本發(fā)明屬于熒光探針材料及其制領(lǐng)域，特別涉及一種檢測(cè)汞離子的水溶性高分子熒光素類熒光探針及其制備方法。

背景技術(shù)：

汞是自然界中毒性高和普遍存在的重金屬元素之一。它廣泛的分布在我們每天生活中所需的產(chǎn)品中，例如：電池、印刷和電子設(shè)備等。汞元素和汞離子通過(guò)環(huán)境中的細(xì)菌可以轉(zhuǎn)化成甲基汞，然后通過(guò)食物鏈在生物體中進(jìn)行累計(jì)，由于甲基汞在低濃度的條件下會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)中的硫醇基團(tuán)和酶有很高的親和力，因此嚴(yán)重的影響了人的健康問(wèn)題。因此，在生物、環(huán)境和診斷監(jiān)控等領(lǐng)域方面發(fā)展實(shí)時(shí)和快速檢測(cè)汞離子成為我們的迫切需求。當(dāng)前，常見的汞元素檢測(cè)手段主要是原子吸收/發(fā)射光譜法、氣相色譜法、核磁共振、x射線熒光光譜法、電感耦合等離子體-質(zhì)譜、電化學(xué)方法(如陽(yáng)極溶出伏安法、氧化還原電位法等)、比色法(如傳統(tǒng)的雙硫腙法)。傳統(tǒng)的測(cè)試手段繁瑣和設(shè)備昂貴而又不能進(jìn)行連續(xù)的監(jiān)控。在這種情況下傳統(tǒng)的技術(shù)已經(jīng)不能滿足，我們迫切需要尋找其他的檢測(cè)手段。在最近十幾年，發(fā)現(xiàn)熒光探針檢測(cè)法具有便捷性好，選擇性、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)有許多關(guān)于小分子熒光探針法檢測(cè)汞離子的報(bào)道，中國(guó)專利201310163699.9“汞離子熒光傳感器及其合成方法和應(yīng)用”，以羅丹明b和水合肼為原料反應(yīng)生成羅丹明·酰胺，然后加入異氰酸酯反應(yīng)合成汞離子的熒光熒光傳感器；中國(guó)專利201410029789.3“一種用于檢測(cè)水環(huán)境中金屬離子含量的有機(jī)化合物及其應(yīng)用”，以n-[2-(n’n’-二(烷基巰乙基)氨基苯氧乙基]-n-烷基巰乙基-2-烷氧基苯胺作為離子絡(luò)合體，適用于各種環(huán)境中金屬離子濃度的連續(xù)檢測(cè)，尤其對(duì)汞離子的檢測(cè)。熒光素具有獨(dú)特的熒光性能,其探測(cè)光波長(zhǎng)(λex)和發(fā)射光波長(zhǎng)(λem)均位于可見光區(qū),防止紫外光對(duì)細(xì)胞造成的損失，且熒光量子產(chǎn)率高；易與一些生物分子以共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵的形式結(jié)合形成標(biāo)記物或復(fù)合物；無(wú)毒，成本低。因此在發(fā)展熒光探針方面具有重要應(yīng)用前景。申請(qǐng)人前期申請(qǐng)的中國(guó)專利“檢測(cè)汞離子的反應(yīng)型熒光素類熒光探針及其制備與應(yīng)用(中國(guó)專利105924449a)”，在水溶液中，使用熒光光譜法，在激發(fā)波長(zhǎng)為445nm，檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)為512nm，檢測(cè)汞離子的濃度在0.1-10nm的范圍達(dá)到一個(gè)很好地線性，檢測(cè)限為0.4nm，采用熒光探針法檢測(cè)汞離子溶液，可實(shí)現(xiàn)對(duì)汞離子的實(shí)時(shí)和快速的檢測(cè)，在環(huán)境和生物檢測(cè)方面有較好的應(yīng)用前景。然而，水溶性高靈敏度高分子汞離子熒光探針的報(bào)道較少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)汞離子的水溶性高分子熒光素類熒光探針及其制備方法，該熒光探針在水溶液中對(duì)汞離子有很好的選擇性，在環(huán)境檢測(cè)和生物方面具有較好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的一種檢測(cè)汞離子的水溶性高分子熒光素類熒光探針，結(jié)構(gòu)式為：其中，n為10～50中的整數(shù)；m為300-1000中的整數(shù)。

本發(fā)明的一種檢測(cè)汞離子的水溶性高分子熒光素類熒光探針的制備方法，包括：

(1)將縛酸劑加入到熒光素溶液中，冰水浴冷卻，然后加入丙烯酰氯溶液，室溫反應(yīng)23～25h，去除溶劑，真空干燥，得到丙烯?；鶡晒馑?；

(2)將步驟(1)中得到的丙烯?；鶡晒馑厝苡谌軇┲校渭铀想氯芤?，75～80℃反應(yīng)10-14h，除去溶劑和未反應(yīng)的水合肼，重結(jié)晶，干燥，得到丙烯酰氯熒光素酰肼acfh；

(3)將步驟(2)中的acfh、丙烯酰胺和偶氮二異丁腈aibn溶于溶劑中，得到混合溶液；然后將混合溶液置于容器中(優(yōu)選安瓿瓶)中，通高純氮?dú)?5-30min后密封(封瓶)，70-80℃反應(yīng)8～15h(反應(yīng)過(guò)程中可看到反應(yīng)瓶中有沉淀物析出)，抽濾(得到黃色固體)，提純，真空干燥，研磨，得到檢測(cè)汞離子的水溶性高分子熒光素類熒光探針(黃色粉末pafm)。

所述步驟(1)中縛酸劑為三乙胺、二乙胺等有機(jī)胺類堿性試劑。

所述步驟(1)中熒光素的結(jié)構(gòu)式為：

所述步驟(1)中熒光素溶液的濃度為0.45～0.5mol/l，溶劑為c2h4c12；丙烯酰氯溶液的濃度為5.5～6mol/l，溶劑為c2h4c12。

所述步驟(1)中熒光素、縛酸劑和丙烯酰氯的摩爾比為1：2～2.5：1～1.5。

所述步驟(1)中去除溶劑的方法為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法，條件為：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的溫度為20～30℃，真空度為101～105kpa，時(shí)間為0.5～1h。

所述步驟(1)中通過(guò)用tcl板跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。

所述步驟(2)中丙烯?；鶡晒馑嘏c水合肼的摩爾比為1：1～6。

所述步驟(2)中溶劑為無(wú)水乙醇；水合肼溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80％。

所述步驟(2)中除去溶劑和未反應(yīng)的水合肼的方法為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，條件為：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的溫度為50～60℃，真空度為101～105kpa，時(shí)間為1～2h。

所述步驟(2)中重結(jié)晶采用四氫呋喃重結(jié)晶。

所述步驟(3)中acfh、丙烯酰胺和aibn的摩爾比為1：40～60：0.05～0.3。

所述步驟(3)中溶劑為四氫呋喃。

所述步驟(3)中提純的操作為：將抽濾得到的固體用濾紙包裹置于索氏提取器中，用四氫呋喃做溶劑抽提以除去低聚物或未反應(yīng)的單體。

所述檢測(cè)汞離子的水溶性高分子熒光素類熒光探針應(yīng)用在檢測(cè)水溶液中的汞離子中。

本發(fā)明所述的熒光探針pafm自身熒光很弱，溶于水溶液后與汞離子混合后，產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，在汞離子的條件下，經(jīng)過(guò)460nm可見光激發(fā)，515nm處的熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)，通過(guò)記錄熒光強(qiáng)度即可檢測(cè)汞離子的濃度。熒光探針acfh在ph＝7的緩沖溶液中對(duì)汞離子可進(jìn)行高選擇性檢測(cè)。所述的熒光探針的熒光強(qiáng)度與汞離子濃度成良好的線性關(guān)系，定量檢測(cè)汞離子濃度的線性范圍為1-10nm，最低檢測(cè)限為0.35nm。

本發(fā)明的熒光探針的制備路線如下：

本發(fā)明的水溶性高靈敏度高分子汞離子熒光探針呈現(xiàn)更好的檢測(cè)靈敏性和更大絡(luò)合常數(shù)，同時(shí)丙酰胺高分子介質(zhì)具有很好生物相容性、生物降解和細(xì)胞滲透性能，可望在生物影像和疾病檢測(cè)等具有更好應(yīng)用前景。

有益效果

(1)本發(fā)明的水溶性高分子熒光探針化合物對(duì)汞離子有很好的選擇性，并且應(yīng)用于水溶液中，在環(huán)境應(yīng)用中不僅方便而且具有較好的使用效果；

(2)本發(fā)明的熒光探針化合物為固體粉末，便于使用貯藏，并且合成方法簡(jiǎn)單、收率高、成本低，應(yīng)用前景良好。

附圖說(shuō)明

圖1為熒光探針加入汞離子前后的紫外變化圖譜；橫坐標(biāo)為紫外吸收波長(zhǎng)(nm)，縱坐標(biāo)為吸光度；

圖2為熒光探針加入汞離子后熒光激發(fā)與發(fā)射圖譜；橫坐標(biāo)為熒光發(fā)射波長(zhǎng)(nm)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度；

圖3為濃度為0.35nm的探針溶液使用britton-robinson緩沖溶液配置了一系列不同ph的緩沖溶液，檢測(cè)探針與離子絡(luò)合的最佳ph值；橫坐標(biāo)是ph，縱坐標(biāo)是熒光強(qiáng)度；

圖4為熒光探針濃度為0.35nm在水溶液中對(duì)不同的金屬離子(cd²⁺、al³⁺、cu²⁺、co²⁺、sn²⁺、ca²⁺、fe³⁺、zn²⁺、ba²⁺、mg²⁺、pb²⁺、bi⁺)選擇干擾性檢測(cè)的熒光響應(yīng)圖；橫坐標(biāo)為不同的金屬離子，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度；

圖5為熒光探針濃度0.35nm與汞離子絡(luò)合比的job-plot曲線；橫坐標(biāo)為c[hg²⁺]/c[hg²⁺+探針]，縱坐標(biāo)為熒光f-f0，其中f、f0是在460nm的熒光發(fā)射強(qiáng)度；

圖6為熒光探針濃度為3.5nm在水溶液中對(duì)汞離子的熒光光譜響應(yīng)圖；橫坐標(biāo)為熒光發(fā)射波長(zhǎng)(nm)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度；圖6中各曲線hg²⁺的濃度從低到高依次是0,4×10^-10mol/l，8×10^-10mol/l，2×10^-9mol/l，3×10^-9mol/l，4×10^-9mol/l，8×10^-9mol/l，10^-8mol/l，3×10^-8mol/l，5×10^-8mol/l，7×10^-8mol/l，9×10^-8mol/l，2×10^-7mol/l，5×10^-7mol/l，10^-6mol/l，10^-5mol/l，1.5×10^-5mol/l，2×10^-5mol/l；

圖7為熒光探針濃度為0.35nm在水溶液中對(duì)不同濃度汞離子在515nm處的熒光強(qiáng)度；橫坐標(biāo)為汞離子的濃度10^-5m，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度；

圖8為熒光探針濃度為0.35nm在水溶液中對(duì)汞離子的熒光光譜響應(yīng)時(shí)間圖；橫坐標(biāo)為響應(yīng)時(shí)間(min)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實(shí)施例1

本實(shí)施例的檢測(cè)汞離子水溶性高分子熒光素類熒光探針，其結(jié)構(gòu)式為：

n＝291，m＝9。

上述的檢測(cè)汞離子反應(yīng)型水溶性高分子熒光素類熒光探針的制備方法為：

(1)準(zhǔn)確稱取3.00g(9.0×10^-3mol)熒光素粉末(該熒光素為市售產(chǎn)品)置于裝有溫度計(jì)和冷凝管的100ml圓底三口燒瓶中，用量筒取20.0ml干燥的c2h4c12將熒光素粉末溶解得到熒光素溶液，再加3.0ml(0.02mol)三乙胺作為反應(yīng)的縛酸劑、磁力攪拌；為減少副反應(yīng)，將所得的混合液在-2℃～3℃冰水浴中充分冷卻，取1.00g(1.1×10^-2mol)丙烯酰氯溶于20.0mlc2h4c12中得到丙烯酰氯溶液，在30min內(nèi)將其緩慢滴加到上述混合液中；待丙烯酰氯的二氯甲烷溶液被滴加完后，撤去冰水浴，使混合液在室溫下攪拌反應(yīng)24h，通過(guò)點(diǎn)薄層色譜板監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，通過(guò)配不同體積比的氯仿/乙醇混合液點(diǎn)板比較反應(yīng)產(chǎn)物的比移值，最后選用體積比1:30的氯仿/乙醇混合液作為展開劑。結(jié)束反應(yīng)后，在溫度為25℃、真空度為101kpa的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1h除去部分溶劑得到桔黃色混合物。在45℃、真空度為101kpa的條件下真空干燥8小時(shí)，最終得到亮黃色固體3-丙烯?；鶡晒馑亍?/p>

(2)將3-丙烯?；鶡晒馑?0.373g，1.0mmol)溶解在20ml無(wú)水乙醇中，滴加80％水合肼溶液(0.3ml，5.7mmol)，控制溫度在79℃加熱回流反應(yīng)12h。在溫度為55℃、真空度為101kpa的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1h除去溶劑及未反應(yīng)的水合肼，產(chǎn)物用四氫呋喃多次重結(jié)晶，過(guò)濾，干燥得到淡黃色的丙烯酰氯熒光素酰肼(acfh)。ftir(kbr):ν＝3418cm^-1(-nh2),1681cm^-1(c＝o),1614cm^-1,1503cm^-1,1447cm^-1,(c＝c),2927cm^-1(ar-h),1175cm^-1(c-o),1111cm^-1(c-h的面內(nèi)彎曲).¹hnmr(400mhz,cdcl3):6.44(s,1h,＝ch2),6.65-8.02(m,10h,ar-h)。

(3)先將3.50×10^-2g(1.4×10^-4mol)丙烯?；鶡晒馑仵ｋ?acfh)、0.5000g(7.0×10^-3mol)丙烯酰胺(am)和3.1×10^-3g偶氮二異丁腈aibn(1.9×10^-5mol)溶解在10.0ml四氫呋喃中，再將混合溶液置于干燥的安瓿瓶中，通高純氮?dú)?5分鐘后封瓶，恒溫70℃反應(yīng)10h。反應(yīng)過(guò)程中可看到反應(yīng)瓶中有沉淀物析出。停止反應(yīng)后，抽濾反應(yīng)混合物可得黃色固體。將抽濾得到的固體用濾紙包裹置于索氏提取器中，用四氫呋喃做溶劑抽提以除去低聚物或未反應(yīng)的單體,后經(jīng)真空干燥，研磨得到黃色粉末熒光探針(pafm)，即上述的檢測(cè)汞離子反應(yīng)型熒光素類熒光探針。ftir(kbr):ν＝3418cm^-1(-nh2),1681cm^-1(c＝o),1614cm^-1,1503cm^-1,1447cm^-1(c＝c),2927cm^-1(ar-h),1175cm^-1(c-o),1111cm^-1(c-h的面內(nèi)彎曲)，1700cm^-1(o-c＝o),1537cm^-1(c-n).¹hnmr(400mhz,cdcl3):6.44(s,1h,＝ch2),6.65-8.02(m,10h,ar-h),4.37(m,4h,-nh2)，2.18(m,10h,ch2)。

實(shí)施例2

利用實(shí)施例1中的檢測(cè)汞離子反應(yīng)型水溶性高分子熒光素類熒光探針對(duì)離子進(jìn)行檢測(cè)：

圖1為熒光探針加入汞離子前后的紫外變化圖譜，從圖中可以看出：探針分子pafm本身在400-500nm處沒有紫外吸收峰，探針與汞離子絡(luò)合之后，在462nm和495nm處出現(xiàn)兩個(gè)吸收峰。

圖2為熒光探針加入汞離子后熒光激發(fā)與發(fā)射圖譜，從圖中可以看出：熒光探針與汞離子絡(luò)合后熒光激發(fā)波長(zhǎng)為460nm，熒光發(fā)射波長(zhǎng)為515nm。

圖3為濃度為0.35nm的探針溶液使用britton-robinson緩沖溶液配置了一系列不同ph的緩沖溶液，檢測(cè)探針與離子絡(luò)合的最佳ph值。如圖3所示，將所得的檢測(cè)汞離子的反應(yīng)型熒光素類熒光探針溶于水溶劑中配成10μm的探針溶液，加入britton-robinson緩沖溶液配置了一系列不同(ph＝2.18、3.15、4.09、4.64、5.96、6.55、7.0、8.77、8.90、9.56、11.07、11.58、12.01)ph的緩沖溶液，然后向探針溶液中加入1ml濃度為1x10^-4mm的汞離子，檢測(cè)不同ph條件下探針溶液熒光強(qiáng)度的變化。發(fā)現(xiàn)在ph＝7左右的時(shí)候熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，因此該熒光探針在水溶劑中，在ph＝7左右時(shí)探針溶液穩(wěn)定有利于檢測(cè)。

如圖4所示，做hg²⁺對(duì)pafm溶液的熒光滴定實(shí)驗(yàn)，對(duì)常見金屬離子cd²⁺、al³⁺、cu²⁺、co²⁺、sn²⁺、ca²⁺、fe³⁺、zn²⁺、ba²⁺、mg²⁺、pb²⁺、bi⁺進(jìn)行了熒光滴定。將熒光探針acfh溶于在水溶劑中，配成0.35nm熒光探針溶液，分別將hgcl2、cdcl2、al2(so4)3、cuso4、cocl2、sncl2、cacl2、fecl3、zn(no3)2、bacl2、mgso4、pb(no3)2、bino3溶于水溶劑中，配成10nm的hg²⁺、cd²⁺、al³⁺、cu²⁺、co²⁺、sn²⁺、ca²⁺、fe³⁺、zn²⁺、ba²⁺、mg²⁺、pb²⁺、bi⁺金屬離子溶液，進(jìn)行選擇干擾性檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)為460nm的條件下，檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)為515nm的熒光強(qiáng)度；實(shí)心柱為熒光探針pafm的濃度為0.35nm，分別對(duì)金屬離子(10^-7m)cd²⁺、al³⁺、cu²⁺、co²⁺、sn²⁺、ca²⁺、fe³⁺、zn²⁺、ba²⁺、mg²⁺、pb²⁺、bi⁺進(jìn)行了熒光滴定的熒光強(qiáng)度，空心柱為在pafm-hg²⁺(10^-5m)體系中分別加入金屬離子(10^-5m)cd²⁺、al³⁺、cu²⁺、co²⁺、sn²⁺、ca²⁺、fe³⁺、zn²⁺、ba²⁺、mg²⁺、pb²⁺、bi⁺進(jìn)行了熒光滴定的熒光強(qiáng)度。

如圖5所示，固定熒光探針和hg²⁺的濃度總和為50nm，通過(guò)改變二者的濃度比(熒光探針和汞離子物質(zhì)量的比依次為10：0，9：1，8：2，7：3，6：4，5：5，4：6，3：7，2：8，1：9，0：10)得到515nm處的熒光強(qiáng)度與該濃度下熒光探針自身熒光強(qiáng)度的差值，對(duì)離子占總濃度的比例作圖5。通過(guò)此圖可知當(dāng)hg²⁺所占比例為0.5時(shí)縱坐標(biāo)可以達(dá)到最高值，可以確定熒光探針與hg²⁺之間主要以1:1形式結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物。

如圖5所示，探針分子pafm(0.35nm)在存在其他離子(離子濃度為(10^-7m))時(shí)，除hg²⁺外，在pafm溶液中加入其它金屬離子后熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化。在干擾測(cè)試中，其它離子的加入對(duì)pafm-hg²⁺絡(luò)合體系的熒光強(qiáng)度的影響也不是很大。說(shuō)明pafm與hg²⁺能夠形成穩(wěn)定的絡(luò)合物。

如圖6所示，向熒光探針(0.35nm)溶液中加入不同濃度汞離子時(shí)，熒光探針溶液熒光發(fā)光光譜，發(fā)射峰在515nm。

如圖7所示，溶液在515nm處熒光發(fā)射峰強(qiáng)度隨著加入hg²⁺離子濃度的增大熒光強(qiáng)度變化。當(dāng)hg²⁺離子濃度達(dá)到10nm時(shí)，配體熒光探針的熒光強(qiáng)度幾乎不再隨離子濃度的增大而變化。

如圖8所示，響應(yīng)時(shí)間對(duì)pafm-hg²⁺的熒光強(qiáng)度的影響，當(dāng)pafm溶液中加入一定濃度的hg²⁺后，其復(fù)合物的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的增加不斷的變化。由此，可見最佳溶液檢測(cè)穩(wěn)定時(shí)間為3min。