2,0. 05g/l ；FeSO4,0. 02g/l ；酵母粉，0. 002g/l ；其余為 水，pH7. 0，121°C高壓滅菌20min)中，于30°C，180rpm搖床培養(yǎng)12h，每隔2h取樣一次，用氣 相色譜(GC-ECD)定量測定降解率(檢測條件同實(shí)施例1)，用DU 800分光光度計(jì)測定培養(yǎng) 物在600nm的光密度，來表征細(xì)胞的生長。液體培養(yǎng)基中農(nóng)藥的萃取過程如下10ml液體培 養(yǎng)基中加入等量正己烷，劇烈振蕩，混合物在4°C、3000rpm離心IOmin分層，小心收集上層 有機(jī)相。此有機(jī)溶劑萃取過程重復(fù)3次。抽提液中加入無水硫酸鈉干燥后，用正己烷適當(dāng) 稀釋，然后抽提液用氣相色譜分析。在降解實(shí)驗(yàn)中，未接種菌株HZ-Al的培養(yǎng)基(含20mg/ 1 Y -HCH)作為對照。上述實(shí)驗(yàn)表明，在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中HZ-Al對林丹的降解能力，從圖1中可以看出在 12小時之內(nèi)，隨著培養(yǎng)基中的六六六作為菌體生長的碳源被利用，培養(yǎng)液的細(xì)胞密度也相 應(yīng)增長，HZ-Al可以完全降解20mg/l林丹。在降解過程中，隨著氯離子的不斷釋放，有PCCH 和1，2，4-TCB等中間產(chǎn)物生成(圖2. B和C)。相比之下，在未接種菌株HZ-Al的培養(yǎng)基中沒 有檢測到六六六的降解、和細(xì)胞的生長。圖1中， 為未接種HZ-Al的培養(yǎng)基中Y-六六六 的濃度，·為接種HZ-Al的培養(yǎng)基中Y-六六六的濃度，▲為接種HZ-Al的培養(yǎng)基中菌株的 生長速度(以O(shè)D6tltlnm表示)。圖2為菌株HZ-Al在含Y -六六六的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6小時取 樣的色譜和質(zhì)譜圖。二、不同因素對菌株HZ-Al降解特性影響的研究2. IpH值對菌株HZ-Al降解、-六六六的影響HZ-Al的單菌落先在LB培養(yǎng)基中30°C擴(kuò)大培養(yǎng)16h，培養(yǎng)至OD6tltlnm值1. 5，培養(yǎng) 物。C、6000rpm離心5min，用無菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)液(成分如實(shí)施例1中所述)洗滌菌體沉 淀，配置成菌懸浮液，以10%的接種量(1. 5X105cfu/g)分別接入含有20mg/l Y-HCH的無 機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別將初始培養(yǎng)液的PH值分別調(diào)為5. O、5. 5、6. O、6. 5、7. O、7. 5、8. O、8. 5， 并以不接菌作為對照，每個樣品兩個平行。在30°C下、200rpm培養(yǎng)30h。用GC測定培養(yǎng)基 中六六六的濃度，計(jì)算降解率(方法同實(shí)施例1)，萃取方法和GC檢測條件如步驟一所述。結(jié)果如圖3所示，該菌株在pH6. 5 8. 5的范圍內(nèi)生長和降解效果均較好，其中在 PH7.0時的降解能力最強(qiáng)。2. 2溫度對菌株HZ-Al降解、-六六六的影響HZ-Al的單菌落先在LB培養(yǎng)基中30°C擴(kuò)大培養(yǎng)16h，培養(yǎng)至OD6tltlnm值1. 5，培養(yǎng)物 4°C、6000rpm離心5min，用無菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)液洗滌菌體沉淀，配置成菌懸浮液，以10%的 接種量(1.5X105cfU/g)分別接入7份含有20mg/l γ-HCH的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中(pH7. 0)，分 別將培養(yǎng)溫度分別調(diào)為15°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C，200rpm培養(yǎng)30h，并以不 接菌的培養(yǎng)基在與上述相同條件下放置作為對照，每個樣品兩個平行。用GC測定培養(yǎng)基中 六六六的濃度，計(jì)算降解率(方法同實(shí)施例1)，萃取方法和GC檢測條件如步驟一所述。結(jié)果如圖4所示，從圖4中可以看出，菌株在25 35°C時的降解效率都比較高，其 中在30°C時降解速度最快。2. 3菌株HZ-Al對不同濃度的Y -六六六的降解
HZ-Al的單菌落先在LB培養(yǎng)基中30°C擴(kuò)大培養(yǎng)16h，培養(yǎng)至OD6tltlnm值1. 5，培養(yǎng)物 4°C、6000rpm離心5min，用無菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)液(成分如實(shí)施例1中所述)洗滌菌體沉淀， 配置成菌懸浮液，以10%的接種量(1. 5X105cfu/g)分別接種于IOml含不同濃度(10，20， 50，80，120和15011^/1) Y -六六六的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在30°C下、200rpm培養(yǎng)7天。并以不 接菌作為對照，每個樣品兩個平行。用GC測定培養(yǎng)基中六六六的濃度，計(jì)算降解率(方法 同實(shí)施例1)萃取方法和GC檢測條件如步驟一所述。結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明，當(dāng)外加Y -六六六的濃度在10 50mg/l時，菌株可 以在一周內(nèi)將其完全降解。然面，當(dāng)外加Y-六六六的濃度超過80mg/l時，則表現(xiàn)出明顯 的底物抑制效應(yīng)，Y-六六六的降解速度明顯減慢。三、HZ-Al對六六六污染土壤的生物修復(fù)在校園中采集土壤樣品，樣品用直徑2mm的濾網(wǎng)過濾，除去土壤中的顆粒物質(zhì)。土 壤樣品存放于4°C冰箱。取一部分土壤樣品，用氯仿熏蒸法對土壤進(jìn)行消毒處理。先將氯 仿加入盛有土壤的容器中，密閉容器，使其散發(fā)為氣態(tài)，滲入土壤樣本以殺死所有微生物， 再開啟容器使土樣中殘余氣態(tài)氯仿全部散發(fā)。將Y-六六六加入到IOOg 土壤中，使其終濃 度為20mg/kg，攪拌混合均勻。將HZ-Al的細(xì)胞懸液以每g 土壤IO6個細(xì)胞接種量加入到 IOOg熏蒸和未熏蒸的土壤中，攪拌混合均勻。未接種HZ-Al的熏蒸和未熏蒸的土壤作為對 照。土壤置于30°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15d。在整個培養(yǎng)期間，不斷噴灑添加無菌的去離子水，以 保持土壤的含水量在50%附近。測定HZ-Al在土壤中是否對Y-HCH具有降解作用，同時研 究HZ-I在有額外的碳源存在下與土壤中其他微生物的相互關(guān)系，本研究中分別將HZ-I接 種到熏蒸土壤和未熏蒸土壤兩種處理中，未接種的熏蒸土壤和未接種的未熏蒸土壤作為對 照，每個對照和處理都重復(fù)三次。結(jié)果表明，在24天內(nèi)，兩種對照中的Y -HCH的濃度幾乎都沒有變化。從圖6中可 以看出，Y-HCH在經(jīng)熏蒸的土壤中的降解速率明顯比在未熏蒸土壤快，在熏蒸的土壤中18 天基本可以完全降解，而在未熏蒸土壤中需要24天。24天后HZ-Al能從未經(jīng)熏蒸的土壤中 分離出來，這說明在該土壤中的降解作用主要由HZ-Al完成。以上結(jié)果說明，HZ-Al菌株在施入土壤中后，沒有出現(xiàn)不產(chǎn)生降解或降解率急劇下 降的現(xiàn)象，它的降解性能仍然穩(wěn)定和優(yōu)良，這就為該菌株作為受六六六污染的土壤修復(fù)劑 提供了科學(xué)的試驗(yàn)依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)表明該菌對六六六污染的土壤有良好的修復(fù)能力，為該菌 的大規(guī)模應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
Sphingobium japonicum HZ-A1，其保藏登記號為CGMCC № 3539。
2.Sphingobium japonicum HZ-Al CGMCC Na 3539 在降解六六六中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述六六六為丙體六六六。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于所述降解六六六的方法是將所述 Sphingobium japonicum HZ-Al CGMCC Na 3539接種到含有六六六的體系中培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述培養(yǎng)的溫度為15-45°C，優(yōu)選為 30 "C。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于所述SphingobiumJaponicumHZ-Al CGMCC Na 3539的接種量為105cfu/g以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述Sphingobiumjaponicum HZ-AICGMCC Na 3539 的接種量為 105_106cfu/g。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種六六六降解菌及其在降解六六六中的應(yīng)用。該菌株為Sphingobium japonicum HZ-A1，其保藏登記號為CGMCC № 3539。本發(fā)明的菌株可以在12小時內(nèi)完全降解20ppm的林丹。該菌在30天內(nèi)可以降解土壤中20mg/kg的林丹，對污染的土壤中有良好的降解效果，具有應(yīng)用于田間修復(fù)六六六污染的土壤和水體的潛力。
文檔編號B09C1/10GK101805714SQ201010130739
公開日2010年8月18日 申請日期2010年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月22日
發(fā)明者喬傳令, 崔峰, 張衡, 江紅 申請人:中國科學(xué)院動物研究所