一種硫化氫熒光探針的制備及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可以用于硫化氫熒光識(shí)別的新型化合物，具體涉及一種新型熒光探針的制備方法及其應(yīng)用，屬于化學(xué)分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。其分子結(jié)構(gòu)式如下：該熒光探針用于環(huán)境或生物樣品中硫化氫的熒光傳感分析，選擇性好，抗干擾能力強(qiáng)，可以靈敏快速地檢測(cè)出樣品中的硫化氫，并具有較好的水溶性，在生物醫(yī)學(xué)研究方面具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種硫化氫熒光探針的制備及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及的是化學(xué)分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型的硫化氫熒光探針的 制備方法以及該熒光探針在檢測(cè)硫化氫方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 硫化氫（H2S)是一種具有臭雞蛋氣味的毒性氣體，但生物體內(nèi)內(nèi)源性產(chǎn)生的H 2S氣 體信息分子卻可以發(fā)揮重要的生理、病理作用。目前的研究已發(fā)現(xiàn)其在高血壓、缺氧性肺動(dòng) 脈高呀等疾病的發(fā)病過程中具有重要作用，因而對(duì)生物體內(nèi)源性H 2s的檢測(cè)在生物醫(yī)學(xué)研 究領(lǐng)域具有重大意義。檢測(cè)生理濃度的H2s對(duì)分析檢測(cè)技術(shù)提出了很高的要求，與大多數(shù) 分析檢測(cè)方法相比，熒光探針是目前更適合在活細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高靈敏度、高選擇性的便捷檢 測(cè)方法。目前已報(bào)導(dǎo)的H 2S探針的識(shí)別原理大多基于H2S的還原性：在熒光分子內(nèi)引入疊氮 基團(tuán)淬滅熒光，然后在H 2s作用下還原成氨基，恢復(fù)熒光。熒光探針需要實(shí)現(xiàn)在生物細(xì)胞內(nèi) 的檢測(cè)，就要求其具有較好的水溶性，所以提高熒光探針的水溶性也是目前研究領(lǐng)域的一 大挑戰(zhàn)之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的之一是提供一種合成簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、成本較低的熒光探針合成 方法；目的之二是提供一種靈敏度高、選擇性好，抗干擾能力強(qiáng)，能夠?qū)崿F(xiàn)熒光法檢測(cè)硫化 氫的熒光探針。
[0004] 本發(fā)明使用熒光法檢測(cè)硫化氫，以鄰苯二甲酰亞胺衍生物為熒光團(tuán)，以疊氮基為 硫化氫的識(shí)別基團(tuán)。
[0005] 本發(fā)明解決問題采取的技術(shù)方案為，一種熒光檢測(cè)硫化氫熒光探針，其分子結(jié)構(gòu)
式為， 該熒光探針的合成路線如下， 〇
具體制備方法包括以下步驟：1)將3-硝基鄰苯二甲酸酐1溶解于乙酸中，緩慢加入正 丁胺，室溫下攪拌lOmin后，加熱升溫，120°C控溫回流2. 5h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，將反 應(yīng)液倒入冰水中，待固體析出后，抽濾并用冷水洗滌3次，得粗產(chǎn)物為白色固體，無需進(jìn)一 步純化，直接進(jìn)行下一步。2)將上一步所得粗產(chǎn)物2溶解于甲醇中，加入催化量的Pd/C，將 體系抽真空，通入氫氣，加熱攪拌，控溫65°C，12h后停止反應(yīng)，抽濾除去固體催化劑。將濾 液減壓旋干，經(jīng)層析柱分離得目標(biāo)產(chǎn)物。3)將上步得到產(chǎn)物3溶解在30%硫酸溶液中，冰 水浴下緩慢加入亞硝酸鈉溶液，繼續(xù)攪拌30min后，冰浴下緩慢滴加疊氮化鈉水溶液，室溫 繼續(xù)攪拌lh后，抽濾得白色固體即為目標(biāo)產(chǎn)物。在本說明書的實(shí)施例中更詳細(xì)地說明了該 探針的合成和檢測(cè)方法。
[0006] 本發(fā)明的熒光分子探針使用方法如下，將探針分子溶解在含有20%乙腈、pH為 7. 4的HEPES緩沖溶液中，室溫下進(jìn)行測(cè)試。當(dāng)加入硫離子時(shí)，由于2, 4-二硝基苯磺酰胺基 團(tuán)可以在硫化氫的誘導(dǎo)下發(fā)生的裂解，使熒光得以恢復(fù)。探針分子與硫化氫作用原理如下，
[0007] 本發(fā)明的硫化氫熒光探針的具體特征如下：探針分子無明顯發(fā)射峰，但與硫化氫 作用后，探針分子在500nm處出現(xiàn)明顯的發(fā)射峰，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了 150倍以上。
[0008] 本發(fā)明所述的探針分子合成簡(jiǎn)單，成本較低，對(duì)硫化氫的選擇性好、抗干擾能力 強(qiáng)、響應(yīng)速度快使得該熒光探針在生物化學(xué)，環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0009] 圖1為本發(fā)明熒光探針的選擇性，熒光探針（5. 0X 10 6mol/L)在HEPES緩沖溶液 (20mM，/VHEPES= 2/8, pH = 7. 4)中，與不同陰離子作用后的熒光光譜，橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)， 縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。
[0010] 圖2為本發(fā)明熒光探針的抗干擾能力，硫離子與其他陰離子共存，與熒光探針 (5. 0X 10 6mol/L)在緩沖溶液（ViJf /VHEPES= 2/8，pH = 7. 4)中作用后的熒光強(qiáng)度比值（1/ I。）柱狀圖。
[0011] 圖3為本發(fā)明的熒光探針（5· 0 X 10 6mol/L)在HEPES緩沖溶液（20mM，/VHEPES =2/8, pH = 7. 4)中，與不同濃度硫離子作用后的熒光光譜變化，橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為 熒光強(qiáng)度。
[0012] 圖4為本發(fā)明的熒光探針（5· 0X 10 6mol/L)在HEPES緩沖溶液（20mM，ViJf/VHEPES =2/8，pH = 7. 4)中，與硫離子濃度的線性關(guān)系，橫坐標(biāo)為硫離子濃度，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。
[0013] 圖5為本發(fā)明的熒光探針（5· 0X 10 6mol/L)在HEPES緩沖溶液（20mM，ViJf/VHEPES =2/8, pH = 7. 4)中，與硫離子作用過程中熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo) 為熒光強(qiáng)度。
[0014] 圖6為本發(fā)明的熒光探針（5. 0X 10 6mol/L)在不同pH值緩沖溶液中，與硫離子作 用前后的熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)為PH，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例1 :化合物2的合成 將化合物1 (1. 9361g，lOmmol)溶于20ml乙酸中，緩慢加入正丁胺（1. 0951g，15mmol)， 室溫下攪拌lOmin后，加熱升溫，120°C回流2. 5h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，將反應(yīng)液 倒入50ml冷水中，待固體完全析出后，減壓抽濾，并用冷水洗滌濾餅三次（9ml X 3)， 得化合物1，為白色固體。產(chǎn)量：2. 1252g。產(chǎn)量：85. 7 %?；衔?表征如下"Η M!R(500MHz，DMS0)SH:8.27(d，J = 8.1Hz，lH)，8.16(d，J = 7.5Hz，lH)，8.05(t，J =7. 8Hz, 1H), 3. 57 (t, 2H), 1. 63 - 1. 51 (m, 2H), 1. 38 - 1. 24 (m, 2H), 0. 90 (t, 3H). 13C NMR(126MHz, DMSO) δ c：166. 51, 163. 86, 144. 63, 136. 54, 134. 05, 128. 62, 127. 17, 123. 50, 3 8. 13, 30. 24, 19. 94, 13. 94. 實(shí)施例2 :化合物3的合成 上步所得化合物2(0. 4964g,2mmol)溶于15ml甲醇，加入10 % w/w Pd/ C(0.0496g，5mol% )，將體系抽真空，通入氫氣并攪拌，65°C下回流12h。反應(yīng)停止后，減 壓抽濾除去固體催化劑，所得濾液減壓旋蒸除去溶劑，經(jīng)層析柱分離得化合物2。產(chǎn)量： 0.624(^。產(chǎn)量：71.5%?；衔?表征如下： 1!1匪1?(5001抱，0)(：13)3":7.42((1(1，了 = 8. 3, 7. 1Hz, 1H), 7. 16 (d, J = 7. 6Hz, 1H), 6. 86 (d, J = 8. 8Hz, 1H), 5. 13 (s, 1H), 3. 65 (t, J =7. 3Hz, 2H), 1. 63 - 1. 70 (m, 2H), 1. 35 - 1. 42 (m, 2H). 0. 95 (t, J = 7. 4Hz, 3H). 13C NMR(126MHz, DMSO) δ c：170. 38, 168. 77, 145. 15, 135. 02, 132. 86, 120. 96, 112. 58, 111. 38, 3 7. 37, 30. 76, 20. 09, 13. 69. 實(shí)施例3 :探針分子的合成 將上步所得化合物3 (lOOmg, 0. 45mmol)溶于5ml 30 %硫酸中，0 °C冰水浴下攪 拌，緩慢滴加亞硝酸鈉水溶液（41mg，0, 6mmol，2mL水）。繼續(xù)在0 °C下攪拌30min后 ，緩慢滴加疊氮化鈉水溶液（58mg，0. 9_〇1，2ml水），滴加完畢后撤去冰水浴，室溫 攪拌lh后結(jié)束反應(yīng)，抽濾出白色固體，干燥后得到探針分子。探針分子表征如下： 4 MIR(500MHz，CDC13) δ Η:7· 73 - 7.68 (m，lH)，7.63 (d，J = 7.3Hz，1H)，7.41 (d，J = 8. 1Hz，1H)，3. 69 (，2H)，1. 93 - 1. 52 (m，2H)，1. 49 - 1. 18 (m，2H)，0· 96 (t，3H) · 13C 匪R δ c： 166. 39, 166. 30, 138. 08, 135. 24, 134. 32, 124. 94, 120. 88, 119. 38, 37. 87, 30. 52, 20. 04 ,13. 62 實(shí)施例5 :本發(fā)明硫化氫熒光探針的應(yīng)用 將探針溶于緩沖溶液（ViJf /VHEPES= 2/8，pH = 7. 4)中配制成5. 0X 10 6mol/L的溶液， 向溶液中加入 F，Cl，Br，I，N03，N02，AcO，N3，S04 2，S2S032，CIO，SCN，CN，H20 2, Cys， Hcy，GSH，P043，C032，S0 32沒有引起熒光的變化，加入S2后引起了極為明顯的熒光變化，該 熒光探針對(duì)硫化氫表現(xiàn)出高靈敏度、高選擇性的識(shí)別。當(dāng)S 2分別與干擾物質(zhì)F，Cl，Br， I，N03，N02，AcO，N3，S04 2，S2S032，CIO，SCN，CN，H20 2, Cys，Hcy，GSH，P043，C032，S0 32 共 存時(shí)，探針不受干擾因素的影響，表現(xiàn)出來很好的抗干擾能力。探針分子在pH為5至11的 范圍內(nèi)都可以對(duì)硫化氫選擇性識(shí)別，表現(xiàn)出了較寬的應(yīng)用范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種硫化氨巧光探針，其結(jié)構(gòu)為：2. 如權(quán)利要求1所述的硫化氨巧光探針的制備方法，其特征在于按W下步驟進(jìn)行制 備： (a)將3-硝基鄰苯二甲酸酢溶解于乙酸中，緩慢加入正下胺，室溫下攬拌IOmin后，加 熱升溫，120°C控溫回流2.化。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入冰水中，待固體析出 后，抽濾并用冷水洗涂3次，得粗產(chǎn)物為白色固體，無需進(jìn)一步純化，直接進(jìn)行下一步。 化）將上一步所得粗產(chǎn)物2溶解于甲醇中，加入催化量的Pd/C，將體系抽真空，通入氨 氣，加熱攬拌，控溫65°C，1化后停止反應(yīng)，抽濾除去固體催化劑。將濾液減壓旋干，經(jīng)層析 柱分離得目標(biāo)產(chǎn)物。 (C)將上步得到產(chǎn)物3溶解在30%硫酸溶液中，冰水浴下緩慢加入亞硝酸鋼溶液，繼續(xù) 攬拌30min后，冰浴下緩慢滴加疊氮化鋼水溶液，室溫繼續(xù)攬拌比后，抽濾得白色固體即為 探針分子。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的硫化氨巧光探針的用途，其特征在于該硫化氨巧光探針用于 環(huán)境或生物樣品中硫化氨的巧光檢測(cè)和分析。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK105985770SQ201510065133
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月9日
【發(fā)明人】宋相志, 高麗, 劉興江
【申請(qǐng)人】蘇州羅蘭生物科技有限公司