本發(fā)明屬于生物、材料、生物檢測(cè)等交叉領(lǐng)域,主要涉及基于近紅外激發(fā)的恩諾沙星熒光探針的制備方法,尤其涉及一種集分離、凈化、富集以及熒光監(jiān)測(cè)于一體的基于近紅外激發(fā)的恩諾沙星熒光探針的制備方法。
背景技術(shù):
恩諾沙星(enrofloxacin,enr)屬于第三代氟喹諾酮類藥物,具有口服吸收好、組織穿透能力強(qiáng)、高效(在體內(nèi)代謝為具有抗菌活性的環(huán)丙沙星)、脂溶性好、低毒、抗菌譜廣(對(duì)霉形體和革蘭氏陰性菌效果強(qiáng),對(duì)革蘭氏陽性及厭氧菌效果較弱)、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)。然而,近年來研究表明enr可引起皮膚過敏及光毒性,也可對(duì)消化系統(tǒng)(上腹部隱痛、惡心、嘔吐)、神經(jīng)系統(tǒng)(眩暈、耳鳴、頭痛、煩躁、聽力下降、視力下降等)、心血管系統(tǒng)(心慌、心肌缺血、血壓升高等)、泌尿系統(tǒng)(腎毒性、血尿、尿素氮升高)及骨骼帶來損傷。
熒光探針是由分子識(shí)別元件與熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換元件偶聯(lián)而成的信息獲取技術(shù),通過選擇性分子識(shí)別實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物檢測(cè),無需對(duì)復(fù)雜樣品體系進(jìn)行分離,具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好、原位分析等優(yōu)點(diǎn),已成為檢測(cè)分析領(lǐng)域備受關(guān)注的研究課題。
熒光探針中的分子識(shí)別元件是探針的關(guān)鍵部分,決定著熒光探針的功能與質(zhì)量,主要包括酶、蛋白質(zhì)、抗體、生物膜、細(xì)胞等生物材料,但是這些材料對(duì)外界環(huán)境條件較為敏感,制備和純化條件苛刻,使其應(yīng)用受到限制。分子印跡聚合物是基于抗體形成理論制備而成,根據(jù)目標(biāo)物分子結(jié)構(gòu)人工合成的具有特異識(shí)別性能的高分子聚合物,又被稱為“仿生抗體”。與酶、蛋白、抗體等生物識(shí)別材料相比,分子印跡“仿生抗體”具有易制備、易保存、理化性質(zhì)穩(wěn)定、可重復(fù)使用等特點(diǎn),是更為理想的分子識(shí)別受體。
分子印跡熒光探針中的另一個(gè)重要構(gòu)成是熒光轉(zhuǎn)換元件。目前多以半導(dǎo)體量子點(diǎn)、金納米簇、石墨烯等為熒光轉(zhuǎn)換元件。這些材料的的熒光發(fā)射機(jī)理基于斯托克斯(stokes)發(fā)光定律,即通過高能量光(一般為紫外光)激發(fā)熒光探針,發(fā)出低能量熒光(紫外光或可見光)。這種基于stokes發(fā)光的熒光探針在實(shí)際應(yīng)用時(shí)極易出現(xiàn)光致褪色或受到其它具有熒光特性化學(xué)物質(zhì)的干擾,降低了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和檢測(cè)方法的靈敏度。
上轉(zhuǎn)換發(fā)光粒子是摻雜了稀土離子的化合物,該化合物可進(jìn)行雙光子吸收,具有反stokes發(fā)光特性,即可在低能量的近紅外或紅外光激發(fā)下發(fā)出高能量的紫外或可見熒光。與量子點(diǎn)等熒光轉(zhuǎn)換元件相比,該粒子具有發(fā)射光譜窄、stokes位移大、熒光壽命長(zhǎng)、光化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、抗干擾能力強(qiáng)、可同時(shí)發(fā)射多波長(zhǎng)熒光等特點(diǎn),是當(dāng)前最為理想的熒光轉(zhuǎn)換元件。
目前,以分子印跡聚合物為分子識(shí)別元件,以上轉(zhuǎn)換發(fā)光粒子為熒光轉(zhuǎn)換元件構(gòu)建熒光探針主要以物理結(jié)合方式為主,這通常會(huì)造成分子印跡聚合物在上轉(zhuǎn)換發(fā)光粒子表面包裹不均勻,且熒光探針在模板分子洗脫和實(shí)際應(yīng)用過程中上轉(zhuǎn)換發(fā)光粒子可能泄露等問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
發(fā)明目的
本發(fā)明旨在提供一種基于近紅外激發(fā)的恩諾沙星熒光探針的制備方法,其目的是為了解決恩諾沙星ucp@mip熒光探針在制備過程中mip分子識(shí)別層不均勻,ucp@mip熒光探針在模板洗脫和實(shí)際應(yīng)用過程中熒光源nayf4:er3+,yb3+泄露的問題。
本發(fā)明以enr分子印跡聚合物為分子識(shí)別元件,以功能化的上轉(zhuǎn)換粒子為熒光轉(zhuǎn)換元件構(gòu)建enr熒光探針,以980nm激光器為聚合引發(fā)光源,二苯甲酮為引發(fā)劑,構(gòu)建一種特異性強(qiáng)、熒光信號(hào)穩(wěn)定等新型熒光探針。
技術(shù)方案
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
基于近紅外激發(fā)的恩諾沙星熒光探針的制備方法,其特征在于:步驟如下:
(1)制備上轉(zhuǎn)換nayf4:er3+,yb3+(ucp)微粒:
將yb(no3)3、y(no3)3、和er(no3)3置于容器內(nèi),加入超聲除氧后的去離子水,攪拌使固體全部溶解后加入乙二胺四乙酸和naf,使用超聲方法使容器內(nèi)中的固體分散均勻后轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中,然后將反應(yīng)體系ph值調(diào)節(jié)到3.5,調(diào)節(jié)完畢后將反應(yīng)釜置于烘箱內(nèi)進(jìn)行水熱反應(yīng);水熱完畢后使反應(yīng)釜溫度自然降至室溫,分離溶液中合成的nayf4:er3+,yb3+微粒,用去離子水和乙醇洗滌3次,產(chǎn)物真空干燥后備用;
(2)制備功能化nayf4:er3+,yb3+微粒:
取步驟(1)制備的nayf4:er3+,yb3+微粒置于含有丙醇的容器中,然后加入氨水-水溶液,攪拌10分鐘后加入正硅酸乙酯,然后在35℃下反應(yīng),4h后逐滴加入γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷,1h后結(jié)束反應(yīng),離心分離產(chǎn)物,然后用去離子水和乙醇洗滌產(chǎn)物,干燥后備用;
(3)制備近紅外激發(fā)的恩諾沙星熒光探針(ucp@mip):
將步驟(2)制備的功能化nayf4:er3+,yb3+微粒與模板分子恩諾沙星置于玻璃容器中,分散溶劑為二氯甲烷和三乙胺,室溫下攪拌1~3h后,加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑,冰浴超聲分散6~12min,然后氮?dú)獬?0min,接下來將裝有反應(yīng)液的玻璃容器封口后置于980nm激光器下光聚合20h;聚合結(jié)束后離心分離得到ucp@mip產(chǎn)物;再用乙醇和去離子水反復(fù)洗滌產(chǎn)物5-10次,然后將其放入真空干燥箱中,30~50℃下真空干燥過夜;將干燥后的產(chǎn)物用甲醇-冰乙酸混合溶劑提取恩諾沙星,直至無恩諾沙星檢出為止;最后ucp@mip在40~45℃下真空干燥15~20h,得到干燥的ucp@mip熒光探針。
步驟(1)中yb(no3)3、y(no3)3和er(no3)3的摩爾比為1.692:6.6:0.177;yb(no3)3、乙二胺四乙酸和naf的摩爾比為1.692:6.6:40;yb(no3)3與去離子水的摩爾體積比為1.692mmol:80ml;體系加熱溫度為200℃,時(shí)間為24h;干燥溫度為35~50℃,干燥的時(shí)間為15~25h;調(diào)節(jié)ph值所用溶液為硝酸或氫氧化鈉。
步驟(2)中的nayf4:er3+,yb3+微粒與丙醇的質(zhì)量體積比為20mg:12ml;加入的氨水-水溶液中,氨水與水的體積比為1.5:4;加入的氨水-水溶液與nayf4:er3+,yb3+微粒的體積質(zhì)量比為5.5ml:20mg;nayf4:er3+,yb3+微粒與正硅酸乙酯的質(zhì)量體積比為20mg:25μl;nayf4:er3+,yb3+微粒與γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的質(zhì)量體積比為2mg:20μl,去離子水和乙醇洗滌的次數(shù)為5-10次;真空干燥的溫度為40~45℃,干燥的時(shí)間為24~30h。
步驟(3)中所述的交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯;所述的引發(fā)劑為二苯甲酮。
步驟(3)中功能化nayf4:er3+,yb3+微粒與模板分子恩諾沙星的質(zhì)量摩爾比為250mg:1mmol。
步驟(3)中功能化nayf4:er3+,yb3+微粒與交聯(lián)劑的質(zhì)量摩爾比為250mg:4mmol。
步驟(3)中功能化nayf4:er3+,yb3+微粒與引發(fā)劑的質(zhì)量比為250g:30mg。
步驟(3)中功能化nayf4:er3+,yb3+微粒與分散溶劑的質(zhì)量體積比為250mg:20.5ml。
步驟(3)中分散溶劑二氯甲烷與三乙胺體積比為20:0.5。
步驟(3)中甲醇-冰乙酸混合溶劑中甲醇與冰乙酸的體積比為8:2。
優(yōu)點(diǎn)及效果
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
以功能化nayf4:er3+,yb3+微球?yàn)楣δ軉误w制備的enr分子印跡熒光探針,避免了熒光探針在模板洗脫和實(shí)際應(yīng)用過程中nayf4:er3+,yb3+微球的泄露問題;以980nm激光器為光源引發(fā)聚合可使enr分子印跡聚合物緊密貼合在于nayf4:er3+,yb3+表面,且制備的enr分子印跡熒光探針對(duì)enr具有較快的吸附速率,熒光信號(hào)穩(wěn)定。
附圖說明
圖1為nayf4:er3+,yb3+和ucp@mip的xrd圖。圖中nayf4:er3+的特征峰與標(biāo)準(zhǔn)的nayf4特征峰衍射峰相吻合,表明制備的ucp的晶相結(jié)構(gòu)為六棱柱結(jié)構(gòu);ucp@mip的xrd的特征峰與nayf4:er3+,yb3+相似,說明nayf4:er3+,yb3+在分子印跡聚合物中保持了特征晶型,保持了良好熒光特性。
圖2為ucp@mip透射電鏡圖,由圖可知,分子印跡聚合物已成功在nayf4:er3+,yb3+粒子表面制備。
圖3為ucp@mip吸附動(dòng)力學(xué)圖,由圖可知,熒光探針對(duì)目標(biāo)物具有較快的吸附速率,在20min內(nèi)可達(dá)到吸附平衡。
圖4為ucp@mip和ucp@nips吸附enr和其他七種結(jié)構(gòu)類似物異丙腎上腺素、苯氧丙酚胺和特布他林的選擇性試驗(yàn)圖。結(jié)果表明:合成的ucp@mip探針對(duì)目標(biāo)分子rac有較好的選擇識(shí)別能力。
圖5為該enr熒光探針ucp@mip對(duì)enr識(shí)別性能的熒光表征圖。通過不同濃度的enr溶液對(duì)熒光探針的熒光猝滅強(qiáng)度,可說明ucp@mip熒光探針對(duì)目標(biāo)物enr具有較好的識(shí)別行為。
具體實(shí)施方式
下面參照附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明:
本發(fā)明以enr印跡聚合物為分子識(shí)別元件,以功能化的上轉(zhuǎn)換粒子為熒光轉(zhuǎn)換元件構(gòu)建enr熒光探針,以980nm激光器為聚合引發(fā)光源,二苯甲酮為引發(fā)劑制備了核殼型分子印跡熒光探針。
本發(fā)明是一種集分離、凈化、富集、熒光監(jiān)測(cè)功能于一體的恩諾沙星熒光探針的制備方法,功能化的nayf4:er3+,yb3+微粒為功能單體,以二甲基丙烯酸酯為功能單體,以二苯甲酮為引發(fā)劑,通過980nm激光引發(fā)聚合制備恩諾沙星熒光探針。本發(fā)明中,功能化的nayf4:er3+,yb3+微粒參與了聚合反應(yīng),克服了ucp@mip在洗脫模板分子和實(shí)際應(yīng)用過程中由于nayf4:er3+,yb3+分子泄露導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的降低,增加了磁性mips的使用次數(shù);另外本發(fā)明中的熒光探針是以980nm激光為激發(fā)光源,可激發(fā)出可見光區(qū)的熒光,這避免了以紫外光為激發(fā)光源的基質(zhì)自熒光的發(fā)生,提高了該熒光探針應(yīng)用時(shí)的特異性。
本發(fā)明提出了一種基于近紅外激發(fā)的恩諾沙星熒光探針的制備方法,步驟如下:
(1)制備上轉(zhuǎn)換nayf4:er3+,yb3+微粒:
將yb(no3)3、y(no3)3、和er(no3)3置于容器中,加入超聲除氧后的去離子水,攪拌使固體全部溶解后加入乙二胺四乙酸和naf,使用超聲方法使容器中的固體分散均勻后轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中,然后將反應(yīng)體系ph值調(diào)節(jié)到3.5,調(diào)節(jié)完畢后將反應(yīng)釜置于烘箱內(nèi)進(jìn)行水熱反應(yīng);水熱完畢后使反應(yīng)釜溫度自然降至室溫,分離溶液中合成的nayf4:er3+,yb3+微粒,用去離子水和乙醇洗滌3次,產(chǎn)物真空干燥后備用。
(2)制備功能化nayf4:er3+,yb3+微粒:
取步驟(1)制備的nayf4:er3+,yb3+微粒置于含有丙醇的容器中,然后加入氨水-水溶液,攪拌10分鐘后加入正硅酸乙酯,然后在35℃下反應(yīng),4h后逐滴加入γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷,1h后結(jié)束反應(yīng),離心分離產(chǎn)物得到功能化nayf4:er3+,yb3+微粒,然后用去離子水和乙醇洗滌產(chǎn)物,干燥后備用。
(3)制備近紅外激發(fā)的恩諾沙星熒光探針(ucp@mip):
將步驟(2)制備的功能化nayf4:er3+,yb3+微粒與模板分子恩諾沙星置于玻璃容器中,分散溶劑為二氯甲烷和三乙胺,室溫下攪拌1~3h后,加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑,冰浴超聲分散6~12min,然后氮?dú)獬?0min,接下來將裝有反應(yīng)液的玻璃容器封口后置于980nm激光器下光聚合20h;聚合結(jié)束后離心分離得到ucp@mip產(chǎn)物;再用乙醇和去離子水反復(fù)洗滌產(chǎn)物5-10次,然后將其放入真空干燥箱中,30~50℃下真空干燥過夜;將干燥后的產(chǎn)物用甲醇-冰乙酸混合溶劑提取恩諾沙星,直至無恩諾沙星檢出為止;最后ucp@mip在40~45℃下真空干燥15~20h,得到干燥的ucp@mip熒光探針。
步驟(1)中yb(no3)3,y(no3)3,和er(no3)3的摩爾比為1.692:6.6:0.177;yb(no3)3,乙二胺四乙酸和naf的摩爾比為1.692:6.6:40;yb(no3)3與去離子水的摩爾體積比為1.692mmol:80ml;體系加熱溫度為200℃,時(shí)間為24h;干燥溫度為35~50℃,干燥的時(shí)間為15~25h;調(diào)節(jié)ph值所用溶液為硝酸或氫氧化鈉。
步驟(2)中的nayf4:er3+,yb3+微粒與丙醇的質(zhì)量體積比為20mg:12ml;加入的氨水-水溶液中,氨水與水的體積比為1.5:4;加入的氨水-水溶液與nayf4:er3+,yb3+微粒的體積質(zhì)量比為5.5ml:20mg;nayf4:er3+,yb3+微粒與正硅酸乙酯的質(zhì)量體積比為20mg:25μl;nayf4:er3+,yb3+微粒與γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷的質(zhì)量體積比為2mg:20μl,去離子水和乙醇洗滌的次數(shù)為5-10次;真空干燥的溫度為40~45℃,干燥的時(shí)間為24~30h。
步驟(3)中所述的交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯。
步驟(3)中所述的引發(fā)劑為二苯甲酮。
步驟(3)中功能化nayf4:er3+,yb3+微粒與模板分子恩諾沙星的質(zhì)量摩爾比為250mg:1mmol。
步驟(3)中功能化nayf4:er3+,yb3+微粒與交聯(lián)劑的質(zhì)量摩爾比為250mg:4mmol;步驟(3)中功能化nayf4:er3+,yb3+微粒與引發(fā)劑的質(zhì)量比為250g:30mg。
步驟(3)中功能化nayf4:er3+,yb3+微粒與分散溶劑的質(zhì)量體積比為250mg:20.5ml。
步驟(3)中分散溶劑二氯甲烷與三乙胺20:0.5;步驟(3)中甲醇-冰乙酸混合溶劑中甲醇與冰乙酸的體積比為8:2。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明:
實(shí)施例1
一種基于近紅外激發(fā)的恩諾沙星熒光探針制的備方法,步驟如下:
(1)制備上轉(zhuǎn)換nayf4:er3+,yb3+微粒:
取1.692mmolyb(no3)3,6.6mmoly(no3)3和0.177mmoler(no3)3置于圓底燒瓶中,加入超聲除氧后的去離子水80ml,攪拌使固體全部溶解后加入6.6mmol乙二胺四乙酸和40mmolnaf,使用超聲方法使圓底燒瓶中的固體分散均勻后轉(zhuǎn)移至容量為100ml反應(yīng)釜中,然后用硝酸或氫氧化鈉溶液將反應(yīng)體系ph值調(diào)節(jié)到3.5,調(diào)節(jié)完畢后將反應(yīng)釜置于200℃烘箱內(nèi)進(jìn)行水熱反應(yīng)24h;水熱完畢后使反應(yīng)釜溫度自然降至室溫,分離溶液中合成的nayf4:er3+,yb3+,用去離子水和乙醇洗滌3次,產(chǎn)物在35℃的真空箱中干燥25h后備用。
(2)制備功能化nayf4:er3+,yb3+微粒:
取20mg步驟(1)制備的nayf4:er3+,yb3+微粒置于含有12ml丙醇的燒瓶中,然后加入5.5ml氨水-水溶液(1.5:4;v/v),加入的氨水-水溶液與nayf4:er3+,yb3+微粒的體積質(zhì)量比為5.5ml:20mg;攪拌10分鐘后加入25μl正硅酸乙酯,然后在35℃下反應(yīng),4h后逐滴加入200μlγ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷,1h后結(jié)束反應(yīng),離心分離產(chǎn)物得到功能化nayf4:er3+,yb3+微粒,然后用去離子水和乙醇洗滌產(chǎn)物5~10次;在40℃真空干燥箱中干燥30h后備用。
(3)制備近紅外激發(fā)的恩諾沙星熒光探針(ucp@mip):
將250mg步驟(2)制備的功能化nayf4:er3+,yb3+微粒與1mmol模板分子恩諾沙星置于圓底燒瓶中,分散溶劑為20.5ml二氯甲烷和三乙胺(20:0.5;v/v),室溫下攪拌1~3h后,加入4mmol的交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.03mg的引發(fā)劑二苯甲酮,冰浴超聲分散6~12min,然后氮?dú)獬?0min,接下來將裝有反應(yīng)液的圓底燒瓶置于980nm激光器下光聚合20h;聚合結(jié)束后離心分離得到ucp@mip產(chǎn)物;再用乙醇和去離子水反復(fù)洗滌產(chǎn)物5-10次,然后將其放入真空干燥箱中,30℃下真空干燥過夜;將干燥后的產(chǎn)物用體積比為8:2的甲醇-冰乙酸混合溶劑提取恩諾沙星,直至無恩諾沙星檢出為止;最后ucp@mip在40℃下真空干燥20h,得到干燥的ucp@mip熒光探針。
實(shí)施例2
一種基于近紅外激發(fā)的恩諾沙星熒光探針制的備方法,步驟如下:
(1)制備上轉(zhuǎn)換nayf4:er3+,yb3+微粒:
取1.692mmolyb(no3)3,6.6mmoly(no3)3和0.177mmoler(no3)3置于圓底燒瓶中,加入超聲除氧后的去離子水80ml,攪拌使固體全部溶解后加入6.6mmol乙二胺四乙酸和40mmolnaf,使用超聲方法使圓底燒瓶中的固體分散均勻后轉(zhuǎn)移至容量為100ml反應(yīng)釜中,然后用硝酸或氫氧化鈉溶液將反應(yīng)體系ph值調(diào)節(jié)到3.5,調(diào)節(jié)完畢后將反應(yīng)釜置于200℃烘箱內(nèi)進(jìn)行水熱反應(yīng)24h;水熱完畢后使反應(yīng)釜溫度自然降至室溫,分離溶液中合成的nayf4:er3+,yb3+,用去離子水和乙醇洗滌3次,產(chǎn)物在50℃的真空箱中干燥15h后備用。
(2)制備功能化nayf4:er3+,yb3+微粒:
取20mg步驟(1)制備的nayf4:er3+,yb3+微粒置于含有12ml丙醇的燒瓶中,然后加入5.5ml氨水-水溶液(1.5:4;v/v),加入的氨水-水溶液與nayf4:er3+,yb3+微粒的體積質(zhì)量比為5.5ml:20mg;攪拌10分鐘后加入25μl正硅酸乙酯,然后在35℃下反應(yīng),4h后逐滴加入200μlγ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷,1h后結(jié)束反應(yīng),離心分離產(chǎn)物得到功能化nayf4:er3+,yb3+微粒,然后用去離子水和乙醇洗滌產(chǎn)物5~10次;在45℃真空干燥箱中干燥24h后備用。
(3)制備近紅外激發(fā)的恩諾沙星熒光探針(ucp@mip):
將250mg步驟(2)制備的功能化nayf4:er3+,yb3+微粒與1mmol模板分子恩諾沙星置于圓底燒瓶中,分散溶劑為20.5ml二氯甲烷和三乙胺(20:0.5;v/v),室溫下攪拌1~3h后,加入4mmol的交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.03mg的引發(fā)劑二苯甲酮,冰浴超聲分散6~12min,然后氮?dú)獬?0min,接下來將裝有反應(yīng)液的圓底燒瓶置于980nm激光器下光聚合20h;聚合結(jié)束后離心分離得到ucp@mip產(chǎn)物;再用乙醇和去離子水反復(fù)洗滌產(chǎn)物5-10次,然后將其放入真空干燥箱中,50℃下真空干燥過夜;將干燥后的產(chǎn)物用體積比為8:2的甲醇-冰乙酸混合溶劑提取恩諾沙星,直至無恩諾沙星檢出為止;最后ucp@mip在45℃下真空干燥15h,得到干燥的ucp@mip熒光探針。
實(shí)施例3
一種基于近紅外激發(fā)的恩諾沙星熒光探針制的備方法,步驟如下:
(1)制備上轉(zhuǎn)換nayf4:er3+,yb3+微粒:
取1.692mmolyb(no3)3,6.6mmoly(no3)3和0.177mmoler(no3)3置于圓底燒瓶中,加入超聲除氧后的去離子水80ml,攪拌使固體全部溶解后加入6.6mmol乙二胺四乙酸和40mmolnaf,使用超聲方法使圓底燒瓶中的固體分散均勻后轉(zhuǎn)移至容量為100ml反應(yīng)釜中,然后用硝酸或氫氧化鈉溶液將反應(yīng)體系ph值調(diào)節(jié)到3.5,調(diào)節(jié)完畢后將反應(yīng)釜置于200℃烘箱內(nèi)進(jìn)行水熱反應(yīng)24h;水熱完畢后使反應(yīng)釜溫度自然降至室溫,分離溶液中合成的nayf4:er3+,yb3+,用去離子水和乙醇洗滌3次,產(chǎn)物在38℃的真空箱中干燥20h后備用。
(2)制備功能化nayf4:er3+,yb3+微粒:
取20mg步驟(1)制備的nayf4:er3+,yb3+微粒置于含有12ml丙醇的燒瓶中,然后加入5.5ml氨水-水溶液(1.5:4;v/v),加入的氨水-水溶液與nayf4:er3+,yb3+微粒的體積質(zhì)量比為5.5ml:20mg;攪拌10分鐘后加入25μl正硅酸乙酯,然后在35℃下反應(yīng),4h后逐滴加入200μlγ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷,1h后結(jié)束反應(yīng),離心分離產(chǎn)物得到功能化nayf4:er3+,yb3+微粒,然后用去離子水和乙醇洗滌產(chǎn)物5~10次;在42℃真空干燥箱中干燥27h后備用。
(3)制備近紅外激發(fā)的恩諾沙星熒光探針(ucp@mip):
將250mg步驟(2)制備的功能化nayf4:er3+,yb3+微粒與1mmol模板分子恩諾沙星置于圓底燒瓶中,分散溶劑為20.5ml二氯甲烷和三乙胺(20:0.5;v/v),室溫下攪拌1~3h后,加入4mmol的交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.03mg的引發(fā)劑二苯甲酮,冰浴超聲分散6~12min,然后氮?dú)獬?0min,接下來將裝有反應(yīng)液的圓底燒瓶置于980nm激光器下光聚合20h;聚合結(jié)束后離心分離得到ucp@mip產(chǎn)物;再用乙醇和去離子水反復(fù)洗滌產(chǎn)物5-10次,然后將其放入真空干燥箱中,40℃下真空干燥過夜;將干燥后的產(chǎn)物用體積比為8:2的甲醇-冰乙酸混合溶劑提取恩諾沙星,直至無恩諾沙星檢出為止;最后ucp@mip在42℃下真空干燥18h,得到干燥的ucp@mip熒光探針。
實(shí)施例4
恩諾沙星ucp@nip(nip為非印記聚合物)非印跡熒光探針的制備方法:實(shí)施條件與實(shí)施例1相同,不同的是沒有加入恩諾沙星模板分子。
采用x射線衍射(xrd)對(duì)合成的nayf4:er3+,yb3+和ucp@mip進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。由圖1中xrd圖譜可知nayf4:er3+的特征峰與標(biāo)準(zhǔn)的nayf4特征峰衍射峰相吻合,表明制備的ucp的晶相結(jié)構(gòu)為六棱柱結(jié)構(gòu);ucp@mip的xrd的特征峰與nayf4:er3+,yb3+相似,說明nayf4:er3+,yb3+在分子印跡聚合物中保持了特征晶型,保持了良好熒光特性。采用透射電鏡對(duì)合成的ucp@mip表征,可知分子印跡聚合物已成功在nayf4:er3+,yb3+粒子表面制備。
實(shí)驗(yàn)例1:
將9份20mgucp@mip分別加入含有5ml濃度為20mg/l的恩諾沙星甲醇溶液中,然后室溫下把該9份混合物在水平振蕩器上以400rpm轉(zhuǎn)速下振蕩5、10、15、20、25、30、40、50、60分鐘。振蕩時(shí)間結(jié)束后,用孔徑為0.22微米的濾膜過濾收集濾液,未吸附的恩諾沙星分子濃度用高效液相色譜測(cè)定,根據(jù)結(jié)果計(jì)算吸附容量。結(jié)果如圖3所示,可知制備的恩諾沙星ucp@mip對(duì)目標(biāo)物具有較快的吸附速率,在實(shí)驗(yàn)濃度下能在15分鐘左右可達(dá)到吸附平衡。
實(shí)驗(yàn)例2:
為了考察ucp@mip熒光探針對(duì)模板分子恩諾沙星的特異性吸附,選擇恩諾沙星的七個(gè)結(jié)構(gòu)類似物氟羅沙星(flx),培氟沙星(pef),諾氟沙星(nor),環(huán)丙沙星(cip),羅氟哌酸(lom),氟哌酸(eno),司氟沙星(spa)。具體操作如下:
準(zhǔn)確稱取ucp@mip和ucp@nip(非印跡聚合物)20mg于50ml容量瓶中,加入10ml3mg/l的enr,flx,pef,nor,cip,lom,eno,spa的甲醇溶液,水平振蕩儀以300rmp轉(zhuǎn)速下吸附60分鐘。振蕩時(shí)間結(jié)束后,用孔徑為0.22微米的濾膜過濾收集濾液,未吸附的萊克多巴胺分子濃度用高效液相色譜測(cè)定,根據(jù)結(jié)果計(jì)算吸附容量。結(jié)果如圖4所示,可見制備的ucp@mip熒光探針對(duì)目標(biāo)物恩諾沙星(enr)具有較高的特異性。
實(shí)驗(yàn)例3:
為了考察ucp@mip熒光探針對(duì)目標(biāo)物恩諾沙星的熒光猝滅能力,稱取恩諾沙星熒光探針20mg置于石英比色皿中,然后加入4ml含有不同濃度的恩諾沙星甲醇溶液,孵育40分鐘后用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光探針與目標(biāo)物恩諾沙星的響應(yīng)(日立f7000型熒光分光光度計(jì)(日本);激發(fā)波長(zhǎng)980nm,在515nm-560nm范圍內(nèi)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù))。表明制備的恩諾沙星ucp@mip熒光探針對(duì)目標(biāo)物恩諾沙星具有較好的識(shí)別行為。