一種從臍帶外層羊膜組織中分離提取hUC-MSC的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的高效快速分離提取方法，特別是從新鮮臍帶外層羊膜組織中提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)是來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，具有高度自我更新和多向分化潛能，廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。目前已有研究表明，不同的培養(yǎng)方法可使MSC表現(xiàn)為神經(jīng)元表型、胰島樣細(xì)胞表型、內(nèi)皮細(xì)胞表型，或表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)記，從而揭示MSC在免疫抑制、內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)以及心血管功能改善中具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。因此MSC已逐漸成為細(xì)胞治療和基因治療領(lǐng)域中極具實(shí)用價(jià)值的細(xì)胞來(lái)源。特別是與其他來(lái)源的MSC相比，源于人臍帶的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human Umbilical Cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)具有生長(zhǎng)環(huán)境單一、采集方便、增殖分化能力強(qiáng)、免疫原性低、無(wú)倫理問(wèn)題等諸多優(yōu)點(diǎn)。
[0003]鑒于hUC-MSC的多向分化潛能以及在疾病治療領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的hUC-MSC的存儲(chǔ)業(yè)務(wù)具有廣闊的前景。但是，如何高效規(guī)范的保證干細(xì)胞的分離提取率以及保證干細(xì)胞優(yōu)質(zhì)，從而滿足未來(lái)干細(xì)胞移植的臨床需求，是目前國(guó)內(nèi)干細(xì)胞存儲(chǔ)業(yè)務(wù)的亟待解決的問(wèn)題。
[0004]目前hUC-MSC多采用酶消化法和組織貼壁法來(lái)制備。然而，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于h U C -M S C的分離和擴(kuò)增方法混亂，且大多步驟相當(dāng)復(fù)雜，使得快速提取大數(shù)量、高純度hUC-MSC仍存在一定困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)本領(lǐng)域的需要，提供一種能夠高效、快速地分離提取hUC-MSC的方法。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的hUC-MSC。
[0007]具體而言，因此，本發(fā)明針對(duì)目前國(guó)內(nèi)外人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取現(xiàn)狀，利用紅細(xì)胞裂解液處理對(duì)hUC-MSC原代生長(zhǎng)影響較大的紅細(xì)胞，同時(shí)利用膠原酶進(jìn)行消化來(lái)縮短原代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，從而實(shí)現(xiàn)快速高效地提取高純度hUC-MSC。并且，整個(gè)過(guò)程采用無(wú)血清培養(yǎng)體系，更有利于干細(xì)胞的未來(lái)臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案如下。
[0009]一方面，本發(fā)明提供了從新鮮臍帶離體外層羊膜組織中分離和提取間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其為一種分離培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，所述方法包括:采用紅細(xì)胞裂解液與膠原酶處理外層羊膜組織。
[0010]本發(fā)明采用的紅細(xì)胞裂解液為包含NH4C1和Na2-EDTA的水溶液，優(yōu)選為包含l-20g/L 的 NH4C1 和 0.05-0.2mM Na2-EDTA 的水溶液，更優(yōu)選為包含 5_10g/L 的 NH4C1 和0.lmmol/L Na2_EDTA的水溶液，pH為7.2-7.4。在使用之前，過(guò)0.22 μ m微濾膜，平衡至室溫。
[0011 ] 本發(fā)明采用的膠原酶為IV型膠原酶，優(yōu)選為包含IV型膠原酶的消化液，優(yōu)選為包含IV型膠原酶、透明質(zhì)酸酶、DNA酶和血清替代物的D-Hank’ s液，更優(yōu)選為包含1% IV型膠原酶、0.5%透明質(zhì)酸酶、300U/ml DNA酶和2%血清替代物的D-Hank’ s液。其中百分?jǐn)?shù)按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)。
[0012]本發(fā)明的方法具體包括:將獲得的臍帶外層羊膜組織分割成組織塊，加入1-3倍組織塊體積的所述紅細(xì)胞裂解液，在室溫下處理2-5分鐘；然后向經(jīng)處理的組織塊中加入包含IV型膠原酶的消化液再次處理。
[0013]優(yōu)選地，所述方法還包括:經(jīng)膠原酶消化后，采用間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，以獲得原代間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0014]間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基包含a-MEM/DMEM_F12、β -巰基乙醇、非必需氨基酸、重組人堿性成纖維生長(zhǎng)因子(b-FGF)和血清替代物。
[0015]優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基包含0.05-0.2體積份的β -巰基乙醇、
0.5-2體積份的非必需氨基酸水溶液、8-12體積份的血清替代物、85-95體積份的a_MEM/DMEM-F12和終濃度為5-15ng/ml的重組人堿性成纖維生長(zhǎng)因子，其中所述非必需氨基酸水溶液包含濃度各為8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天門酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和絲氨酸；更優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基包含0.1體積份的β-巰基乙醇、1體積份的非必需氨基酸水溶液、10體積份的血清替代物、89體積份的a-MEM/DMEM-F 12和終濃度為10ng/ml的重組人堿性成纖維生長(zhǎng)因子；最優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基由所述a-MEM/DMEM-F12、β -巰基乙醇、非必需氨基酸水溶液、重組人堿性成纖維生長(zhǎng)因子和血清替代物組成。
[0016]根據(jù)本申請(qǐng)的【具體實(shí)施方式】，所述非必需氨基酸水溶液可以采用Gibco公司貨號(hào)為11140的產(chǎn)品。
[0017]根據(jù)本申請(qǐng)的【具體實(shí)施方式】，所述血清替代物可以采用KnockOut? SerumReplacement (Gibco 公司產(chǎn)品，貨號(hào) 10828-010)。
[0018]優(yōu)選地，所述方法包括:將獲得的臍帶外層羊膜組織剪成1-3_3大小的組織塊，加入1.5-2倍組織塊體積的紅細(xì)胞裂解液，室溫下處理2-5分鐘；然后向經(jīng)處理的組織塊中加入2-3倍體積的包含IV型膠原酶的消化液，在37°C和5%濃度的C02下消化8_12小時(shí)；
[0019]優(yōu)選地，所述方法還包括:以1-5X104細(xì)胞/cm 2培養(yǎng)皿面積的密度將得到的細(xì)胞接種于間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基中，在37°C和5%濃度的C02下培養(yǎng)，每3-4天更換新鮮培養(yǎng)基。
[0020]優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟:
[0021](1)臍帶組織的預(yù)處理:
[0022]將新鮮臍帶分割成小段，去除血管淤血，縱向剖開(kāi)，剔除臍動(dòng)脈和臍靜脈，鈍性分離外層羊膜，加入PBS緩沖液清洗；
[0023](2)紅細(xì)胞裂解液處理:
[0024]將經(jīng)步驟(1)獲得的臍帶外層羊膜組織分割成組織塊，加入紅細(xì)胞裂解液處理，離心收集經(jīng)處理的組織塊，加入PBS緩沖液清洗；
[0025](3)膠原酶消化:
[0026]將經(jīng)步驟(2)獲得的組織塊中加入包含IV型膠原酶的消化液再次處理，然后加入PBS緩沖液稀釋，無(wú)菌篩過(guò)濾收集細(xì)胞；
[0027](4)原代培養(yǎng):
[0028]采用間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)經(jīng)步驟(3)獲得的細(xì)胞，以獲得原代間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0029]優(yōu)選地，所述方法還包括以下步驟:
[0030](5)上清液檢測(cè):
[0031]取步驟⑷中培養(yǎng)細(xì)胞的上清液，檢測(cè)以下項(xiàng)目中的一種或多種:甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人類免疫缺陷病毒、支原體、衣原體和內(nèi)毒素；
[0032](6)傳代培養(yǎng):
[0033]取步驟(5)中檢測(cè)項(xiàng)目為陰性的培養(yǎng)細(xì)胞，胰酶消化后離心收集細(xì)胞，傳代培養(yǎng)，收集細(xì)胞或繼續(xù)傳代；
[0034](7)細(xì)胞檢測(cè):
[0035]取步驟(6)中培養(yǎng)的細(xì)胞，檢測(cè)以下項(xiàng)目中的一種或多種:分化能力、細(xì)胞活性、細(xì)胞純度、細(xì)胞污染和增殖特性。
[0036]優(yōu)選地，所述步驟(1)包括:將新鮮臍帶分割成2-3cm長(zhǎng)的小段，去除血管中淤血，縱向剖開(kāi)，剔除臍動(dòng)脈和臍靜脈，鈍性分離外層羊膜，加入1.5-2倍體積的PBS緩沖液，輕微搖晃清洗；
[0037]優(yōu)選地，所述步驟⑵包括:
[0038]將經(jīng)清洗的臍帶外層羊膜組織剪成1-3_3大小的組織塊，加入1.5-2倍組織塊體積的紅細(xì)胞裂解液，室溫下處理2-5分鐘，離心收集組織塊，PBS緩沖液清洗2-3次；其中優(yōu)選地，所述離心為1000-1200rpm、4°C下離心6分鐘；
[0039]優(yōu)選地，所述步驟(3)包括:
[0040]向經(jīng)處理的外層羊膜組織塊中加入2-3倍體積的包含IV型膠原酶的消化液，在37°C和5%濃度的C02下消化8-12小時(shí)，然后加入PBS緩沖液稀釋后經(jīng)100目或200目無(wú)菌篩過(guò)濾，收集濾過(guò)液，PBS清洗離心；其中優(yōu)選地，所述離心為1000-1200rpm、4°C下離心6分鐘；
[0041 ] 優(yōu)選地，所述步驟(4)包括:
[0042]以1-5 X 104細(xì)胞/cm2培養(yǎng)皿面積的密度將經(jīng)步驟(3)獲得的細(xì)胞接種于間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基中，在37°C和5%濃度的C02下培養(yǎng)，每3-4天更換新鮮培養(yǎng)基；
[0043]優(yōu)選地，所述步驟(5)包括:
[0044]取步驟(4)中培養(yǎng)細(xì)胞的上清液，檢測(cè)以下項(xiàng)目中的全部:甲肝、乙肝、丙肝、梅毒、人類免疫缺陷病毒、支原體、衣原體和內(nèi)毒素；
[0045]優(yōu)選地，所述步驟(6)包括:
[0046]取步驟(5)中全部檢測(cè)項(xiàng)目為陰性的培養(yǎng)細(xì)胞，待貼壁細(xì)胞匯合率達(dá)3