本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鏈霉菌新菌種及其在消毒劑中的應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

消毒是指根據(jù)不同的生產(chǎn)環(huán)節(jié)、對象用適宜的方法清除或殺滅畜禽體表及其生存環(huán)境中的病原微生物及其它有害微生物。在目前集約化程度越來越高的趨勢下，養(yǎng)殖農(nóng)場疾病發(fā)病越來越復(fù)雜，動物疫病防治問題十分突出。規(guī)?；B(yǎng)殖場疫病的發(fā)生往往是多因素綜合作用的結(jié)果，但其中最主要的是由于外界環(huán)境中病原微生物的侵入及擴散或場內(nèi)動物本身病原微生物污染擴散造成的。有效的消毒是杜絕和降低養(yǎng)殖場環(huán)境中的病原體，切斷疫病傳播途徑，預(yù)防和控制養(yǎng)殖場傳染病的重要措施之一。但是使用現(xiàn)有的消毒劑往往在消毒后還有殘留的耐藥致病菌，使用效果不理想，不能有效防治某些規(guī)模化養(yǎng)殖場疫病，如奶牛隱性乳房炎等反復(fù)發(fā)作，難以治愈，成為畜牧養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的痼疾。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，生物被膜是導(dǎo)致這些致病菌難以根除的主要原因，以生物被膜形式存在的細菌不同于浮游細菌，它們對抗生素等殺菌劑、惡劣環(huán)境及宿主免疫防御機制有很強的抗性，生物被膜內(nèi)的細菌在生理、代謝、對底物的降解或利用和對環(huán)境的抵抗能力等方面都具有獨特的性質(zhì)，以現(xiàn)有的消毒劑來對這些致病菌進行消除是很難達到理想的消毒效果的，而含有生物膜抑制劑的消毒劑可以很好地解決這一問題，大幅度提升消毒效果，利用微生物生產(chǎn)的生物膜抑制劑是其中一類，一些放線菌能夠產(chǎn)生抑制細菌生物膜形成的活性物質(zhì)，如吲哚、蛋白酶類等，與傳統(tǒng)抗生素作用機制完全不同的是，這些活性物質(zhì)在不影響病原菌生長的前提下，通過干擾病原菌生物膜形成相關(guān)基因表達來實現(xiàn)抑制作用。與傳統(tǒng)的抗菌消毒劑相比，新型生物膜抑制活性物質(zhì)在一定程度上能夠緩解細菌耐藥性問題。因此，細菌生物膜形成抑制劑作為新型消毒劑成分，在預(yù)防微生物尤其生物膜感染領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，但目前關(guān)于微生物生物膜抑制劑用于消毒劑的報道很少，因此需要進一步探究微生物的生物膜抑制作用，為微生物生物膜抑制提供具有生物膜形成抑制作用且性能穩(wěn)定的抗性菌株，將在消毒劑領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用開發(fā)前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中未見有關(guān)本發(fā)明中的鏈霉菌新菌種及在消毒劑中的應(yīng)用的相關(guān)報道，且現(xiàn)有的消毒劑在消毒后還有殘留的耐藥致病菌，使用效果不理想，不能有效防治規(guī)?；B(yǎng)殖場疫病的現(xiàn)狀，本發(fā)明旨在為消毒劑中提供具有生物膜形成抑制作用且性能穩(wěn)定的抗性新的菌株。本發(fā)明通過在土壤樣品中分離篩選出一株鏈霉菌新菌種，且具有產(chǎn)生物酶能力較高從而其發(fā)酵液有顯著的生物膜抑制作用。通過提供一種鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260，以及該菌的發(fā)酵液在消毒劑中的應(yīng)用技術(shù)方案。

本發(fā)明采用的主要技術(shù)方案：

本發(fā)明采用的土壤樣品由塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院采自新疆硝爾庫勒湖，將采集的土壤樣品經(jīng)大量篩選、優(yōu)選出一批生長良好的鏈霉菌菌株，進行16srrna基因序列的測定，從中篩選出一株抑制生物膜形成能力較強的鏈霉菌的新菌種(streptomycessalilacus)。

本發(fā)明具體提供一種鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260，通過提供確定的的篩選方法，在采集的土壤樣品中分離篩選和培養(yǎng)，獲得一批鏈霉菌微生物菌株，從中篩選出一株抑制生物膜形成能力較強的鏈霉菌菌株trm20170601，經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定，屬于鏈霉菌(streptomycessalilacus)中新的菌株，暫命名為streptomycessalilacustrm20170601。

具體的，本發(fā)明通過對采集土壤樣品進行分離、篩選和培養(yǎng)，從中篩選出一株編號為trm20170601的菌株，經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定，該菌株屬于鏈霉菌(streptomycessalilacus)菌株。該菌株已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)。地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。保藏日期2017年6月21日，菌種保藏號為cgmccno.14260。經(jīng)微生物學(xué)鑒定為鏈霉菌(streptomycessalilacus)，經(jīng)過系統(tǒng)分類確定該菌種trm20170601規(guī)范名稱為鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)。該菌株最適生長條件為：溫度28℃，培養(yǎng)基采用高氏一號培養(yǎng)基(甘露醇10g、七水硫酸鎂1g、碳酸鈣0.2g、丙氨酸1g、磷酸氫二鉀1g、七水硫酸亞鐵0.01g、氯化鈉15g、重鉻酸鉀50mg、瓊脂粉18g、水1l、微量鹽1ml(0.001g/l)、復(fù)合維生素1ml(0.5mg/l)、ph7.2～7.4)，培養(yǎng)時間4d；經(jīng)4d培養(yǎng)后，在高氏一號培養(yǎng)基表面，菌落呈圓形、邊緣整齊、凸起、光滑、白色、不透明、黏稠不易挑起；該菌為革蘭陽性菌、好氧、菌體桿狀、無鞭毛、有內(nèi)生孢子形成。根據(jù)以上形態(tài)特征，參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)鑒定手冊》第八版和《常用細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對trm20170601菌株進行形態(tài)學(xué)，生理生化鑒定，并結(jié)合分子生物學(xué)測序，初步鑒定該菌株為鏈霉菌(streptomycessalilacus)的成員，但該菌種具有新菌種鮮明特征，從其分類學(xué)角度，暫命名為鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601。

同時，本發(fā)明通過提取菌株trm20170601的總dna，采用細菌16srdnapcr擴增通用引物，進行pcr擴增，pcr產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后測序。將所測16srrna基因序列與genbank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，結(jié)果表明：菌株trm20170601與模式菌株streptomycesmacrosporusnbrc14748^t(ab184616)最大同源為98.0％，與同屬其它菌株同源性均小于97.0％，尚不能確定其確切分類，確定為一株新菌種，從其分類學(xué)角度暫命名為streptomycessalilacus。

進一步，本發(fā)明提供一種鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發(fā)酵液在消毒劑中的應(yīng)用。通過研究在不同ph值、溫度、有機試劑處理條件下鏈霉菌(streptomycessalilacus)發(fā)酵液對抑制生物膜形成的影響，得到菌種trm20170601對生物膜形成的最佳抑制條件是ph值11，溫度60℃，經(jīng)乙醚處理。

通過實施本發(fā)明具體技術(shù)指標，實現(xiàn)本發(fā)明內(nèi)容，可以達到以下有益效果：

(1)本發(fā)明提供的鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260，具有培養(yǎng)條件簡單，繁殖快，遺傳特性穩(wěn)定，抑制生物膜形成能力較強的優(yōu)點。

(2)本發(fā)明提供的鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發(fā)酵液在消毒劑中應(yīng)用時，在ph值11，溫度60℃，經(jīng)乙醚處理的條件下，抑制生物膜形成的能力最強，可以使表皮葡萄球菌相對生物膜形成能力低至10.94％，并且在殺菌試驗時作用5min后對菌懸液內(nèi)表皮葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌平均殺滅對數(shù)值均＞5.00。

附圖說明

圖1所示為所示為鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260的菌落和菌體照片。

圖2所示為所示為鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖。

圖3所示為溫度對鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發(fā)酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影響。

圖4所示為ph值對鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發(fā)酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影響。

圖5所示為有機試劑處理對鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發(fā)酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影響。

具體實施方式

下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。本發(fā)明中選用的所有原輔材料(除表皮葡萄球菌atcc35984(生物膜形成陽性菌株)外，其由上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院贈送)，以及選用的菌種培養(yǎng)方法都為本領(lǐng)域熟知選用的，本發(fā)明中涉及到的％都為重量百分比，除非特別指出除外。

實施例一：鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260的分離、篩選及鑒定

1、菌種的分離和篩選

本發(fā)明所使用的鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601本發(fā)明土壤樣品由塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院采自新疆硝爾庫勒湖，將采集的土壤樣品經(jīng)大量篩選、優(yōu)選出一批生長良好的鏈霉菌菌株，進行16srrna基因序列的測定，從中篩選出一株編號為trm20170601的菌株。

分離步驟：

采用微生物分離的梯度稀釋法得到一系列的梯度稀釋液，用滅菌吸管分別吸取i0^-1-10^-3稀釋度的混合菌稀釋液0.lml，分別移放到倒有高氏一號培養(yǎng)基的平板上，用無菌玻璃棒涂布均勻，然后倒置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長出單菌落，在無菌操作臺中以無菌接種環(huán)挑取平板上長出的單菌落接種到裝有高氏一號培養(yǎng)基的平板上劃線分離待長出單菌落后，再次轉(zhuǎn)入滅菌試管斜面上，每株菌每次做三個重復(fù)，置于28℃條件下培養(yǎng)3-5天。利用透過光、反射光及暗背景的光線觀察菌落的一致性，涂片染色用光學(xué)顯微鏡觀察菌體的一致性，經(jīng)多次反復(fù)分離純化直到菌落及個體均勻一致后備用。

2、菌株的培養(yǎng)條件

(1)編號為trm20170601的菌株的生長培養(yǎng)基為高氏一號培養(yǎng)基：甘露醇10g、七水硫酸鎂1g、碳酸鈣0.2g、丙氨酸1g、磷酸氫二鉀1g、七水硫酸亞鐵0.01g、氯化鈉15g、重鉻酸鉀50mg、瓊脂粉18g、水1l、微量鹽1ml(0.001g/l)、復(fù)合維生素1ml(0.5mg/l)、ph7.2～7.4。

(2)編號為trm20170601的菌株在25-50℃條件下均能生長，最適生長溫度為28℃，培養(yǎng)時間為3-5d。

(3)編號為trm20170601的菌株最適生長ph7。

具體的，本發(fā)明通過對采集土壤樣品進行分離、篩選和培養(yǎng)，從中篩選出一株編號為trm20170601的菌株，經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定，該菌株屬于鏈霉菌(streptomycessalilacus)菌株。該菌株已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)。地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。保藏日期2017年6月21日，菌種保藏號為cgmccno.14260。經(jīng)微生物學(xué)鑒定為鏈霉菌的新菌種，從其分類學(xué)角度暫定分類為鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601。該菌株最適生長條件為：溫度28℃，培養(yǎng)基采用高氏一號培養(yǎng)基(甘露醇10g、七水硫酸鎂1g、碳酸鈣0.2g、丙氨酸1g、磷酸氫二鉀1g、七水硫酸亞鐵0.01g、氯化鈉15g、重鉻酸鉀50mg、瓊脂粉18g、水1l、微量鹽1ml(0.001g/l)、復(fù)合維生素1ml(0.5mg/l)、ph7.2～7.4)，培養(yǎng)時間4d。

3、菌株trm20170601的生理生化鑒定

形態(tài)特征：trm20170601經(jīng)4d培養(yǎng)后，在高氏一號培養(yǎng)基表面，菌落呈圓形、邊緣整齊、凸起、光滑、白色、不透明、黏稠不易挑起；該菌為革蘭陽性菌、好氧、菌體桿狀、無鞭毛、有內(nèi)生孢子形成，其菌落和菌體形態(tài)參見附圖1。

生理生化特征：biologgn2板檢測該菌可利用的碳源為：l-巖藻糖、葡萄糖和d-果糖。

通過上述菌種鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260的菌體形態(tài)、培養(yǎng)特征觀察及生理生化指標測定，即通過菌體形態(tài)觀察、菌株培養(yǎng)特征觀察、生長溫度測定等試驗，參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)鑒定手冊》第八版和《常用細菌系統(tǒng)鑒定手冊》的方法進行，編號為trm20170601的菌種與常見的鏈霉菌菌種相比，具有明顯的生理生化特性差異，且抑制生物膜形成能力更強，表明trm20170601菌株是一種典型的新菌種，從其分類學(xué)角度，該菌株歸屬鏈霉菌(streptomycessalilacus)的成員，暫命名為鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601。

實施例二：鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260分子水平鑒定

提取菌株trm20170601的總dna，采用采用細菌16srdnapcr擴增通用引物，進行pcr擴增，pcr產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后測序。菌株trm20170601的全基因序列參見附后提供的sequencelisting，將實驗菌株的所得序列與genbank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行blast比較，確定與實驗菌株親緣關(guān)系最近的種屬關(guān)系。并結(jié)合eztaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)中序列比對并調(diào)取相關(guān)模式菌株序列，以進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析標準模式菌序列，利用mega5.0軟件包采用鄰接法(neighbor-joiningmethod)進行聚類分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。由系統(tǒng)進化樹可示，菌株trm20170601與模式菌株streptomycesmacrosporusnbrc14748^t(ab184616)最大同源為98.0％，系統(tǒng)進化樹參見附圖2，編號為trm20170601的菌種與其常見的鏈霉菌(streptomycessalilacus)成員菌具有鮮明的區(qū)別，具有明顯的分子水平差異性，確定為鏈霉菌為典型的新菌種，從其分類學(xué)角度，該菌株歸屬(streptomycessalilacus)的成員，暫命名為streptomycessalilacus。

實施例三：鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發(fā)酵液的制備

(1)菌株的活化：將保存在甘油管中的菌株接種到高氏一號培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)5d。

(2)種子液的制備：將活化好的菌株從高氏一號固體平板上挑取單菌落轉(zhuǎn)接到裝有150ml液體高氏培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，恒溫搖床28℃，185r/min培養(yǎng)5-7d。

(3)初始發(fā)酵培養(yǎng)條件：將種子液按4％的接種量接種到液體高氏一號培養(yǎng)基中，恒溫搖床28℃，185r/min培養(yǎng)15d。

實施例四：不同ph值、溫度、有機試劑處理條件下鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)發(fā)酵液對抑制生物膜形成的影響

1、試驗方法

將菌液按1:100比例稀釋，發(fā)酵液經(jīng)無菌濾膜過濾，將處理后的發(fā)酵液按不同濃度(10％～50％)與菌液進行混合，混合后吸取20μl至96孔板，每個梯度4孔，恒溫培養(yǎng)箱37℃靜置培養(yǎng)24h，測od590(需要核實是od590還是od590，下同)，流水緩慢洗板3次，以洗去未黏附細菌。放入烘箱，56℃，烘干1h，用0.5％結(jié)晶紫染色5min，流水沖洗，洗去多余的結(jié)晶紫染液，自然晾干，測od490。

相對生物膜形成能力＝(處理組od490/空白od490)×100。

2.不同溫度對鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發(fā)酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影響

把溫度為-20℃設(shè)為未處理組，處理組溫度分別為：30℃、40℃、60℃、80℃、100℃將發(fā)酵液用不同溫度水浴處理30min后，結(jié)果如附圖3所示，當(dāng)?shù)鞍诇囟葹?20℃時相對生物膜形成能力為51.36％；溫度為30℃時相對生物膜形成能力為52.02％；溫度為40℃時相對生物膜形成能力為49.88％；溫度為60℃時相對生物膜形成能力為37.89％；溫度為80℃時相對生物膜形成能力為54.68％；溫度為100℃時相對生物膜形成能力為59.04％；溫度為60℃時發(fā)酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力最強。

3.不同ph值對鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發(fā)酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影響

以ph值為7為未處理組，分別將發(fā)酵液調(diào)至不同ph值，測其對表皮葡萄球菌atcc35984相對生物膜形成能力的影響，結(jié)果如附圖4所示，當(dāng)?shù)鞍椎膒h值為3時相對生物膜形成能力為27.47％；ph值為5時相對生物膜形成能力為30.24％；ph值為7時相對生物膜形成能力為38.54％；ph值為9時相對生物膜形成能力為25.74％；ph值為11時相對生物膜形成能力為10.94％；當(dāng)ph值為11時相對生物膜形成能力最弱，其生物膜抑制率最高。

4.不同有機試劑對鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發(fā)酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影響

把未加有機試劑只加了發(fā)酵液的設(shè)為未處理組，以丙酮、氯仿、乙酸乙酯、乙醚設(shè)為處理組，結(jié)果如附圖4所示，經(jīng)丙酮處理的其相對生物膜形成能力為14.47％；經(jīng)氯仿處理的其相對生物膜形成能力為38.4％；經(jīng)乙酸乙酯處理的其相對生物膜形成能力為11.21％；經(jīng)乙醚處理的其相對生物膜形成能力為10.98％；未經(jīng)有機試劑處理的其相對生物膜形成能力為45.27％；通過以上實驗表明發(fā)酵液經(jīng)乙醚處理后生物膜形成能力最弱，發(fā)酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜活性最強。

實施例五：基于鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發(fā)酵液制備的消毒劑對不同細菌殺滅效果

用無菌標準硬水將基于鹽湖鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發(fā)酵液制備的消毒劑稀釋成試驗濃度2倍的消毒劑，將消毒液于60℃±1℃水浴中恒溫10min。在無菌試管內(nèi)加入1.0ml菌懸液與4.0ml消毒液(陽性對照組為稀釋液)混合，作用至預(yù)定時間。取1ml菌藥混合液，加于裝有10ml中和劑的試管中，混勻，中和作用15min。經(jīng)充分混合，吸取1.0ml樣液作傾注接種培養(yǎng)，進行活菌計數(shù)，計算殺滅對數(shù)值。試驗重復(fù)2次，結(jié)果如表1所示。

表1：基于新菌種發(fā)酵液制備的消毒劑對不同細菌殺滅效果

基于鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發(fā)酵液制備的消毒劑稀釋液作用5min，對菌懸液內(nèi)表皮葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌平均殺滅對數(shù)值均＞5.00；對白色念珠菌作用5min，平均殺滅對數(shù)值為3.57。

以上實驗可知，將本發(fā)明提供的鏈霉菌(streptomycessalilacus)trm20170601cgmccno.14260發(fā)酵液研制成消毒劑，在ph值11，溫度60℃，經(jīng)乙醚處理的條件下，抑制生物膜形成的能力最強，可以使表皮葡萄球菌相對生物膜形成能力低至10.94％，并且在殺菌試驗時作用5min后對菌懸液內(nèi)表皮葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌平均殺滅對數(shù)值均＞5.00，該菌種具有培養(yǎng)條件簡單，繁殖快，遺傳特性穩(wěn)定，抑制生物膜形成能力較強的優(yōu)點，獲得顯著突出的技術(shù)效果。

上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所延伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。

sequencelisting

<110>塔里木大學(xué)

<120>鹽湖鏈霉菌trm20170601及在消毒劑中的應(yīng)用

<130>trm20170601

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1498

<212>dna

<213>trm20170601

<220>

<221>trm20170601

<222>(1)..(1498)

<400>1

gagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacg60

atgaacctccttcgggaggggattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgc120

cctgcactctgggataactccgggaaaccggagctaataccggataggaccgcctcgggc180

atccggggtggtggaaagctccggcggtgcaggatgagctcgcggcctatcagctggttg240

gtggggtgatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccac300

actgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaa360

tgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacc420

tctttcagcagggaagaagcggaagtgacggtacctgcagaagaagcaccggctaactac480

gtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttgtccggaattattgggcgtaaa540

gagctcgtaggcggcttgtcgcgtcggatgtgaaagcccggggcttaaccccgggtcggc600

attcgatacgggcaggctagagttcggtaggggagatcggaattcctggtgtagcggtga660

aatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatctctggaccgatactgac720

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