一種苯硫酚熒光探針的制備及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可以用于熒光檢測苯硫酚的新型化合物，具體涉及一種新型熒光探針的制備方法及其應(yīng)用，屬于化學(xué)分析檢測技術(shù)領(lǐng)域。其分子結(jié)構(gòu)式如下：該熒光探針選擇性好，抗干擾能力強(qiáng)，靈敏度高，可用于生物或環(huán)境樣品中的苯硫酚的熒光檢測，具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種苯硫酚熒光探針的制備及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及的是化學(xué)分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型的苯硫酚熒光探針的 制備方法以及該熒光探針在檢測苯硫酚方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 苯硫酚在有機(jī)合成中被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥等中間體的制備，然而殘留在水體 及土壤中的苯硫酚會對環(huán)境及人類健康產(chǎn)生一系列危害。苯硫酚可通過吸入、食入或經(jīng)皮 吸收等途徑被人體吸收，會引起咳嗽、頭痛、嘔吐，嚴(yán)重時會導(dǎo)致人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損，心 率加快，肌肉萎縮，昏迷甚至死亡。目前巰基類化合物的熒光探針大多基于巰基的親核性進(jìn) 行有效識別，但是由于苯硫酚與脂肪硫醇具有相似的結(jié)構(gòu)，并且苯硫酚具有更強(qiáng)的親核性， 導(dǎo)致很多巰基類探針無法很好地區(qū)分二者。因此合成一種高靈敏度，高選擇性，能夠快速檢 測環(huán)境樣品內(nèi)的苯硫酚探針具有重要意義和實用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的之一是提供一種合成簡單、反應(yīng)條件溫和、成本較低的熒光探針合成 方法；目的之二是提供一種靈敏度高、選擇性好，抗干擾能力強(qiáng)，能夠?qū)崿F(xiàn)熒光法檢測苯硫 酚的熒光探針。
[0004] 本發(fā)明使用熒光法檢測苯硫酚，以鄰苯二甲酰亞胺衍生物為熒光團(tuán)，以2,4_二硝 基苯醚為苯硫酚的識別基團(tuán)。
[0005] 本發(fā)明解決問題采取的技術(shù)方案為，一種熒光檢測苯硫酚熒光探針，其分子結(jié)構(gòu)
式為， 該熒光探針的合成路線如下， 〇
具體制備方法包括以下步驟：1)將3-硝基鄰苯二甲酸酐溶解于乙酸中，緩慢加入正丁 胺，室溫下攪拌lOmin后，加熱升溫，120°C控溫回流2. 5h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，將反應(yīng) 液倒入冰水中，待固體析出后，抽濾并用冷水洗滌3次，得粗產(chǎn)物為白色固體，無需進(jìn)一步 純化，直接進(jìn)行下一步。2)將上一步所得粗產(chǎn)物1溶解于甲醇中，加入催化量的Pd/C，將體 系抽真空，通入氫氣，加熱攪拌，控溫65°C，12h后停止反應(yīng)，抽濾除去固體催化劑。將濾液 減壓旋干，經(jīng)層析柱分離得目標(biāo)產(chǎn)物。3)將上步得到產(chǎn)物2溶解在50 %硫酸溶液中，冰水浴 下緩慢加入亞硝酸鈉溶液，繼續(xù)攪拌30min后，換油浴加熱，控溫90°C反應(yīng)lh。停止加熱， 將反應(yīng)液倒入水中，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥后，減壓旋干，經(jīng)層 析柱進(jìn)一步純化得目標(biāo)產(chǎn)物。4)將上步得到的產(chǎn)物3和2,4_二硝基氟苯溶解于二甲基甲 酰胺中，加入碳酸鉀，90°C加熱攪拌10h。反應(yīng)停止后，冷卻至室溫，過濾出去碳酸鉀，濾液加 水稀釋，二氯甲烷萃取，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后經(jīng)層析柱分離得探 針分子。在本說明書的實施例中更詳細(xì)地說明了該探針的合成和檢測方法。
[0006] 本發(fā)明的熒光分子探針使用方法如下，將探針分子溶解在含有20%乙腈、pH為 7. 4的HEPES緩沖溶液中，室溫下進(jìn)行測試。當(dāng)加入苯硫酚時，由于2, 4-二硝基苯醚基團(tuán)可 以在苯硫酚的誘導(dǎo)下發(fā)生的裂解，使熒光得以恢復(fù)。探針分子與苯硫酚作用原理如下，
[0007] 本發(fā)明的苯硫酚熒光探針的具體特征如下：探針分子無明顯發(fā)射峰，但與苯硫酚 作用后，探針分子在516nm處出現(xiàn)明顯的發(fā)射峰，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了 60倍以上。
[0008] 本發(fā)明所述的探針分子合成簡單，成本較低，對苯硫酚的選擇性好、抗干擾能力 強(qiáng)、響應(yīng)速度快使得該熒光探針在生物化學(xué)，環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域具有實際的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0009] 圖1為本發(fā)明熒光探針的選擇性，熒光探針（5. 0X 10 6mol/L)在HEPES緩沖溶液 (20mM，ViJf/VHEPES= 2/8，pH = 7. 4)中，與不同分析物作用后的熒光光譜，橫坐標(biāo)為波長，縱 坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。
[0010] 圖2為本發(fā)明熒光探針的抗干擾能力，苯硫酚與其他分析物共存，與熒光探針 5· 0X 10 6mol/L)在緩沖溶液（ViJf /VHEPES= 2/8, pH = 7. 4)中作用后的熒光強(qiáng)度比值（1/ Ic)柱狀圖。其中25種分析物分別為：1，苯硫酚；2,半胱氨酸；3,同型半胱氨酸；4,谷甘胱 肽；5,巰基乙醇；6,3_巰基丙酸；7,丙氨酸；8,甘氨酸；9,苯酚；10,苯胺；11，疊氮化鈉；12， 硫氫化鈉；13,氟化鈉；14,氯化鈉；15,溴化鈉；16,碘化鉀；17,亞硝酸鈉；18,硫代硫酸鈉； 19,硫酸鈉；20,磷酸鈉；21，亞硫酸鈉；22,氯化鋅；23,氯化鈣；24,氯化鎂；25,氯化鉀。
[0011] 圖3為本發(fā)明的熒光探針（5· 0 X 10 6mol/L)在HEPES緩沖溶液（20mM，/VHEPES =2/8, pH = 7. 4)中，與不同濃度苯硫酚作用后的熒光光譜變化，橫坐標(biāo)為波長，縱坐標(biāo)為 熒光強(qiáng)度。
[0012] 圖4為本發(fā)明的熒光探針（5. 0 X 10 6mol/L)在HEPES緩沖溶液（20mM，ViJf /VHEPES =2/8，pH = 7. 4)中，與苯硫酚濃度的線性關(guān)系，橫坐標(biāo)為苯硫酚濃度，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。
[0013] 圖5為本發(fā)明的熒光探針（5· 0 X 10 6mol/L)在HEPES緩沖溶液（20mM，ViJf /VHEPES =2/8, pH = 7. 4)中，與苯硫酚作用過程中熒光強(qiáng)度隨時間的變化，橫坐標(biāo)為時間，縱坐標(biāo) 為熒光強(qiáng)度。
[0014] 圖6為本發(fā)明的熒光探針（5. 0X 10 6mol/L)在不同pH值緩沖溶液中，與苯硫酚作 用前后的熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為PH，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。
[0015] 圖7為本發(fā)明的熒光探針（5. 0X 10 6mol/L)在長江水配制的HEPES緩沖溶液 (20mM，ViJf /VHEPES= 2/8, pH = 7. 4)中，與苯硫酚濃度的線性關(guān)系，橫坐標(biāo)為苯硫酚濃度， 縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。
[0016] 圖8為本發(fā)明的熒光探針（5. 0X 10 6mol/L)在太湖水配制的HEPES緩沖溶液 (20mM，ViJf /VHEPES= 2/8, pH = 7. 4)中，與苯硫酚濃度的線性關(guān)系，橫坐標(biāo)為苯硫酚濃度， 縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。
[0017] 圖9為本發(fā)明的熒光探針（5. 0X 10 6mol/L)在自來水配制的HEPES緩沖溶液 (20mM，ViJf /VHEPES= 2/8, pH = 7. 4)中，與苯硫酚濃度的線性關(guān)系，橫坐標(biāo)為苯硫酚濃度， 縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。
[0018] 圖10為該探針在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)檢測苯硫酚的熒光成像圖。（a)和（c)為SH-SY5Y 細(xì)胞在37°C下置于5μΜ探針的PBS溶液中培養(yǎng)30min后，在暗場和明場下的細(xì)胞圖像。（b) 和（d)為SH-SY5Y細(xì)胞在37°C下先置于25 μ Μ苯硫酚的PBS溶液中培養(yǎng)30min，再在37°C 下置于5 μ Μ探針的PBS溶液中培養(yǎng)30min，經(jīng)PBS緩沖液沖洗之后，在暗場和明場下的細(xì)胞 圖像。
【具體實施方式】
[0017] 實施例1 :化合物1的合成 3-硝基鄰苯二甲酸酐（1. 9361g, lOmmol)溶于20ml乙酸中，緩慢加入正丁胺 (1.0951g，15mmol)，室溫下攪拌lOmin后，加熱升溫，120°C回流2. 5h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻 至室溫，將反應(yīng)液倒入50ml冷水中，待固體完全析出后，減壓抽濾，并用冷水洗滌濾餅三 次（9ml X3)，得化合物1，為白色固體。產(chǎn)量：2. 1252g。產(chǎn)量：85. 7%。化合物1表征如 下：4 NMR (500MHz，DMS0) : δ η 8. 27 (d，J = 8. 1Hz，1H)，8. 16 (d，J = 7. 5Hz，1H)，8. 05 (t，J =7. 8Hz，1H)，3. 57 (t，J = 7. 1Hz，2H)，1. 55 - 1. 61 (m，2H)，1. 39 - 1. 20 (m，2H)，0· 90 (t，J = 7. 4Hz, 3H). 13C NMR(126MHz,DMS0) δ c：166. 51, 163. 86, 144. 63, 136. 54, 134. 05, 128. 62, 12 7. 17, 123. 50, 38. 13, 30. 24, 19. 94, 13. 94. 實施例2 :化合物2的合成 上步所得化合物1(0. 4964g,2mmol)溶于15ml甲醇，加入10 % w/w Pd/ C(0.0496g，5mol% )，將體系抽真空，通入氫氣并攪拌，65°C下回流12h。反應(yīng)停止后， 減壓抽濾除去固體催化劑，所得濾液減壓旋蒸除去溶劑，經(jīng)層析柱分離得化合物2。產(chǎn) 量：0.6240g。產(chǎn)量：71.5%。化合物 2 表征如下"H NMR(500MHz，CDC13)S7.42(dd，J = 8. 3, 7. 1Hz, 1H), 7. 16 (d, J = 7. 6Hz, 1H), 6. 86 (d, J = 8. 8Hz, 1H), 5. 13 (s, 1H), 3. 65 (t, J =7. 3Hz, 2H), 1. 63 - 1. 70 (m, 2H), 1. 35 - 1. 42 (m, 2H). 0. 95 (t, J = 7. 4Hz, 3H). 13C NMR(126MHz, DMSO) δ c： 170. 38, 168. 77, 145. 15, 135. 02, 132. 86, 120. 96, 112. 58, 111. 38, 3 7. 37, 30. 76, 20. 09, 13. 69. 實施例3 :化合物3的合成 將上步所得化合物2溶于10ml 50%硫酸中，0°C冰水浴下攪拌，緩慢滴加亞硝酸 鈉水溶液（〇. 〇692mg，lmmol，2mL水）。繼續(xù)在0°C下攪拌30min后，加熱升溫至90°C， 繼續(xù)反應(yīng)lh。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入50ml水中，乙酸乙酯萃取3次（20mLX3)， 飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥后，旋蒸除去溶劑，真空干燥后經(jīng)柱層析分離得到化 合物3。產(chǎn)量：0.1862g。產(chǎn)率：85.4%。化合物3表征如下^HNMRGOOMHzJDClS) δ 7. 70 (s, 1Η), 7. 56 (t, J = 7. 6Hz, 1H) , 7. 36 (d, J = 7. 2Hz, 1H), 7. 15 (d, J = 8. 4Hz, 1H), 3. 65 (t, J = 7. 3Hz, 2H), L 68 - 1. 62 (m, 2H), L 40 - 1. 32 (m, 2H), 0. 95 (t, J = 7. 4Hz, 3H). 13C NMR(126MHz,DMS0) δ c： 170. 51, 167.91, 154.60, 136. 14, 132. 11, 122.53, 11 5. 80, 114. 63, 37. 49, 30. 62, 19. 87, 13. 40. 實施例4 :探針分子的合成 將上步得到的產(chǎn)物3(0.44068,2.0臟〇1)和2,4-二硝基氟苯（0.55828,3.0臟〇1)溶解 于10ml N, N-二甲基甲酰胺中，加入無水碳酸鉀（0. 9484g, 6. Ommol)，90°C加熱攪拌10h。反 應(yīng)停止后，冷卻至室溫，過濾出去碳酸鉀，濾液加 15ml水稀釋，二氯甲烷（20mLX3)萃取，飽 和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮后經(jīng)層析柱分離得探針分子。產(chǎn)率74. 5%。探 針分子表征如下出冊5出1)111/2:。&1。(1€(^(：18!115隊0 7[]\1+!1]，386.0910 汀〇1111(1，450.0983.1!1 NMR(500MHz，CDC13)SH8.96(d，J = 2.7Hz，lH)，8.36(dd，J = 9.2,2.7Hz，lH)，8.06-7. 68 (m, 2H), 7. 49 (d, J = 7. 8Hz, 1H), 7. 06 (d, J = 9. 2Hz, 1H), 3. 59 (t, 2H), 1. 67 - 1. 47(m, 2H), 1. 34 - 1. 29(m, 2H), 0· 91(t, 3H). 13C NMR(125MHz, CDC13) δ c 166. 96, 165. 09， 155. 23, 149. 53, 142. 45, 139. 68, 136. 73, 134. 10, 128. 90, 126. 90, 122. 45, 121. 47, 121. 29， 118. 83, 38. 09, 30. 42, 20. 03, 13. 56. 實施例5 :本發(fā)明苯硫酚熒光探針的性能測試 將探針溶于緩沖溶液（ViJf /VHEPES= 2/8，pH = 7. 4)中配制成5. 0X 10 6mol/L的溶液， 向溶液中加入 Cys，Hcy，GSH，2-巰基乙醇，3-巰基丙酸，Ala, Gly，PhOH，PhNH2, NaN3, NaSH，N aF, NaCl, NaBr, KI, NaN02, Na2S203, Na2S04, Na3P04, Na2S03, ZnCl2, CaCl2, MgCl2, KC1 后沒有明顯 的熒光變化，加入苯硫酚后引起了極為明顯的熒光變化，該熒光探針對苯硫酚表現(xiàn)出高靈 敏度、高選擇性的識別。當(dāng)苯硫酚分別與干擾物質(zhì)Cys，Hcy，GSH，2-巰基乙醇，3-巰基丙 酸，Ala, Gly，PhOH，PhNH2, NaN3, NaSH，NaF，NaCl, NaBr, KI, NaN02, Na2S203, Na2S04, Na3P04, Na2S0 3, ZnCl2, CaCl2, MgCl2, KC1共存時，探針不受干擾因素的影響，表現(xiàn)出來很好的抗干擾能力。 探針分子在pH為6至10的范圍內(nèi)都可以對苯硫酚選擇性識別。 實施例6 :本發(fā)明苯硫酚熒光探針的實際應(yīng)用 配制一系列5· 0X 10 6mol/L探針的緩沖溶液（ViJf /VHEPES= 2/8，pH = 7. 4)，分別加入 0-50 μ Μ的苯硫酚，完全反應(yīng)后，測得的516nm處的熒光強(qiáng)度與苯硫酚濃度在0-10 μ Μ的范 圍內(nèi)具有良好的線性，線性相關(guān)系數(shù)R = 〇. 99729,檢出限為3. 5ηΜ。取實際水樣：長江水、 太湖水和自來水，經(jīng)過濾后配制成緩沖溶液進(jìn)行相同的測試，結(jié)果顯示該探針在實際水樣 品中的檢測苯硫酚含量與在二次蒸餾水中的檢測結(jié)果高度一致。 實施例7 :本發(fā)明苯硫酚熒光探針的細(xì)胞測試 將培養(yǎng)好的SH-SY5Y細(xì)胞在37°C下置于5 μ Μ探針的PBS溶液中培養(yǎng)30min后得到的細(xì) 胞圖像無熒光。而將SH-SY5Y細(xì)胞在37°C下先置于25 μ Μ苯硫酚的PBS溶液中培養(yǎng)30min， 再在37°C下置于5 μ Μ探針的PBS溶液中培養(yǎng)30min，經(jīng)PBS緩沖液沖洗之后，能夠獲得細(xì) 胞的熒光成像。由此說明，探針具有良好的細(xì)胞膜滲透性，可用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的細(xì)胞成像 分析。
【主權(quán)項】
1. 一種苯硫酪巧光探針，其結(jié)構(gòu)為：2. 如權(quán)利要求1所述的苯硫酪巧光探針的制備方法，其特征在于按W下步驟進(jìn)行制 備： (a)將3-硝基鄰苯二甲酸酢溶解于乙酸中，緩慢加入正下胺，室溫下攬拌IOmin后，加 熱升溫，120°C控溫回流2.化。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入冰水中，待固體析出 后，抽濾并用冷水洗涂3次，得粗產(chǎn)物為白色固體，無需進(jìn)一步純化，直接進(jìn)行下一步。 化）將上一步所得粗產(chǎn)物1溶解于甲醇中，加入催化量的Pd/C，將體系抽真空，通入氨 氣，加熱攬拌，控溫65°C，1化后停止反應(yīng)，抽濾除去固體催化劑。將濾液減壓旋干，經(jīng)層析 柱分離得目標(biāo)產(chǎn)物。 (C)將上步得到產(chǎn)物2溶解在50%硫酸溶液中，冰水浴下緩慢加入亞硝酸鋼溶液，繼續(xù) 攬拌30min后，換油浴加熱，控溫90°C反應(yīng)比。停止加熱，將反應(yīng)液倒入水中，用乙酸乙醋 萃取，飽和食鹽水洗涂，無水硫酸鋼干燥后，減壓旋干，經(jīng)層析柱進(jìn)一步純化得目標(biāo)產(chǎn)物。 (d)將上步得到的產(chǎn)物3和2,4-二硝基氣苯溶解于二甲基甲酯胺中，加入碳酸鐘，90°C 加熱攬拌lOh。反應(yīng)停止后，冷卻至室溫，過濾出去碳酸鐘，濾液加水稀釋，二氯甲燒萃取，飽 和食鹽水洗涂，無水硫酸鋼干燥，減壓濃縮后經(jīng)層析柱分離得探針分子。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的苯硫酪巧光探針的用途，其特征在于該苯硫酪巧光探針用于 環(huán)境或生物樣品中苯硫酪的巧光檢測和分析。
【文檔編號】C07D209/48GK105985769SQ201510043537
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年1月28日
【發(fā)明人】宋相志, 高麗, 劉興江
【申請人】蘇州羅蘭生物科技有限公司