專利名稱：女貞苷、金絲桃苷組合物及其制備藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種女貞苷、金絲桃苷組合物及其制備藥物用途。
背景技術(shù)：
目前流行性感冒病毒日益嚴(yán)重，并且流行性感冒病毒與呼吸道疾病及引起的全身 性疾病密切相關(guān)，我國是流感高發(fā)國家之一，不但人口眾多，而且生活習(xí)慣也有利于流感病 毒的轉(zhuǎn)播，每年人平均發(fā)病次數(shù)達(dá)到0. 3 0. 7次不等，重點(diǎn)人群達(dá)到2 4次。流感對人 類存在嚴(yán)重威脅，尤其是新發(fā)品種流感病毒，其不但引起繼發(fā)性其它微生物感染，而且會直 接導(dǎo)致器官破壞和變態(tài)反應(yīng)致人死亡。但目前并沒有有效的治療流行性感冒病毒及其疾病 (流感)的方法和治療手段，如針對臨床癥狀進(jìn)行炎癥反應(yīng)治療，治標(biāo)不治本。目前最常見 的預(yù)防和治療流行性感冒病毒的方法是使用流感病毒疫苗接種，非特異性抗病毒中藥或西 藥磷酸奧司他韋(達(dá)菲)_神經(jīng)氨酸酶抑制劑。然而流感病毒疫苗預(yù)防接種弊端在于接種 人群有選擇性，不是人人可以接種。此外，流感病毒疫苗保護(hù)率不高，保護(hù)時間也較短(3 6個月)。目前大多數(shù)非特異性抗病毒中藥雖然宣稱有抗病毒作用，但是并非針對流感病 毒，且抗病毒作用機(jī)理不清楚。在我們以往研究的許多種治療外感風(fēng)寒，西醫(yī)所認(rèn)為的感冒 的中藥組方并沒有直接抗流感病毒的作用。簡單的說，不是所有的治療感冒的中藥組方都 有明確的抑制流感病毒的作用。西藥“磷酸奧司他韋(達(dá)菲，(3R，4R，5S)-4-乙酰胺-5-氨 基-3(1-丙氧乙酯)-1_環(huán)己烯-1羧酸乙酯磷酸鹽)”是神經(jīng)氨酸酶抑制劑，對流感病毒進(jìn) 入細(xì)胞有特異性抑制作用，但是不僅價格昂貴，而且有一些患者服用后出現(xiàn)嘔吐、惡心、失 眠、頭痛、腹痛、腹瀉、頭暈、疲勞、鼻塞、咽痛和咳嗽等副反應(yīng)。達(dá)菲是在體內(nèi)被位于肝臟和 腸道的酯酶轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物而起著抑制神經(jīng)氨酸酶作用，如果患者肝臟和腸道器官功 能不正常也將影響其藥效。此外，腎功能不全患者也要慎用。傳統(tǒng)的中醫(yī)學(xué)認(rèn)山香圓葉具有清熱解毒，利咽消腫，活血止痛。用于乳蛾喉痹，咽 喉腫痛，瘡瘍腫毒，跌撲傷痛。女貞苷和金絲桃苷是山香圓葉的主要成分之一。女貞子功 能為滋補(bǔ)肝腎，明目烏發(fā)。主要用于眩暈耳鳴，腰膝酸軟，須發(fā)早白，目暗不明，近年來多用 于治療慢性氣管炎、肝炎、高血脂癥、糖尿病、更年期綜合征、不孕癥、動脈粥樣硬化等，女貞 苷是女貞子的主要成分之一。貫葉金絲桃具有舒肝解郁，清熱利濕，消腫止痛。用于情志不 暢，氣滯郁悶，關(guān)節(jié)腫痛，小便不利。金絲桃苷是貫葉金絲桃的主要成分之一，金絲桃苷對心 肌缺血再灌注，腦缺血再灌注，腦梗塞都顯示良好的保護(hù)作用，還具有鎮(zhèn)痛，抗氧化，保護(hù)心 肌、肝臟作用。并未發(fā)現(xiàn)山香圓葉及其所含的女貞苷和金絲桃苷、女貞子及其所含的女貞 苷、貫葉金絲桃及其所含的金絲桃苷具有抑制流感病毒感染、復(fù)制的作用，也未發(fā)現(xiàn)其具有 抑制神經(jīng)氨酸酶的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供女貞苷、金絲桃苷組合物，其可以抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶 水解細(xì)胞表面唾液酸，導(dǎo)致流感病毒不能與細(xì)胞表面受體結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，以及減少流感病毒在細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)生，從而有效地針對性地抑制流感病毒復(fù)制，更重要地是本發(fā)明提供 一種女貞苷、金絲桃苷組合物可以克服現(xiàn)有藥物的副反應(yīng)弊端。本發(fā)明提供的女貞苷、金絲桃苷組合物，所述女貞苷的分子式=C33H4tlO18,分子量 724. 2，所述女貞苷的結(jié)構(gòu)式如下 所述金絲桃苷的分子式=C21H2tlO12,分子量464. 38，所述金絲桃苷的結(jié)構(gòu)式如下 其中所述的女貞苷、金絲桃苷組合物是由下列重量配比制成的女貞苷80% 20%、金絲桃苷20% 80%。優(yōu)選的，其中所述的女貞苷、金絲桃苷組合物是由下列重量配比制成的女貞苷 75% 25%、金絲桃苷25% 75%。優(yōu)選的，其中所述的女貞苷、金絲桃苷組合物是由下列重量配比制成的女貞苷 60 % 40 %、金絲桃苷40 % 60 %。優(yōu)選的，其中所述的女貞苷、金絲桃苷組合物是由下列重量配比制成的女貞苷 55 % 45 %、金絲桃苷45 % 55 %。優(yōu)選的，其中所述的女貞苷、金絲桃苷組合物是由下列重量配比制成的女貞苷 50%、金絲桃苷50%。另一方面，本發(fā)明還提供了女貞苷、金絲桃苷組合物的提取方法，其中所述的女貞 苷、金絲桃苷是從山香圓葉中提取獲得的，所述提取方法如下取山香圓葉，加5 15倍量 的30% 90%乙醇回流提取1 3次，每次回流提取1 3小時，濾過；合并濾液，回收乙 醇，水溶液通過大孔樹脂柱洗脫，收集洗脫部分，減壓濃縮，干燥，得女貞苷、金絲桃苷的混 合總苷，經(jīng)分離，分別合并女貞苷、金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到女貞苷、金絲桃苷純品。
優(yōu)選的，其中所述的女貞苷、金絲桃苷采用如下的提取方法獲得取山香圓葉，加 12倍量70%乙醇回流提取1. 5小時，濾過，濾渣再加10倍量70 %乙醇回流提取1. 5小時， 濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱洗脫，收集洗脫部分，減壓濃縮，干燥。優(yōu)選的，其中水溶液通過已處理好的DlOl大孔樹脂柱，分別用水、5% 10%乙 醇、30 % 55 %乙醇、1 %氫氧化鈉溶液洗脫，收集30 % 55 %乙醇洗脫部分，減壓濃縮，干 燥，得女貞苷、金絲桃苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層析、Si^phadex LH-20柱層析分離，分別合并 女貞苷、金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到女貞苷純品和金絲桃苷的純品。本發(fā)明的另一目的是提供了女貞苷、金絲桃苷組合物制備預(yù)防和治療流感及其并 發(fā)癥疾病的藥物的用途。優(yōu)選的，女貞苷、金絲桃苷組合物用于抑制流感病毒。優(yōu)選的，女貞苷、金絲桃苷組合物用于抑制流感病毒FMl。優(yōu)選的，女貞苷、金絲桃苷組合物用于抑制神經(jīng)氨酸酶。優(yōu)選的，其并發(fā)癥是指腎功能衰竭。優(yōu)選的，其并發(fā)癥是指脾損傷或/和肺損傷。本發(fā)明所述的女貞苷、金絲桃苷可以是從含女貞苷、金絲桃苷的各種藥材中如山 香圓葉、女貞子、貫葉金絲桃中提取獲得女貞苷、金絲桃苷粗品或女貞苷、金絲桃苷單體化 合物。最后，本發(fā)明還提供了一種女貞苷、金絲桃苷組合物制劑，該制劑以本發(fā)明上述的 女貞苷、金絲桃苷組合物為主要活性成分。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，本發(fā)明的女貞苷、金絲桃苷組合物是有效的抑制神經(jīng)氨酸酶成分， 女貞苷、金絲桃苷組合物隨著使用劑量大小變化，其抑制神經(jīng)氨酸酶活性的能力，即神經(jīng)氨 酸酶抑制率的高低也相應(yīng)發(fā)生變化，并且成正相關(guān)，女貞苷、金絲桃苷組合物能夠通過抑制 流感病毒表面神經(jīng)氨酸酶，進(jìn)而抑制流感病毒進(jìn)入細(xì)胞里面、抑制已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞里面的流 感病毒復(fù)制、增殖，從而減少了流感病毒對細(xì)胞的感染、生長，以及預(yù)防和治療流感及其并 發(fā)癥，還可以抑制流感病毒神經(jīng)氨酸酶水解細(xì)胞表面唾液酸，導(dǎo)致流感病毒不能與細(xì)胞表 面受體結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，以及減少流感病毒在細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)生，更重要地是本發(fā)明提供一 種女貞苷、金絲桃苷組合物可以克服現(xiàn)有藥物的副反應(yīng)弊端。而醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究人員無法預(yù)先在不做抑制流感病毒感染、復(fù)制，或抑制神經(jīng)氨 酸酶的實(shí)驗(yàn)的前提下，預(yù)先得知女貞苷、金絲桃苷組合物具有預(yù)防和治療流感病毒性感冒 的良好效果。綜上所述，本發(fā)明提供的女貞苷、金絲桃苷組合物及其用途帶來顯著的技術(shù)效果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明提供的所述女貞苷的分子式=C33H4tlO18,分子量724. 2，所述女貞苷的結(jié)構(gòu)
式如下
6 本發(fā)明提供的所述金絲桃苷的分子式=C21H2tlO12,分子量464. 38，所述金絲桃苷的
結(jié)構(gòu)式如下 其中所述的女貞苷、金絲桃苷是從山香圓葉中提取獲得的，所述提取方法如下取 山香園葉lOOOOOg，加12倍量70%乙醇回流提取1. 5小時，濾過，濾渣再加10倍量70%乙醇 回流提取1. 5小時，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過已處理好的DlOl大孔樹 脂柱，分別用水、10%乙醇、45%乙醇、1 %氫氧化鈉溶液洗脫，收集45%乙醇洗脫部分，減壓 濃縮，干燥，得30%以上女貞苷、金絲桃苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層析、S^hadex LH-20柱層 析分離，分別合并女貞苷、金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到女貞苷(320g，純度98.8% )和金絲桃 苷(65g，純度98.6% )純品，經(jīng)分別與女貞苷、金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品的UV、IR, ESI-MS^iH-NMR, 13C-NMR比較，確定了上述二個化合物的結(jié)構(gòu)。另外，本發(fā)明提供的女貞苷、金絲桃苷也可以分別提取獲得，如以下列舉的實(shí)施 例。實(shí)施例2取女貞子1000g，W 12倍量70%乙醇回流提取1. 5小時，濾過，濾渣再加10倍 量70%乙醇回流提取1. 5小時，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過已處理好的 DlOl大孔樹脂柱，分別用水、10 %乙醇、45 %乙醇、1 %氫氧化鈉溶液洗脫，收集45%乙醇洗 脫部分，減壓濃縮，干燥，得30%以上女貞苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層析、S^hadex LH-20柱 層析分離，合并女貞苷流份，結(jié)晶，得到女貞苷(18. 5g，純度98.7% )純品，經(jīng)分別與女貞 苷標(biāo)準(zhǔn)品的UV、IR、ESI-MS^H-WRJ3C-WR比較，確定了女貞苷的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例3取貫葉金絲桃lOOOg，加12倍量70%乙醇回流提取1. 5小時，濾過，濾渣再加10倍量70%乙醇回流提取1. 5小時，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過已處理好的 D101大孔樹脂柱，分別用水、10 %乙醇、45 %乙醇、1 %氫氧化鈉溶液洗脫，收集45 %乙醇洗 脫部分，減壓濃縮，干燥，得30%以上金絲桃苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層析、S^hadex LH-20 柱層析分離，合并金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到金絲桃苷(8. 5g，純度98. 6% )純品，經(jīng)分別與 金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品的UV、IR, ESI-MS, 1H-NMR, 13C-NMR比較，確定了金絲桃苷的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例4取女貞子lOOOg，加10倍量65%乙醇回流提取2小時，濾過，濾渣再加8倍量65% 乙醇回流提取1. 5小時，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過已處理好的DlOl大 孔樹脂柱，分別用水、8 %乙醇、40 %乙醇、1 %氫氧化鈉溶液洗脫，收集40 %乙醇洗脫部分， 減壓濃縮，干燥，得30%以上女貞苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析分 離，合并女貞苷流份，結(jié)晶，得到女貞苷(19. 2g，純度98.6% )純品，經(jīng)分別與女貞苷標(biāo)準(zhǔn) 品的uv、IR、ESI-MSJH-WRJ3C-WR比較，確定了女貞苷的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例5取貫葉金絲桃lOOOg，加15倍量60%乙醇回流提取2小時，濾過，濾渣再加9倍量 60%乙醇回流提取2小時，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過已處理好的DlOl 大孔樹脂柱，分別用水、8%乙醇、40%乙醇、氫氧化鈉溶液洗脫，收集40%乙醇洗脫部 分，減壓濃縮，干燥，得30%以上金絲桃苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層析、S^hadex LH-20柱層 析分離，合并金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到金絲桃苷(9. 2g，純度98. 5% )純品，經(jīng)分別與金絲 桃苷標(biāo)準(zhǔn)品的UV、IR, ESI-MS^iH-NMR, 13C-NMR比較，確定了金絲桃苷的結(jié)構(gòu)。實(shí)施例6按實(shí)施例1的提取方法將女貞苷(14g)與金絲桃苷(6g)以7 3的比例混合，攪 拌、研磨、混合均勻后得女貞苷、金絲桃苷組合物。實(shí)施例7按實(shí)施例1的提取方法，將提取的女貞苷(IOg)與金絲桃苷(IOg)以5 5的比 例混合，攪拌、研磨、混合均勻后得女貞苷、金絲桃苷組合物。實(shí)施例8按實(shí)施例1的提取方法，將提取的女貞苷(6g)與金絲桃苷(14g)以3 7的比例 混合，攪拌、研磨、混合均勻后得女貞苷、金絲桃苷組合物。實(shí)施例9按實(shí)施例1的提取方法，將提取的女貞苷(8g)與金絲桃苷(12g)以4 6的比例 混合，攪拌、研磨、混合均勻后得女貞苷、金絲桃苷組合物。實(shí)施例10按實(shí)施例1的提取方法，將提取的女貞苷(12g)與金絲桃苷(8g)以6 4的比例 混合，攪拌、研磨、混合均勻后得女貞苷、金絲桃苷組合物。下面結(jié)合表1給出本發(fā)明女貞苷與金絲桃苷質(zhì)量百分比的一些優(yōu)選實(shí)施例，但本 發(fā)明二者的組成成份的含量不局限于該表中所列數(shù)值，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，完全 可以在表中所列數(shù)值范圍的基礎(chǔ)上進(jìn)行合理概括和推理。表1 女貞苷、金絲桃苷占組合物 重量百分比(％ ) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)1 女貞苷、金絲桃苷組合物對神經(jīng)氨酸酶活性的抑制作用取實(shí)施例6制備方法所獲得的女貞苷、金絲桃苷組合物，加適量水使溶解，應(yīng)用神 經(jīng)氨酸酶抑制劑鑒定試劑盒測定女貞苷、金絲桃苷組合物抑制神經(jīng)氨酸酶(Ni)的效價見 表2。(1).標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)備a.在96孔熒光酶標(biāo)板內(nèi)每孔加入70 μ 1神經(jīng)氨酸酶檢測緩 沖液；b.每孔再分別加入0、1、2、5、7. 5、10μ 1 H5m神經(jīng)氨酸酶；c.每孔再加入0 20 μ 1 Milli-Q 水。(2).樣品檢測的準(zhǔn)備a.在96孔熒光酶標(biāo)板內(nèi)每孔加入70 μ 1神經(jīng)氨酸酶檢測 緩沖液；b.每孔再加入10 μ 1 Η5Ν1神經(jīng)氨酸酶；C.每孔再加入0 10 μ 1女貞苷、金絲桃 苷組合物樣品；d.每孔再加入0 10 μ 1 Milli-Q水。(3).檢測步驟a.振動混勻約Imin;b. 37°C孵育2min使抑制劑和H5W神經(jīng)氨酸酶充分相互作用，做標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品 也一起孵育；c.每孔加入10 μ 1神經(jīng)氨酸酶熒光底物；d.再振動混勻約Imin ；e. 37°C孵育20 30min后進(jìn)行熒光測定。激發(fā)波長為360nm，發(fā)射波長為440nm。(4).根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品對于H5W神經(jīng)氨酸酶的抑制百分比，以及做濃度 曲線后計算出女貞苷、金絲桃苷組合物對于H5m神經(jīng)氨酸酶的IC50。女貞苷、金絲桃苷組 合物達(dá)到對神經(jīng)氨酸酶的抑制率IC50為0. 338g/L。見表2。表2.女貞苷、金絲桃苷組合物抑制神經(jīng)氨酸酶的活性化合物檢測靶酶靶酶底物 化合物濃度酶抑制率(效價)
女貞苷、神經(jīng)氨酸 3.38g/L79.6%金絲桃神經(jīng)氨酸 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以清楚地看到(1).女貞苷、金絲桃苷組合物能夠提取出有效的抑制神經(jīng)氨酸酶成分；(2).女貞苷、金絲桃苷組合物隨著使用劑量大小變化，其抑制神經(jīng)氨酸酶活性的 能力，即神經(jīng)氨酸酶抑制率的高低也相應(yīng)發(fā)生變化，并且成正相關(guān)；(3).由上述實(shí)驗(yàn)可見，女貞苷、金絲桃苷組合物能夠通過抑制流感病毒表面神經(jīng) 氨酸酶，進(jìn)而抑制流感病毒進(jìn)入細(xì)胞里面、抑制已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞里面的流感病毒復(fù)制、增殖， 從而減少了流感病毒對細(xì)胞的感染、生長，以及預(yù)防和治療流感及其并發(fā)癥。醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究人員無法預(yù)先在不做抑制流感病毒感染、復(fù)制，或抑制神經(jīng)氨酸 酶的實(shí)驗(yàn)的前提下，預(yù)先得知女貞苷、金絲桃苷組合物具有預(yù)防和治療流感病毒性感冒的 良好效果。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)2 女貞苷、金絲桃苷組合物對流感病毒感染雞胚的抑制作用取實(shí)施例6制備方法所獲得的女貞苷、金絲桃苷組合物，應(yīng)用流感病毒亞甲型鼠 肺適應(yīng)株(FMl) (HlNl)鑒定女貞苷、金絲桃苷組合物抑制FMl流感病毒在雞胚中復(fù)制和抑 制的能力。(1).將FMl流感病毒液接種于IOd齡無特定病原體雞胚尿囊腔內(nèi)，每胚0.2ml， 37°C孵育72h，觀察并計算半數(shù)雞胚感染量(EID50)。(2).女貞苷、金絲桃苷組合物對雞胚 的毒性作用采用，無菌生理鹽水對女貞苷、金絲桃苷組合物作系列稀釋后接種于IOd齡無 特定病原體雞胚尿囊腔內(nèi)，每胚0. 2ml，每個濃度接種6胚，37°C孵育，觀察雞胚生長發(fā)育情 況，以雞胚可存活96h的最大濃度作為藥物的TD。(3).女貞苷、金絲桃苷組合物在雞胚中 對流感病毒的抑制作用采用，0. Iml的流感病毒液和不同稀釋度的女貞苷、金絲桃苷組合物 混合，37°C作用2h，接種于IOd齡無特定病原體雞胚尿囊腔，每組接種6胚，37°C孵育72h。 病毒攻擊量為50EID50，同時設(shè)病毒對照、無菌生理鹽水正常對照，計算女貞苷、金絲桃苷組 合物對病毒抑制作用的半數(shù)有效劑量(ED50)。(1).FM1流感病毒對雞胚的毒力經(jīng)Reed-Muench法計算，其EID50為10_5_°7。(2). 女貞苷、金絲桃苷組合物接種于雞胚后，其生長發(fā)育與正常對照組基本一致。96h雞胚均存 活。雞胚給予女貞苷、金絲桃苷組合物原液未見雞胚死亡，所以可認(rèn)為TDO為4. 6g/L。(3). 女貞苷、金絲桃苷組合物在雞胚中對流感病毒的抑制作用見表3。表3.女貞苷、金絲桃苷組合物對流感病毒感染雞胚的抑制作用
10 與病毒對照組比較*P < 0. 05由表3可知，女貞苷、金絲桃苷組合物在0. 2875 2. 3g/L對流感病毒有顯著的抑 制作用(P < 0. 05)，ED50 為 0. 38g士0. 16mg/ml, TI 為 21. 84士 3. 91。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)3 女貞苷、金絲桃苷組合物對FMl流感病毒影響取實(shí)施例6制備方法所獲得的女貞苷、金絲桃苷組合物，應(yīng)用流感病毒亞甲型鼠 肺適應(yīng)株(FMl) (HlNl)鑒定女貞苷、金絲桃苷組合物抑制FMl流感病毒毒力的能力。(1). FMl對狗腎傳代細(xì)胞(MDCK)的毒力測定采用細(xì)胞半數(shù)感染量(TCID50)微量法。(2).女貞 苷、金絲桃苷組合物對MDCK細(xì)胞的毒性測定采用無血清的DMEM對女貞苷、金絲桃苷組合物 作系列稀釋后接種于已形成單層的MDCK細(xì)胞孔中，每孔100 μ 1，每個稀釋度重復(fù)4個孔，同 時設(shè)正常細(xì)胞對照。將培養(yǎng)板置37°C、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變(CPE)，連 續(xù)觀察3d，以“+ ++++”記錄結(jié)果，按Reed-Muench法計算藥物半數(shù)中毒濃度(TD50)和最 大無毒濃度(TDO)。(3).女貞苷、金絲桃苷組合物抑制FMl流感病毒作用測定MDCK細(xì)胞 5X 105/ml，每孔100 μ 1，分別于96孔板中，37°C、5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，次日吸去孔中培養(yǎng) 液，加入100TCID50流感病毒液，每孔100μ 1，37°C吸附Ih后吸去上清液。用磷酸鹽緩沖 液(PBS)洗2次，以藥物的TDO為第1孔，再用無血清的DMEM液對女貞苷、金絲桃苷組合物 作系列稀釋，分別加入上述已感染病毒的細(xì)胞中，同時設(shè)病毒對照和正常對照組，37°C、5% CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)，每日觀察流感病毒產(chǎn)生的MDCK細(xì)胞病變特征，即單層細(xì)胞變性變圓等，連 續(xù)3d，計算出藥物的50%抑制病變濃度(IC50)及治療指數(shù)(Tl)。TI的計算TI = TD50/ IC50，TI值越大，表明藥物的安全范圍越大。以Kruskal-Walis和Mann-Whitney檢驗(yàn)法比 較試驗(yàn)組與病毒對照組細(xì)胞病變的差異，對藥物劑量和對病毒感染細(xì)胞避免發(fā)生細(xì)胞病變 (CPE)的抑制率進(jìn)行相關(guān)性分析，判斷是否存在量效反應(yīng)關(guān)系。(1). FMl流感病毒對MDCK細(xì)胞的毒力經(jīng)Reed-Muench法計算，其TCID50為10_4 81。 (2).女貞苷、金絲桃苷組合物MDCK細(xì)胞的TDO分別為1.2g士0. llg/L。(3).將女貞苷、金 絲桃苷組合物作系列稀釋后，對100TCID50流感病毒進(jìn)行抑制試驗(yàn)，計算藥物的半數(shù)有效 量IC50及TI值大小，結(jié)果見表4。表4.女貞苷、金絲桃苷組合物對FMl流感病毒的IC5tl (g/L)及TI(x 士 s)
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苷組合物由表4可知，女貞苷、金絲桃苷組合物的IC50低，TI高。女貞苷、金絲桃苷組合物 抑制FMl流感病毒致細(xì)胞病變的作用均隨著藥物劑量的增加而增強(qiáng)。對藥物劑量和藥物對 CPE的抑制率進(jìn)行的相關(guān)性分析表明，女貞苷、金絲桃苷組合物的劑量與藥物對CPE抑制率 之間呈明顯的正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)4:女貞苷、金絲桃苷組合物對小鼠體內(nèi)感染流感病毒FMl株的脾指數(shù)和 肺指數(shù)的影響取實(shí)施例6制備方法所獲得的女貞苷、金絲桃苷組合物，應(yīng)用流感病毒亞甲型鼠 肺適應(yīng)株(FMl) (HlNl)鑒定女貞苷、金絲桃苷組合物對小鼠體內(nèi)感染流感病毒FMl株的 死亡保護(hù)作用。(1).流感病毒FMl株病毒做10倍倍比稀釋后分別接種每組10只BALB/ C小鼠，雌雄各半。乙醚輕度麻醉后，每組分別給與不同稀釋度的病毒，每只小鼠滴鼻接種 20 μ 1。觀察IOd的小鼠死亡情況，按Reed-Muench法計算LD50為10_136。故確定實(shí)驗(yàn)所用 的造模濃度為10LD50。(2).女貞苷、金絲桃苷組合物對小鼠體內(nèi)感染流感病毒FMl株的死 亡保護(hù)作用正常對照組、流感病毒FMl株病毒對照組、女貞苷、金絲桃苷組合物5. Omg/ml、 10. Omg/ml,20. Omg/ml,40. Omg/ml劑量組等分別灌胃，灌胃容量均為0. 4ml/只。3d后，除 正常對照組外各組在乙醚輕度麻醉下用10LD50流感病毒FMl株滴鼻感染小鼠20 μ 1/只。 同時正常對照組給予同體積的生理鹽水。給藥的4組繼續(xù)給藥，正常對照組和流感病毒FMl 株病毒對照組給生理鹽水8天，劑量同上。逐日觀察動物發(fā)病和記錄死亡數(shù)，共觀察14天， 計算死亡率(死亡率=每組死亡數(shù)/每組小鼠總數(shù)X 100%)，結(jié)果見表5。(3).女貞苷、 金絲桃苷組合物對小鼠體內(nèi)感染流感病毒FMl株肺指數(shù)的影響正常對照組、流感病毒FMl 株病毒對照組、女貞苷、金絲桃苷組合物20. Omg/ml,40. Omg/ml,80. Omg/ml,160. Omg/ml劑 量組等分別灌胃，灌胃容量均為0. 4ml/只。3天后，除正常對照組外各組在乙醚輕度麻醉下 用1. 0LD50流感病毒FMl株滴鼻感染小鼠20 μ 1/只。同時正常對照組給予同體積的生理鹽 水。給藥的4組繼續(xù)給藥，正常對照組和流感病毒FMl株病毒對照組給生理鹽水8天，劑量 同上。于病毒感染后第8天處死小鼠，稱體重，取肺稱肺重，計算肺指數(shù)(肺指數(shù)=肺質(zhì)量 /體質(zhì)量X100% )；此外，取脾稱脾重，計算脾指數(shù)(脾指數(shù)=脾質(zhì)量/體質(zhì)量X 100% )， 結(jié)果見表6。表5.女貞苷、金絲桃苷組合物對小鼠體內(nèi)感染流感病毒FMl株的死亡保護(hù)結(jié)果
12 注※※P < 0. OlVS流感病毒模型組表6.女貞苷、金絲桃苷組合物對小鼠體內(nèi)感染流感病毒FMl株的脾指數(shù)和肺指數(shù) 的影響

注:#P < 0. 05VS正常對照組 ※※？ < 0. 001VS流感病毒模型組 ※口 < 0. 05VS流感病毒模型組(1).由表5可知，女貞苷、金絲桃苷組合物在1. 15 2. 3g/L對流感病毒感染小鼠 有顯著的保護(hù)作用(ρ <0.01)。(2).由表6可知，女貞苷、金絲桃苷組合物在2. 3g/L對流感病毒感染小鼠的肺指數(shù)抑制率有顯著的作用(P < 0.01)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)5 女貞苷、金絲桃苷組合物對腎功能損傷的影響1) SD大鼠，200 240g，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物責(zé)任有限公司，動物合格證號 SCXK(滬)2003-00022)試劑及藥物腺嘌呤，腺嘌呤，(含量> 98%，為進(jìn)口分裝，中國上海，批號 20010520)，實(shí)施例6制備方法所獲得的女貞苷、金絲桃苷組合物；3)試驗(yàn)方法雄性SD大鼠，體重220g左右，先用普通飼料喂養(yǎng)10天正常生長后， 按體重隨機(jī)分為正常對照組、給藥實(shí)驗(yàn)組和造模對照組，每組13 15只。給藥實(shí)驗(yàn)組和造 模對照組用腺嘌呤灌胃制作慢性腎功能衰竭(CRF)模型，以腺嘌呤320mg/(kg*d)灌胃，用 蒸餾水制成混懸液約2ml/只，共20天；20天后給藥，給藥實(shí)驗(yàn)組以女貞苷、金絲桃苷組合 物3. 4g/(kg.d)灌胃，女貞苷、金絲桃苷組合物以蒸餾水制成混懸溶液(0. 44g/ml)，每次 約2ml/只，分次灌胃，正常對照組和造模對照組以等體積水灌胃，給藥35天后將大鼠用乙 醚麻醉，鼠尾動脈采血觀察各項指標(biāo)。4)結(jié)果表7.女貞苷、金絲桃苷組合物對CRF大鼠腎功能的影響 注經(jīng)T檢驗(yàn)，女貞苷、金絲桃苷組合物實(shí)驗(yàn)組與造模對照組比較“*”表示P < 0. 05，“**” 表示 P < 0.01本實(shí)驗(yàn)用腺瞟呤灌胃建立大鼠CRF模型后，造模對照組大鼠精神萎靡，體重明顯 降低，血清BuruSer明顯升高，Hb明顯下降，Ret明顯升高，表明大鼠腎功能受損，經(jīng)給予女 貞苷、金絲桃苷組合物后大鼠與正常對照組差異不顯著，而與模型組比較差異十分顯著，故 女貞苷、金絲桃苷組合物對腎臟無毒性作用。
權(quán)利要求
女貞苷、金絲桃苷組合物，所述女貞苷的分子式C33H40O18，分子量724.2，所述女貞苷的結(jié)構(gòu)式如下所述金絲桃苷的分子式C21H20O12，分子量464.38，所述金絲桃苷的結(jié)構(gòu)式如下其中所述的女貞苷、金絲桃苷組合物是由下列重量配比制成的女貞苷80％～20％、金絲桃苷20％～80％。FSA00000229910500011.tif,FSA00000229910500012.tif
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的女貞苷、金絲桃苷組合物，其中所述的女貞苷、金絲桃苷組合 物是由下列重量配比制成的女貞苷75% 25%、金絲桃苷25% 75%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的女貞苷、金絲桃苷組合物，其中所述的女貞苷、金絲桃苷組合 物是由下列重量配比制成的女貞苷60% 40%、金絲桃苷40% 60%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的女貞苷、金絲桃苷組合物，其中所述的女貞苷、金絲桃苷組合 物是由下列重量配比制成的女貞苷55 % 45 %、金絲桃苷45 % 55 %。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的女貞苷、金絲桃苷組合物，其中所述的女貞苷、金絲桃苷組合 物是由下列重量配比制成的女貞苷50 %、金絲桃苷50 %。
6.權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的組合物用于制備預(yù)防和治療流感及其并發(fā)癥疾病的藥 物的用途。
7.如權(quán)利要求6的用途，其特征在于所述的組合物用于抑制流感病毒。
8.如權(quán)利要求7的用途，其特征在于所述的組合物用于抑制流感病毒FM1。
9.如權(quán)利要求6的用途，其特征在于所述的組合物用于抑制神經(jīng)氨酸酶。
10.如權(quán)利要求6的用途，其并發(fā)癥是指腎功能衰竭。
11.如權(quán)利要求6的用途，其并發(fā)癥是指脾損傷或/和肺損傷。
12.—種女貞苷、金絲桃苷組合物制劑，其中該制劑以權(quán)利要求1 5任一項所述的女 貞苷、金絲桃苷組合物為主要活性成分。
13.權(quán)利要求1、2、3、4或5所述的女貞苷、金絲桃苷組合物的提取方法，其中所述的女 貞苷、金絲桃苷是從山香圓葉中提取獲得的，所述提取方法如下取山香圓葉，加5 15倍 量的30% 90%乙醇回流提取1 3次，每次回流提取1 3小時，濾過；合并濾液，回收 乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱洗脫，收集洗脫部分，減壓濃縮，干燥，得女貞苷、金絲桃苷的 混合總苷，經(jīng)分離得到女貞苷、金絲桃苷純品。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的女貞苷、金絲桃苷采用如下的提取方法獲 得取山香圓葉，加12倍量70%乙醇回流提取1. 5小時，濾過，濾渣再加10倍量70%乙醇 回流提取1. 5小時，濾過，合并兩次提取液，回收乙醇，水溶液通過大孔樹脂柱洗脫，收集洗 脫部分，減壓濃縮，干燥。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中水溶液通過已處理好的大孔樹脂柱，分別用 水、5 % 10 %乙醇、30 % 55 %乙醇、1 %氫氧化鈉溶液洗脫，收集30 % 55 %乙醇洗脫部 分，減壓濃縮，干燥，得女貞苷、金絲桃苷的混合總苷，經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層 析分離，分別合并女貞苷、金絲桃苷流份，結(jié)晶，得到女貞苷純品和金絲桃苷的純品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種女貞苷、金絲桃苷組合物，其是通過按女貞苷20％～80％、金絲桃苷80％～20％的重量配比制成的組合物，該組合物可作神經(jīng)氨酸酶抑制劑用在預(yù)防和治療流感，制成藥學(xué)上可以接受的劑型。
文檔編號A61P11/00GK101890037SQ20101025375
公開日2010年11月24日 申請日期2010年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月16日
發(fā)明者劉地發(fā), 葉勁英, 呂武清, 李志勇, 楊小玲, 王燕平, 程帆, 蔡永紅, 謝寧 申請人:江西山香藥業(yè)有限公司;江西青峰藥物研究有限公司