一種從臘八蒜中提取和分離黃色素的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及食品加工中天然色素的分離技術，具體是關于一種從臘八蒜中提取和 分離黃色素的方法。
【背景技術】
[0002] 中國傳統(tǒng)蒜制品臘八蒜中的綠色素是天然的植物次生代謝產物。綠色素由紫外 吸收波長分別為590、440nm的藍色素和黃色素構成。含色素的臘八蒜提取物具有抗氧化、 抑制HL-60人白血病細胞、BGC-823胃癌細胞、人乳腺癌細胞、人肝癌細胞Bel-7402和人前 列腺癌細胞PC-3M-1E8增值等作用，研宄表明藍色素及黃色素粗提物都具有清除DPPH、超 氧陰離子和羥自由基等作用。可見臘八蒜色素作為天然食用色素，除了具有安全、無毒等特 性，還具有一定的功能性，因此從臘八蒜中分離出色素單體成分對食品、化妝品、醫(yī)藥領域 都具有重大的意義。
[0003] 對于臘八蒜色素的分離純化，目前已有一些研宄，趙曉丹等建立了初步提取分離 大蒜綠變色素的方法：以柱層析為主要手段，選用CG-50樹脂、SIPI-40樹脂，硅膠等不同填 料對色素進行了分離和純化，等到了藍色素和黃色素的粗提物，但未能得到色素的純品；其 他學者在此基礎上，經高效液相進一步分離，得到最終產物為黃色素和與黃色素性質相似 物質的混合物，仍然未能獲得單體色素；近年來有學者通過體外合成的方式合成了一系列 大蒜黃色素的類似物。然而直至目前為止，沒有從臘八蒜中分離出天然的單一黃色素。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明提供一種從臘八蒜中提取和分離黃色素的方法，用于解決現有技術中無法 從臘八蒜中提取高純度的單一黃色素成分的缺陷。
[0005] 本發(fā)明提供一種從臘八蒜中提取和分離黃色素的方法，包括如下步驟：
[0006] 1)米用pH值為2_4的酸性乙醇溶液對臘八蒜進行提取，制得提取液；
[0007] 2)采用有機溶劑對所述提取液進行萃取，收取萃取液，制得含有黃色素的第一粗 提物；
[0008] 3)采用大孔樹脂對所述第一粗提物中的黃色素進行吸附，并對吸附后的大孔樹脂 進行洗脫，收集洗脫液，制得第二粗提物；
[0009] 4)采用酸性溶液將所述第二粗提物制成第二粗提液后，用凝膠樹脂柱進行凝膠層 析，收集440nm處的洗脫液，制得黃色素初品；其中，所述凝膠層析采用的洗脫液劑為酸性 溶液和有機溶劑的混合液，所述混合液中酸性溶液與有機溶劑的體積比為（2 :8)-(5 :5)， 所述酸性溶液為PH值2-4的水溶液，所述有機溶劑為乙醇、乙腈或正丁醇。
[0010] 進一步地，在上述步驟4)結束后，還包括下述步驟5):
[0011] 5)采用高效液相色譜對所述黃色素初品進行純化，所述高效液相色譜采用C18色 譜柱，流動相A為0. 3-0. 6 %的甲酸水溶液，流動相B為0. 3-0. 6 %乙腈溶液，洗脫梯度為 0-3min 15% B，3-10min 20% B，收集最大吸收峰值處的洗脫液，并去除洗脫液中的有機溶 劑，制得黃色素終品。
[0012] 在本發(fā)明的制備中涉及的分離手段包括步驟3)的普通柱層析方法、步驟4)的等 度液相色譜分離方法以及步驟5)的梯度液相色譜分離方法，這三者的基本原理都是利用 不同物質在各種溶劑的溶解度不同，當需要獲取某一混合物中的某單一成分時，先將該混 合物附著于某一具有吸附性的固定相（載體柱）上，通過選用合適的溶劑（稱為淋洗劑或 洗脫劑，該溶劑對該單一成分的溶解性極佳，對其他成分溶解性較差）對附著有混合物的 固定相進行淋洗，混合物中在該洗脫劑中溶解性最好的物質會先通過載體柱流出，從而達 到分離的目的。因此，在分離過程中，分離條件（洗脫劑的種類以及流速選擇等）的確定 對于分離效果有著至關重要的作用。其中，普通柱層析的載體柱是通過在玻璃柱內加填硅 膠等物質完成固定相制備后在進行相應的上樣、淋洗操作，其中玻璃柱的長短粗細以及硅 膠量的選擇根據待分離混合的量進行相應的選擇，而等度以及梯度液相色譜采用色譜儀進 行，適合少量物質的高精度分離，其中梯度液相色譜的分離效果由于在分離過程中在不同 時間采用了不同比例的洗脫液，所以其分離效果優(yōu)于等度液相色譜。
[0013] 本發(fā)明的分離方法中，所有的用于提取、溶解、淋洗的pH值為2-4的溶液，都是采 用甲酸、乙酸、三氟乙酸和磷酸中的一種或幾種進行溶液pH值的調節(jié)。控制pH值在該范圍 內，既能夠最大限度的對臘八蒜中的黃色素進行有效地提取與溶解，又不會使黃色素分解 發(fā)生其他化學反應。
[0014] 本發(fā)明所采用的臘八蒜是經過一段時間腌制，蒜體已經明顯呈現綠色的臘八 蒜，如果腌制時間過短蒜體還未呈現綠色，則蒜中的色素含量過低，還不適于黃色素的提 取。為了能夠實現臘八蒜中黃色素的完全提取，一般在對臘八蒜進行提取前，還會對臘八 蒜進行破碎處理以增大提取溶劑的接觸范圍，一般破碎至40-80目即可。進一步地，在步 驟1)中，采用所述酸性乙醇溶液提取臘八蒜一次以上，并且控制所述酸性乙醇溶液中乙醇 的體積含量為50-90%，所述臘八蒜與所述酸性乙醇溶液的質量體積比為1:(1-8)，提取 溫度為-4-25?，提取時間為12-24h。在提取過程中，為了提高提取率，可以采用轉速為 800-100r/min的攪拌裝置進行攪拌提取，每Ig臘八蒜采用I-Sml的酸性乙醇溶液進行提 取，同時步驟1)可以進行一次以上，提取后，將每次的提取物合并過濾，收集濾液，制得提 取液。
[0015] 進一步地，在步驟2)中，采用所述有機溶劑萃取所述提取液一次以上，并且控制 所述提取液與所述有機溶劑的體積比為1: (1-5)，萃取時間為2_6h ;其中，所述有機溶劑為 乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿。提取液中含有大量的脂溶性雜質，這些雜質在酸水中的溶解性 好，因此采用萃取的方法將脂溶性雜質從提取液中分離出去。為了得到提高萃取的效率，該 操作可進行2-5次，將每次的萃取液，即有機相，進行合并，得到第一粗提物。
[0016] 第一粗提物中除了臘八蒜色素物質還含有一些糖類、氨基酸、蛋白質等大分子組 分，為了將這些大分子組分與臘八蒜色素物質分開，特此選擇與大分子組分不親和，卻能 吸附臘八蒜物質的大孔樹脂作為分離載體，從而進一步的通過淋洗洗脫，實現大分子組分 與臘八蒜色素物質的分離。進一步地，所述大孔樹脂為XAD-7大孔樹脂、AB-8大孔樹脂或 YWD-Ol大孔樹脂。
[0017] 進一步地，步驟3)包括對所述第一粗提物濃縮，并將濃縮物溶于雙蒸水中，制得 第一粗提液，其中控制所述濃縮物與雙蒸水的質量體積比為1 : (〇. 5-4);將所述第一粗提 液上裝有所述大孔樹脂的層析柱，采用pH值為2-4的水溶液以3-8mL/min的流速洗滌2-4 個柱體積，隨后采用PH值為2-4的酸性乙醇進行洗脫，收集洗脫液，制得第二粗提物。具體 地，可以在35°C將第一粗提物進行濃縮直至有機溶劑全部去除得到濃縮物。為了提高產品 的純度，可以將第一粗提物的濃縮物溶解于雙蒸水中得到第一粗提液，雙蒸水即為蒸餾過 兩次水，水中的大部分鹽類、氨類以及有機物已經被除去，因此有助于色素的提純。
[0018] 在本發(fā)明的具體方案中，將第一粗提液進行柱層析處理，所用的大孔樹脂的質量 以所需處理的樣品質量決定，一般為30-40:1，即處理Ig樣品，需要大孔樹脂30-40g。上樣 后，由于第一粗提液中的一些糖類、氨基酸、蛋白質等大分子組分與樹脂不親和不會被吸附 在大孔樹脂中，因此先選用pH為2-4的水溶液作為洗滌劑，以流速為3-8ml/min對大孔樹 脂柱洗滌，將這些大分子組分沖洗下來，當洗滌劑的體積為2-4倍的柱體積時，第一粗提物 中的大分子組分就會被完全除去，而第一粗提物中的色素成分不易被洗滌劑沖刷仍然被吸 附在大孔樹脂中。此時，再采用pH值為2-4的酸性乙醇作為洗脫劑，以3-10ml/min的流速 對大孔樹脂柱進行洗脫，由于色素成分易溶于該洗脫劑中，因此能夠將吸附在大孔樹脂中 的色素成分沖刷出來，對洗脫液進行收集，得到第二粗提物。同樣的，洗脫劑的體積為2-4 倍的柱體積時，大孔樹脂中的色素成分會被全部沖刷洗脫出來。其中，柱體積通過式（1)進 行計算，
[0019] V= π r2h 式（1)
[0020] 其中，r為載體柱的半徑，h為載體柱內固定相（大孔樹脂）的高度。
[0021 ] 此時，第二粗提物中含有黃色素、藍色素以及其他酚酸類物質，為了得到成分單一 的黃色素，因此對第二粗提物進行步驟4)的等度色譜處理。具體的，等度色譜中的色譜柱 可選取凝膠樹脂柱，進一步地，凝膠樹脂柱中填裝的凝膠樹脂為SephadexG-25凝膠樹脂、 Sephadex LH-20凝膠樹脂、SephadexG-20凝膠樹脂或SephadexG-15凝膠樹脂。
[0022] 進一步地，步驟4)中，在將所述第二粗提物制成第二粗提液之前，先對所述第二 粗提物進行濃縮，并將濃縮物溶于所述酸性溶液中，制得第二粗提液，其中控制所述濃縮物 與酸性溶液的質量體積比為1 : (〇. 5-3)，并且控制第二粗提液的進樣量為2-6mL，所述洗脫 液的流速為l_4mL/min。具體的，在進行凝膠樹脂分離前，將收集到的第二粗提物在35°C進 行濃縮處理，制得第二粗提物的濃縮物。將該濃縮物溶解在pH值2-4的水溶液中得到第二 粗提液，以2-6mL的進樣量注入凝膠柱中，以洗脫劑進行洗脫，控制洗脫劑的流速為l-4ml/ min。該步洗脫正是進行黃色素與其他色素，例如藍色素和酚酸類物質的分離，因此，洗脫劑 對于分離效果至關重要。該步驟的洗脫劑為酸性溶液和有機溶劑的混合液，所述混合液中