本發(fā)明涉及有機(jī)探針分子技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多功能近紅外熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

硫醇(即，含巰基的化合物)在生命系統(tǒng)中起到非常重要的作用，例如，谷胱甘肽(gsh)可以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原、細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)換等，半胱氨酸(cys)可以作為細(xì)胞外的還原劑，合成蛋白質(zhì)的決定性底物等。某些硫醇的水平與許多疾病(如牛皮癬、肝臟損傷、艾滋病)和癌癥有直接關(guān)聯(lián)。

細(xì)胞內(nèi)的ph在酶活性、細(xì)胞增殖和調(diào)亡、抗藥性、離子傳輸、細(xì)胞內(nèi)吞作用以及肌肉收縮等一系列組織活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用。例如，腫瘤發(fā)生時(shí)細(xì)胞內(nèi)ph會(huì)發(fā)生變化。細(xì)胞功能和ph值的這種微妙關(guān)系意味著只要能掌握細(xì)胞內(nèi)ph值的變化就可以為相關(guān)的生理和病理過程研究提供重要的信息。

相對(duì)于其他檢測方法，使用熒光探針法進(jìn)行ph檢測或硫醇的檢測具有靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，但目前大部分ph探針或硫醇的波長較短，不能避開組織自吸收和自熒光，背景干擾較強(qiáng)，部分stocks位移小，紫外吸收波譜和熒光光譜重疊較大，信噪比低，毒性較大，不能用于細(xì)胞和活體ph檢測。而近紅外熒光探針的最大吸收波長和發(fā)射波長為600～900nm，可避免背景干擾。因此，近紅外熒光檢測在生物樣品分析中有明顯的優(yōu)越性。

目前既可以檢測硫醇，又可檢測ph的近紅外熒光探針的報(bào)道非常少。因此，設(shè)計(jì)合成具有大的stokes位移、背景干擾少的多功能熒光探針具有非常重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種多功能近紅外熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。該探針的最大發(fā)射波長在765nm，能有效避開組織的自吸收和自發(fā)熒光，最大激發(fā)為540nm，stocks位移高達(dá)225nm，背景干擾少、信噪比較高，該探針對(duì)硫醇有較高的靈敏度、高選擇性，另外，該探針還可在兩個(gè)不同激發(fā)波長下測定熒光強(qiáng)度比率，可以減少或消除其他測試參數(shù)或系統(tǒng)誤差對(duì)硫醇的熒光檢測準(zhǔn)確度的干擾。同時(shí)，該探針的pka為6.4，探針的毒性低，對(duì)細(xì)胞和活體傷害較小，很適合用來進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的ph檢測，所述多功能近紅外熒光探針為雙響應(yīng)型探針，能同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)ph值和硫醇的檢測。

本發(fā)明第一方面提供了一種多功能近紅外熒光探針，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(ⅰ)所示：

式(ⅰ)中，x¹為-s-或-se-，r'為c1-12的亞烷基，x²為-c(ch3)2-、-o-、-s-或-se-，r1和r2分別獨(dú)立地選自h原子、c1-18烷基或如so3r9所示的基團(tuán)，其中，r9為c1-18烷基或芐基，r3和r4分別獨(dú)立地選自c1-18烷基或芐基，r5、r6、r7和r8分別獨(dú)立地選自c1-18烷基或含有f、cl、br、i、o和s中的至少一種的c1-18烷基，y1和y2分別獨(dú)立地選自f、cl、br或i。

本發(fā)明中，所述y1與所述y2可以相同，也可以不同。

優(yōu)選地，所述x¹為-s-。

優(yōu)選地，所述r'為-ch2ch2-。

優(yōu)選地，所述x²為-c(ch3)2-。

優(yōu)選地，所述y1為i。

優(yōu)選地，所述r1和所述r2均為h原子。

優(yōu)選地，所述r3和所述r4均為乙基。

優(yōu)選地，所述r5、r6、r7和r8均為乙基。

優(yōu)選地，所述y2為cl。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述x¹為-s-，所述r'為-ch2ch2-，所述x²為-c(ch3)2-，所述y1為i，所述r1和所述r2均為h原子，所述r3、所述r4、所述r5、所述r6、所述r7和所述r8均為乙基。

本發(fā)明中所述多功能近紅外熒光探針，基于fret(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)機(jī)理，將吸收光譜和發(fā)射光譜有一定重疊的花菁類熒光染料和羅丹明類染料通過含二硫鍵或二硒鍵的連接體-nh-r'-x¹-x¹-r'-nh-(x¹為-s-或-se-)連接起來，由于所述花菁染料的吸收峰與所述羅丹明類染料的發(fā)射峰有重疊，該探針內(nèi)發(fā)生從供體羅丹明類染料到受體花菁類染料的fret而表現(xiàn)出熒光，該最大發(fā)射波長在765nm，能有效避開組織的自吸收和自發(fā)熒光，最大激發(fā)為540nm，stocks位移高達(dá)225nm，背景干擾少、信噪比較高。

該探針中的二硫鍵或二硒鍵可以作為硫醇分子的反應(yīng)位點(diǎn)，當(dāng)在硫醇分子存在下，硫醇會(huì)與之發(fā)生基團(tuán)交換反應(yīng)導(dǎo)致二硫鍵或二硒鍵斷裂導(dǎo)致fret過程終斷，從而使該探針分子的熒光光譜發(fā)生改變，以實(shí)現(xiàn)選擇性地檢測硫醇。另外，在硫醇分子存在下，該探針在最大熒光發(fā)射波長765nm和熒光發(fā)射波長為575nm左右的兩處熒光強(qiáng)度發(fā)生改變，可以作為一個(gè)比率型探針以實(shí)現(xiàn)檢測硫醇，并能減少以及消除幾種決定因素的變化對(duì)測量熒光強(qiáng)度的影響，包括探針濃度、激發(fā)光的光路長度、激發(fā)強(qiáng)度等；可消除的人工假象包括光漂白、探針滲漏、細(xì)胞厚度、探針在細(xì)胞內(nèi)(區(qū)室化作用引起)或不同細(xì)胞群之間(負(fù)載效率差異造成)的不均勻分布等，提高檢測的準(zhǔn)確度。

此外，所述探針在堿性條件下，該探針分子內(nèi)與花菁類熒光染料相連的連接體上的n原子未被質(zhì)子化，相應(yīng)氮原子上存在的孤對(duì)電子可以發(fā)生光致電子轉(zhuǎn)移(pet)而猝滅花菁熒光團(tuán)的熒光，該探針沒有熒光或顯示很弱的熒光，當(dāng)ph降低時(shí)，所述氮原子逐漸被質(zhì)子化，pet逐漸被阻斷，對(duì)花菁熒光團(tuán)的熒光猝滅作用逐漸減弱，該探針逐漸表現(xiàn)出花菁類染料的熒光。在ph為6-8，在花菁類染料的激發(fā)波長下，探針的熒光強(qiáng)度隨著ph的降低而逐漸增強(qiáng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)ph的檢測。另外，所述近紅外熒光探針pka為6.4，很適合用來進(jìn)行腫瘤的檢測。

本發(fā)明第一方面提供的所述多功能近紅外熒光探針的最大發(fā)射波長在765nm，能有效避開組織的自吸收和自發(fā)熒光，最大激發(fā)為540nm，stocks位移高達(dá)225nm，背景干擾少、信噪比較高，該探針對(duì)硫醇有較高的靈敏度、高選擇性，另外，該探針還可在兩個(gè)不同激發(fā)波長下測定熒光強(qiáng)度比率，可以減少或消除其他測試參數(shù)或系統(tǒng)誤差對(duì)硫醇的熒光檢測準(zhǔn)確度的干擾。同時(shí)，該探針的pka為6.4，探針的毒性低，對(duì)細(xì)胞和活體傷害較小，很適合用來進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的ph檢測。所述多功能近紅外熒光探針為雙響應(yīng)型探針，能同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)ph值和硫醇的檢測。該探針還可進(jìn)行光聲成像和光動(dòng)力治療，是一個(gè)集多模態(tài)成像、診斷-治療為一體的多功能探針。

本發(fā)明第二方面提供了一種多功能近紅外熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

(1)取化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(ⅱ)所示的化合物，以及如式(ⅲ)所示化合物的鹽酸鹽或其硫酸鹽，

將如式(ⅱ)所示的化合物與如式(ⅲ)所示化合物的鹽酸鹽或其硫酸鹽按照摩爾比為1：(1-3)的比例溶解在第一溶劑中，再加入縛酸劑，保護(hù)氣體氛圍下，在30-75℃下反應(yīng)4-10h，提純后得到第一化合物，所述第一化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(ⅰ)所示：

式(ⅰ)、式(ⅲ)和式(ⅰ)中，x¹為-s-或-se-，r'為c1-12的亞烷基，x²為-c(ch3)2-、-o-、-s-或-se-，r1和r2分別獨(dú)立地選自h原子、c1-18烷基或如so3r9所示的基團(tuán)，其中，r9為c1-18烷基或芐基，r3和r4分別獨(dú)立地選自c1-18烷基或芐基，y1為f、cl、br或i；

(2)提供化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(ⅳ)所示的化合物，

式(ⅳ)中，r5、r6、r7和r8分別獨(dú)立地選自c1-18烷基或含有f、cl、br、i、o和s中的至少一種的c1-18烷基，y2為f、cl、br或i；

取所述第一化合物溶于第二溶劑，并加入活化劑、縮合劑，并加入如式(ⅳ)所示的化合物，在30-80℃下進(jìn)行酰胺化反應(yīng)4-10h，提純后得到多功能近紅外熒光探針，其中，所述第一化合物與所述式(ⅳ)所示的化合物的摩爾比為1：(1-2)，所述多功能近紅外熒光探針的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(ⅰ)所示：

式(ⅰ)中，x¹為-s-或-se-，r'為c1-12的亞烷基，x²為-c(ch3)2-、-o-、-s-或-se-，r1和r2分別獨(dú)立地選自h原子、c1-18烷基或如so3r9所示的基團(tuán)，其中，r9為c1-18烷基或芐基，r3和r4分別獨(dú)立地選自c1-18烷基或芐基，r5、r6、r7和r8分別獨(dú)立地選自c1-18烷基或含有f、cl、br、i、o和s中的至少一種的c1-18烷基，y1和y2分別獨(dú)立地選自f、cl、br或i。

優(yōu)選地，所述x¹為-s-。

優(yōu)選地，所述r'為-ch2ch2-。

優(yōu)選地，所述x²為-c(ch3)2-。

優(yōu)選地，所述y1為i。

優(yōu)選地，所述r1和所述r2均為h原子。

優(yōu)選地，所述r3和所述r4均為乙基。

優(yōu)選地，所述r5、r6、r7和r8均為乙基。

優(yōu)選地，所述y2為cl。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述x¹為-s-，所述r'為-ch2ch2-，所述x²為-c(ch3)2-，所述y1為i，所述r1和所述r2均為h原子，所述r3、所述r4、所述r5、所述r6、所述r7和所述r8均為乙基。

本發(fā)明中，所述如式(ⅲ)所示化合物的鹽酸鹽或其硫酸鹽，為如式(ⅲ)所示化合物的鹽酸鹽形式，或如式(ⅲ)所示化合物的硫酸鹽形式。舉例來說，當(dāng)式(ⅲ)中，所述x¹為-s-，所述r'為-ch2ch2-時(shí)，式(ⅲ)所示化合物的鹽酸鹽形式為(cas號(hào)為：56-17-17，又稱為胱銨二鹽酸鹽)；式(ⅲ)所示化合物的硫酸鹽形式為

優(yōu)選地，所述將如式(ⅱ)所示的化合物與如式(ⅲ)所示化合物的鹽酸鹽或其硫酸鹽按照摩爾比為1：(1-3)的比例溶解在第一溶劑中，再加入縛酸劑，具體為：

將所述式(ⅲ)所示化合物的鹽酸鹽或其硫酸鹽和縛酸劑溶解在第一溶劑中，得到第一混合溶液，將所述式(ⅱ)所示的化合物溶解在第一溶劑中，得到第二混合溶液，然后將所述第二混合溶液逐滴加入到第一混合溶液中。

優(yōu)選地，所述第一溶劑為n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、乙腈和甲醇的一種或多種。

優(yōu)選地，所述縛酸劑為三乙胺、n，n-二異丙基乙胺(dipea)或吡啶。

優(yōu)選地，步驟(1)中，所述縛酸劑與所述化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(ⅱ)的化合物的摩爾比為(2-6)：1。

優(yōu)選地，所述保護(hù)氣體為氮?dú)狻鍤饣蚝狻?/p>

優(yōu)選地，所述提純的方法為：反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)后的反應(yīng)液旋蒸除去溶劑，并再加入二氯甲烷，采用濕法過硅膠柱，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液進(jìn)行梯度洗脫，除去溶劑，即得所述多功能近紅外熒光探針。

優(yōu)選地，步驟(2)中，所述活化劑包括n-羥基琥珀酰亞胺(簡稱為nhs)、n-羥基硫代琥珀酰亞胺和1-羥基苯并三氮唑(hobt)中的任意一種。

優(yōu)選地，步驟(2)中，所述縮合劑包括n，n-二環(huán)己基碳二酰亞胺(簡稱dcc)、n,n-二異丙基碳二亞胺(簡稱dic)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亞胺鹽酸鹽(簡稱edc)中的任意一種。

如本發(fā)明所述的，所述活化劑又可稱為催化劑，常與所述縮合劑聯(lián)用，用于酰胺的合成。羧酸化合物與碳二亞胺類縮合劑的加成中間體并不穩(wěn)定，若不用?；呋瘎┺D(zhuǎn)化為相應(yīng)的活化酯或活性酰胺，則會(huì)通過自身重排形成副產(chǎn)物。

更優(yōu)選地，所述活化劑包括n-羥基琥珀酰亞胺(簡稱為nhs)。

更優(yōu)選地，所述縮合劑包括n，n-二環(huán)己基碳二酰亞胺(簡稱dcc)。

優(yōu)選地，所述第二溶劑包括二氯甲烷、乙腈和甲醇中的一種或多種。

本發(fā)明第二方面提供的一種多功能近紅外熒光探針的制備方法，該制備方法簡單易操作，可以得到集熒光成像、光聲成像為一體、對(duì)ph和硫醇分子均有響應(yīng)的多功能近紅外探針。

本發(fā)明第三方面提供了第一方面所述的多功能近紅外熒光探針在檢測硫醇和檢測ph中的應(yīng)用。

所述多功能近紅外熒光探針內(nèi)存在fret效應(yīng)而表現(xiàn)出熒光，其最大發(fā)射波長在765nm，能有效避開組織的自吸收和自發(fā)熒光，最大激發(fā)為540nm，stocks位移高達(dá)225nm，在熒光成像和光聲成像模式下的背景干擾少、信噪比較高。

在硫醇分子存在下，該探針內(nèi)的fret效應(yīng)被破壞，導(dǎo)致探針的熒光光譜發(fā)生改變，可以作為比率型探針實(shí)現(xiàn)對(duì)硫醇的選擇性檢測。

本發(fā)明中，所述硫醇包括含巰基的化合物，如谷胱甘肽，半胱氨酸，二硫蘇糖醇和苯硫酚中的一種或多種，但不限于此。

另外，該探針的pka為6.4，對(duì)ph也有響應(yīng)，很適合用來進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的ph檢測。

所述多功能近紅外熒光探針的毒性低，對(duì)細(xì)胞和活體傷害較小，可以制備成檢測硫醇和檢測ph的藥物，以用于細(xì)胞內(nèi)硫醇和ph的檢測。

本發(fā)明第四方面提供了第一方面所述的多功能近紅外熒光探針制備腫瘤光動(dòng)力治療藥物中的應(yīng)用。

所述多功能近紅外熒光探針還具有光聲和光動(dòng)力效果，可以對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤進(jìn)行光聲成像和光動(dòng)力治療，是一個(gè)集多模態(tài)成像、診斷-治療為一體的多功能探針。

綜上，本發(fā)明所述的多功能近紅外熒光探針可用于制備腫瘤檢測、診斷、治療或診療的藥物。所述藥物中，除包括所述多功能近紅外熒光探針外，還可以包括其他能用于腫瘤檢測、治療或診療的藥物。

綜上，本發(fā)明提供的一種多功能近紅外熒光探針及其制備方法和應(yīng)用的有益效果包括以下幾個(gè)方面：

(1)所述多功能近紅外熒光探針的激發(fā)、發(fā)射波長均在近紅外區(qū)，對(duì)細(xì)胞或組織的穿透力強(qiáng)，樣本損傷小，該探針的stocks位移大，對(duì)硫醇和ph均有響應(yīng)，在成像應(yīng)用中的背景干擾小，信噪比較高；

(2)所述多功能近紅外熒光探針的制備方法簡單易操作；

(3)所述多功能近紅外熒光探針在用于檢測硫醇和ph時(shí)，為一比率型探針，可以消除減少或消除其他測試參數(shù)或系統(tǒng)誤差對(duì)熒光檢測準(zhǔn)確度的干擾；

(4)所述多功能近紅外熒光探針在用于制備腫瘤光動(dòng)力治療藥物時(shí)，能有效減小腫瘤體積。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1制得的第一化合物s1的高分辨質(zhì)譜圖；

圖2為實(shí)施例1制得的多功能近紅外熒光探針的高分辨質(zhì)譜圖；

圖3為實(shí)施例1制得的多功能近紅外熒光探針的核磁共振氫譜圖；

圖4為實(shí)施例1制得的探針的熒光強(qiáng)度隨谷胱甘肽(gsh)濃度的變化曲線圖；

圖5為實(shí)施例1制得的探針在發(fā)射波長765nm、576nm處的熒光強(qiáng)度比值i765nm/i576nm與gsh濃度的關(guān)系圖，其中，圖5中的內(nèi)圖為相應(yīng)的線性關(guān)系圖；

圖6為在濃度為5μm的實(shí)施例1制得的探針的溶液中加入不同的活性分子后，探針在i765nm/i576nm值的變化；

圖7為實(shí)施例1制得的探針的熒光強(qiáng)度隨ph的變化曲線圖；

圖8為實(shí)施例1制得的探針在發(fā)射波長為765nm處的熒光強(qiáng)度與不同ph的熒光強(qiáng)度圖；

圖9為實(shí)施例1制得的探針對(duì)ph的可逆性測試結(jié)果圖；

圖10為實(shí)施例1制得的探針的細(xì)胞毒性測試結(jié)果圖；

圖11為實(shí)施例1制得的探針對(duì)hela細(xì)胞內(nèi)硫醇的熒光成像圖；

圖12為實(shí)施例1制得的探針對(duì)荷瘤老鼠的熒光成像圖；

圖13為實(shí)施例1制得的探針對(duì)荷瘤老鼠的光聲成像圖；

圖14為實(shí)施例1制得的探針對(duì)荷瘤老鼠的光動(dòng)力治療效果圖。

具體實(shí)施方式

以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：

一種多功能近紅外熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

(1)第一化合物s1的合成：

s1的合成路線：

s1的合成步驟如下：

室溫下，在25ml圓底燒瓶中加入胱胺二鹽酸鹽(162mg,0.72mmol)、1.5ml甲醇、416μl三乙胺(3mmol)，再加入2ml乙腈，快速攪拌約0.5小時(shí)后，溶液變透明，胱胺二鹽酸鹽全部溶解，得到第一混合溶液；

然后把(簡寫為cy.7.cl，383mg,0.6mmol)溶解在4ml的乙腈中，得到第二混合溶液，然后將其用滴液漏斗滴加到上述第一混合溶液中，滴加速度大概為1滴/20s，加熱，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下35℃下反應(yīng)4小時(shí)。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)后的反應(yīng)液旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)品，用硅膠柱純化，將粗產(chǎn)品用二氯甲烷溶解，采用濕法上樣，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫劑二氯甲烷：甲醇的體積比從200:1變至到20:1，旋去溶劑濃縮后，得到靛藍(lán)色粉末狀固體，該靛藍(lán)色粉末狀固體為第一化合物s1(41.2mg，0.055mmol)，產(chǎn)率：9.1％，該第一化合物s1的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為

對(duì)實(shí)施例1的該步驟制得的第一化合物s1進(jìn)行質(zhì)譜測試，測試結(jié)果如圖1所示，圖1為實(shí)施例1制得的第一化合物s1的高分辨質(zhì)譜圖。從圖1中可以看出，通過質(zhì)譜測出的分子離子峰m⁺為627.3551，符合c38h51n4s2⁺的理論分子量(627.3550)。

(2)第二化合物s2的合成：

s2的合成路線：

s2的合成步驟如下：

將偏苯三酸酐(2.46g，12.8mmol)和3-羥基-n,n-二乙基苯胺(1.86g，11.3mmol)加入到100ml的圓底燒瓶中，加熱至180℃，反應(yīng)3小時(shí)，然后冷卻至室溫，再加入3-羥基-n,n-二乙基苯胺(1.86g，11.3mmol)和5ml的濃磷酸，繼續(xù)加熱，在180℃下再反應(yīng)3小時(shí)后，停止反應(yīng)，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，將反應(yīng)后的物料直接倒進(jìn)150ml的飽和食鹽水中并劇烈攪拌，加入氫氧化鈉溶液調(diào)至中性后，再用二氯甲烷萃取，合并有機(jī)相，旋去溶劑，得到暗紅色固體粉末，該暗紅色固體粉末為第二化合物s2(4.1g，8.13mmol)，產(chǎn)率：72％，該第二化合物s2的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為

(3)多功能近紅外探針rhosscy的合成：

具體合成步驟如下：

在25ml的圓底燒瓶中加入第一化合物s1(25.18mg，0.05mmol)，并加入2ml的二氯甲烷、28μl的三乙胺、12.36mg的dcc、6.9mg的nhs，在室溫下快速攪拌至第一化合物s1完全溶解，得到第三混合溶液；

然后把第二化合物s2(75.48mg，0.1mmol)用4ml的二氯甲烷溶解，加入到上述第三混合溶液中，于35℃下反應(yīng)，6小時(shí)后停止反應(yīng)，將反應(yīng)后的反應(yīng)液旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)品，用硅膠柱純化，將粗產(chǎn)品用二氯甲烷溶解，采用濕法上樣，洗脫劑用二氯甲烷：甲醇從200:1到10:1的體積比進(jìn)行梯度洗脫，旋去溶劑濃縮后，得到藍(lán)色粉末狀固體，該藍(lán)色粉末狀固體即為多功能近紅外探針rhosscy(10.4mg，0.0085mmol)，產(chǎn)率：17％。

該探針rhosscy的合成路線為：

對(duì)實(shí)施例1得到的多功能近紅外熒光探針(rhosscy)進(jìn)行uplc-tof-ms質(zhì)譜(超高壓液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀)測試，測試結(jié)果如圖2所示，圖2為實(shí)施例1制得的探針的高分辨質(zhì)譜hrms(ei)圖。從圖2中可以看出，通過質(zhì)譜測出該探針rhosscy的分子離子峰m⁺為1095.5600，符合c67h79n6o4s2⁺的理論分子量1095.5604。

圖3為實(shí)施例1制得的多功能近紅外熒光探針rhosscy的核磁共振氫譜圖；從圖3中可以看出1hnmr(400mhz,cd3od,tms)δ8.58(s,1h),δ8.08(d,j＝6.87,1h),δ7.92(d,j＝12.98,2h),δ7.38(d,j＝5.50,2h),δ7.32(t,j＝14.35,2h),δ7.19(d,j＝9.16,2h),δ7.10(t,j＝14.12hz,4h),δ6.98(s,2h),δ6.96(s,2h),δ5.91(d,j＝12.59hz,2h),δ4.15(t,j＝10.15hz,2h),δ4.03(q,j＝10.46hz,4h),δ3.80(t,j＝11.04hz,2h),δ3.68(d,j＝6.47hz,8h),δ3.19(t,j＝10.69hz,2h),δ3.04(t,j＝11.85hz,2h),δ2.58(t,j＝10.81hz,4h),δ1.88(t,j＝10.46hz,2h),δ1.70(s,12h),δ1.33(t,j＝7.05hz,18h)。圖3的核磁譜圖結(jié)果表明，本實(shí)施例成功地制備得到多功能近紅外熒光探針。

實(shí)施例2：

一種多功能近紅外熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

(1)第一化合物s1的合成：

s1的合成步驟如下：

室溫下，在25ml圓底燒瓶中加入胱胺二鹽酸鹽(135mg,0.6mmol)、1.5ml甲醇、166.4μl三乙胺(1.2mmol)，再加入2ml乙腈，快速攪拌約0.5小時(shí)后，溶液變透明，胱胺二鹽酸鹽全部溶解，得到第一混合溶液；

然后把(簡寫為cy.7.cl，383.1mg,0.6mmol)溶解在4ml的乙腈中，得到第二混合溶液，然后將其用滴液漏斗滴加到上述第一混合溶液中，滴加速度大概為1滴/20s，加熱，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下30℃下反應(yīng)6小時(shí)。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)后的反應(yīng)液旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)品，用硅膠柱純化，將粗產(chǎn)品用二氯甲烷溶解，采用濕法上樣，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫劑二氯甲烷：甲醇的體積比從200:1變至到20:1，旋去溶劑濃縮后，得到靛藍(lán)色粉末狀固體，該靛藍(lán)色粉末狀固體為第一化合物s1(95.98mg，0.13mmol)，產(chǎn)率：10.6％。

(2)第二化合物s2的合成：

s2的合成步驟如下：

將偏苯三酸酐(2.46g，12.8mmol)和3-羥基-n,n-二乙基苯胺(1.86g，11.3mmol)加入到100ml的圓底燒瓶中，加熱至180℃，反應(yīng)3小時(shí)，然后冷卻至室溫，再加入3-羥基-n,n-二乙基苯胺(1.86g，11.3mmol)和5ml的濃磷酸，繼續(xù)加熱，在180℃下再反應(yīng)6小時(shí)后，停止反應(yīng)，待反應(yīng)體系冷卻至室溫后，將反應(yīng)后的物料直接倒進(jìn)100ml的飽和食鹽水中并劇烈攪拌，加入氫氧化鈉溶液調(diào)至中性后，再用二氯甲烷萃取，合并有機(jī)相，旋去溶劑，得到暗紅色固體粉末，該暗紅色固體粉末為第二化合物s2(4.6g，9.15mmol)，產(chǎn)率：81％，該第二化合物s2的化學(xué)結(jié)構(gòu)式為

(3)多功能近紅外探針rhosscy的合成：

具體合成步驟如下：

在25ml的圓底燒瓶中加入第一化合物s1(25.18mg，0.05mmol)，并加入2ml的二氯甲烷、28μl的三乙胺、12.36mg的dcc、6.9mg的nhs，在室溫下快速攪拌至第一化合物s1完全溶解，得到第三混合溶液；

然后把第二化合物s2(18.87mg，0.05mmol)用4ml的二氯甲烷溶解，加入到上述第三混合溶液中，于80℃下回流反應(yīng)，6小時(shí)后停止反應(yīng)，將反應(yīng)后的反應(yīng)液旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)品，用硅膠柱純化，將粗產(chǎn)品用二氯甲烷溶解，采用濕法上樣，洗脫劑用二氯甲烷：甲醇從200:1到10:1的體積比進(jìn)行梯度洗脫，旋去溶劑濃縮后，得到藍(lán)色粉末狀固體，該藍(lán)色粉末狀固體即為多功能近紅外探針rhosscy(5.2mg，0.00425mmol)，產(chǎn)率：17％。

實(shí)施例3：

一種多功能近紅外熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

(1)第一化合物s1的合成：

s1的合成步驟如下：

室溫下，在25ml圓底燒瓶中加入胱胺二鹽酸鹽(135mg,0.6mmol)、1.5ml甲醇、332.8μl三乙胺(2.4mmol)，再加入2ml乙腈，快速攪拌約0.5小時(shí)后，溶液變透明，胱胺二鹽酸鹽全部溶解，得到第一混合溶液；

然后把(簡寫為cy.7.cl，383.1mg,0.6mmol)溶解在4ml的乙腈中，得到第二混合溶液，然后將其用滴液漏斗滴加到上述第一混合溶液中，滴加速度大概為1滴/20s，加熱，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下40℃下反應(yīng)5小時(shí)。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)后的反應(yīng)液旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)品，用硅膠柱純化，將粗產(chǎn)品用二氯甲烷溶解，采用濕法上樣，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫劑二氯甲烷：甲醇的體積比從200:1變至到20:1，旋去溶劑濃縮后，得到靛藍(lán)色粉末狀固體，該靛藍(lán)色粉末狀固體為第一化合物s1(146.69mg，0.20mmol)，產(chǎn)率：16.2％。

(2)第二化合物s2的合成同實(shí)施例1；

(3)多功能近紅外探針rhosscy的合成：

在25ml的圓底燒瓶中加入第一化合物s1(25.18mg，0.05mmol)，并加入2ml的二氯甲烷、28μl的三乙胺、12.36mg的dcc、6.9mg的nhs，在室溫下快速攪拌至第一化合物s1完全溶解，得到第三混合溶液；

然后把第二化合物s2(56.61mg，0.075mmol)用4ml的二氯甲烷溶解，加入到上述第三混合溶液中，于40℃下反應(yīng)，6小時(shí)后停止反應(yīng)，將反應(yīng)后的反應(yīng)液旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)品，用硅膠柱純化，將粗產(chǎn)品用二氯甲烷溶解，采用濕法上樣，洗脫劑用二氯甲烷：甲醇從200:1到10:1的體積比進(jìn)行梯度洗脫，旋去溶劑濃縮后，得到藍(lán)色粉末狀固體，該藍(lán)色粉末狀固體即為多功能近紅外探針rhosscy(7.0mg，0.00575mmol)，產(chǎn)率：23％。

實(shí)施例4：

一種多功能近紅外熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

(1)第一化合物s1的合成：

s1的合成步驟如下：

室溫下，在25ml圓底燒瓶中加入胱胺二鹽酸鹽(135mg,0.6mmol)、1.5ml甲醇、499.2μl三乙胺(3.6mmol)，再加入2ml乙腈，快速攪拌約0.5小時(shí)后，溶液變透明，胱胺二鹽酸鹽全部溶解，得到第一混合溶液；

然后把(簡寫為cy.7.cl，383.1mg,0.6mmol)溶解在4ml的乙腈中，得到第二混合溶液，然后將其用滴液漏斗滴加到上述第一混合溶液中，滴加速度大概為1滴/20s，加熱，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下75℃下反應(yīng)10小時(shí)。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)后的反應(yīng)液旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)品，用硅膠柱純化，將粗產(chǎn)品用二氯甲烷溶解，采用濕法上樣，用二氯甲烷和甲醇的混合溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫劑二氯甲烷：甲醇的體積比從200:1變至到20:1，旋去溶劑濃縮后，得到靛藍(lán)色粉末狀固體，該靛藍(lán)色粉末狀固體為第一化合物s1(87.83mg，0.12mmol)，產(chǎn)率：9.7％。

(2)第二化合物s2的合成同實(shí)施例2；

(3)多功能近紅外探針rhosscy的合成：

在25ml的圓底燒瓶中加入第一化合物s1(25.18mg，0.05mmol)，并加入2ml的二氯甲烷、28μl的三乙胺、12.36mg的dcc、6.9mg的nhs，在室溫下快速攪拌至第一化合物s1完全溶解，得到第三混合溶液；

然后把第二化合物s2(75.48mg，0.1mmol)用4ml的二氯甲烷溶解，加入到上述第三混合溶液中，于30℃下反應(yīng)，4小時(shí)后停止反應(yīng)，將反應(yīng)后的反應(yīng)液旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)品，用硅膠柱純化，將粗產(chǎn)品用二氯甲烷溶解，采用濕法上樣，洗脫劑用二氯甲烷：甲醇從200:1到10:1的體積比進(jìn)行梯度洗脫，旋去溶劑濃縮后，得到藍(lán)色粉末狀固體，該藍(lán)色粉末狀固體即為多功能近紅外探針rhosscy(6.4mg，0.00525mmol)，產(chǎn)率：21％。

效果實(shí)施例

探針對(duì)谷胱甘肽(gsh)溶液的熒光響應(yīng)

將實(shí)施例1制得的多功能近紅外熒光探針(rhosscy)配置成濃度為20μm的dmso/pbs(20mm,ph＝7.4,v/v＝9:l)的測試溶液100ml，每次取0.5ml加入已配好的不同濃度的谷胱甘肽(gsh)溶液，使探針rbsscy分子的終濃度為10μm，谷胱甘肽終濃度分別為0μm，1μm，2μm，3μm，4μm，5μm，6μm，7μm，8μm，9μm，10μm，11μm，12μm，13μm，14μm，15μm，16μm，17μm，18μm，19μm，20μm，40μm，60μm，80μm，100μm，200μm，500μm測試探針的熒光強(qiáng)度與谷胱甘肽濃度的變化關(guān)系，結(jié)果如圖4-5所示。圖4為實(shí)施例1制得的探針在540nm的激發(fā)波長下，其熒光強(qiáng)度隨谷胱甘肽(gsh)濃度的變化曲線圖；圖5為實(shí)施例1制得的探針在540nm的激發(fā)波長下，發(fā)射波長765nm、576nm處的熒光強(qiáng)度比值i765nm/i576nm與gsh濃度的關(guān)系圖，其中，圖5中的內(nèi)圖為相應(yīng)的線性關(guān)系圖。

從圖4-圖5可以看出，隨著gsh的加入，探針rhosscy在最大發(fā)射波長765nm的熒光強(qiáng)度逐漸降低，其在576nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)；并且，該探針在發(fā)射波長765nm、576nm處的熒光強(qiáng)度比值i765nm/i576nm的值隨著gsh濃度的增加而逐漸漸變，經(jīng)擬合發(fā)現(xiàn)，在gsh的濃度為0-10μm時(shí)，探針rhosscy的熒光強(qiáng)度隨gsh濃度有規(guī)律的變化，經(jīng)過擬合，發(fā)現(xiàn)探針rhosscy的濃度為5μm，gsh濃度在0.1-8μm時(shí)，探針的i765nm/i576nm的比值與gsh的濃度有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.99729，經(jīng)計(jì)算得，gsh的檢測下限是0.1μm。

探針對(duì)硫醇分子的選擇性

圖6為在濃度為5μm的探針rhosscy分子溶液中分別加入了不同的活性小分子(濃度為1mm)后的熒光強(qiáng)度在i765nm/i576nm值的變化，所述活性分子包括ser(絲氨酸)、gly(甘氨酸)、ala(丙氨酸)、leu(亮氨酸)、phe(苯丙氨酸)、glu(谷氨酸)、lys(賴氨酸)、arg(精氨酸)、tyr(酪氨酸)、glc(葡萄糖)、cys(半胱氨酸)、hcy(同型半胱氨酸)、gsh(谷胱甘肽)。

從圖6可以看出，該探針對(duì)含有巰基的硫醇分子，如cys、hcy、gsh均有良好的響應(yīng)型，加入硫醇分子均能使該探針的i765nm/i576nm值降低。

探針對(duì)ph的響應(yīng)性

將實(shí)施例1制得的多功能近紅外熒光探針配置于ph為5～10的hepes緩沖液(含10％的二甲基亞砜(dmso))中，探針的濃度為5μm，在640nm的激發(fā)波長下測試其熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖7、8所示，其中，圖7為實(shí)施例1制得的探針在640nm的激發(fā)波長下的熒光強(qiáng)度隨ph的變化曲線圖；圖8為實(shí)施例1制得的探針在640nm的激發(fā)波長下、發(fā)射波長為765nm處的熒光強(qiáng)度與不同ph的熒光強(qiáng)度圖。從圖中可以看出，在ph為5-6，探針在最大發(fā)射波長765nm處的熒光強(qiáng)度略有下降，但變化不明顯，但ph從6-8，探針在765nm處的熒光強(qiáng)度劇烈下降，以上說明，本發(fā)明實(shí)施例制得的多功能近紅外探針對(duì)ph具有明顯的響應(yīng)。

由于細(xì)胞內(nèi)ph值往往發(fā)生振蕩變化，并且非均勻分布，因此檢測ph的探針具有可逆響應(yīng)能力十分重要。因此我們還對(duì)本發(fā)明制得的具有ph響應(yīng)的恢復(fù)型近紅外熒光探針對(duì)ph響應(yīng)的可逆性進(jìn)行了測試。實(shí)驗(yàn)中循環(huán)調(diào)節(jié)測試溶液的ph，使其ph在5和10之間振蕩，并反復(fù)測試其熒光光譜。結(jié)果如圖9所示，圖9為實(shí)施例1制得的探針對(duì)ph的可逆性測試結(jié)果圖。結(jié)果表明，本發(fā)明實(shí)施例制得的多功能近紅外探針的熒光至少在6個(gè)循環(huán)內(nèi)在相同的ph下保持穩(wěn)定，表明該探針具有較好的可逆響應(yīng)ph的能力，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)ph振蕩變化的有效響應(yīng)。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

以hela細(xì)胞為例，考察不同濃度的實(shí)施例1制得的多功能近紅外熒光探針的細(xì)胞毒性，具體操作如下：

將實(shí)施例1制得的多功能近紅外熒光探針配置在牛血清溶液中，分別配成濃度為0.1μm、1μm、10μm、30μm、60μm、90μm的各組，通過mtt法進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞毒性的結(jié)果如圖10所示，從圖10可以看出，探針在濃度0.1-10μm時(shí)，細(xì)胞存活率高達(dá)85％以上，這說明該探針的毒性很低，可以用于細(xì)胞內(nèi)硫醇和ph的檢測。

體外腫瘤細(xì)胞內(nèi)的硫醇檢測

采用實(shí)施例1制得的多功能近紅外熒光探針對(duì)hela細(xì)胞內(nèi)的硫醇進(jìn)行檢測，將該探針配制在牛血清中，控制探針的最終濃度為5μm，使用leicatcssp5共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光成像，收集576±25mn和756±25nm波長范圍內(nèi)的熒光，得到白光和熒光圖像，細(xì)胞成像過程中所用激發(fā)光波長為543nm。結(jié)果如圖11所示。圖11中，a組圖(a1-a4)為在hela細(xì)胞內(nèi)加入硫醇清除劑除去細(xì)胞內(nèi)硫醇分子后的熒光成像圖片，b組圖(b1-b4)為在hela細(xì)胞內(nèi)沒有加硫醇清除劑即細(xì)胞內(nèi)存在硫醇分子時(shí)的熒光成像圖片。a1列和b1列是羅丹明的紅光通道，a2列和b2列是七甲川菁染料的藍(lán)光通道，a3列和b3列分別是a組、b組在明場視野下觀察到的細(xì)胞形態(tài)，說明給藥后的細(xì)胞形態(tài)是否完整、狀態(tài)是否良好；a4列和b4分別是a1-a3,b1-b3的疊加，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)完整細(xì)胞的定位。

從a1列可以看出雖然細(xì)胞內(nèi)ph發(fā)生了變化，但是探針分子中羅丹明的熒光強(qiáng)度并沒有發(fā)生改變，而從a2列我們可以看出隨著細(xì)胞內(nèi)ph的降低，探針分子中七甲川菁染料部分(cy.7)的熒光逐漸增強(qiáng)，這與在溶液中的熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖8)是一致的，說明探針可以應(yīng)用于檢測細(xì)胞中的ph變化探針。b組中，隨著ph的變化，b1和b2也出現(xiàn)同樣的效果。此外，還說明硫醇分子的存在與否，幾乎不干擾該探針用于測試ph。

由于b組在hela細(xì)胞內(nèi)沒有加硫醇清除劑，即細(xì)胞內(nèi)存在硫醇分子，所以探針rhosscy與硫醇分子反應(yīng)，fret效應(yīng)被破壞，羅丹明的熒光增強(qiáng)，七甲川菁染料的熒光減弱，所以從11圖中看到b1列細(xì)胞的熒光要比a1列的熒光強(qiáng)很多，而b2列細(xì)胞的熒光則相對(duì)于a2列的熒光較弱。

以上對(duì)比說明，該探針對(duì)hela細(xì)胞內(nèi)的硫醇分子有很好的檢測效果，為其應(yīng)用于生物活體內(nèi)硫醇的檢測奠定了基礎(chǔ)。

動(dòng)物活體內(nèi)ph的檢測

將實(shí)施例1制得的多功能近紅外熒光探針配制成濃度0.04mg/ml的pbs溶液，采用裸鼠作為研究對(duì)象，對(duì)荷瘤老鼠進(jìn)行0.2mg/kg劑量的探針尾椎靜脈注射,將探針注入荷瘤老鼠體內(nèi)，并對(duì)注射0min、30min、16h、18h內(nèi)的腫瘤部位的成像效果如圖12所示，紅光激發(fā)，采集700-900nm的熒光信號(hào)。從如圖12可以看出，注射該探針溶液之后，探針rhosscy分子在老鼠體內(nèi)經(jīng)由血液循環(huán)進(jìn)行分布，首先到達(dá)心臟和肝臟，30min時(shí)，在心臟部位的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，已經(jīng)可以通過體內(nèi)成像系統(tǒng)清晰地觀察到老鼠體內(nèi)很強(qiáng)的熒光，隨著血液的循環(huán)，探針rhosscy分子在老鼠體內(nèi)非常迅速地進(jìn)行分布，心臟部位的熒光逐漸減弱，腫瘤部位的熒光逐漸增強(qiáng)，在注射18小時(shí)時(shí)，腫瘤部位發(fā)射出的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他部位，而且非常清晰，成功檢測出小鼠腫瘤部位?？梢钥闯?，雖然裸鼠體內(nèi)的熒光強(qiáng)度在注射后30min達(dá)到最大，但是即使在注射后18小時(shí)仍然可以看到清晰的熒光，也說明了探針rhosscy分子在體內(nèi)具有長時(shí)間的成像性能，有力地改善了花菁染料在體內(nèi)溶液中易光漂白的缺點(diǎn)。從體內(nèi)成像照片也可以看出，探針rhosscy分子的吸收光和熒光發(fā)射都在近紅外區(qū)域使得它在進(jìn)行體內(nèi)熒光成像時(shí)完全不受生物體內(nèi)的背景熒光干擾,并且對(duì)組織的穿透也非常好。結(jié)果表明，該近紅外探針rhosscy在腫瘤的檢測中具有巨大的價(jià)值，另外，小動(dòng)物活體成像具有較高的靈敏度，能夠客觀地評(píng)價(jià)熒光探針rhosscy的靶向顯象過程以及檢測效果。

圖13為實(shí)施例1制得的探針對(duì)荷瘤老鼠的光聲成像圖，將實(shí)施例1制得的多功能近紅外熒光探針配制成濃度0.04mg/ml的pbs溶液，采用裸鼠作為研究對(duì)象，對(duì)荷瘤老鼠進(jìn)行0.2mg/kg劑量的探針尾椎靜脈注射，將探針注入荷瘤老鼠體內(nèi)，并對(duì)注射0h、0.5h、4h、17h、24h內(nèi)的腫瘤部位進(jìn)行成像，采集近紅外區(qū)域(690,740,760,780，800和900nm)的光聲信號(hào)，結(jié)果如圖13所示。a組圖為0-24小時(shí)內(nèi)對(duì)荷瘤老鼠的光聲成像圖，b圖為相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的光聲信號(hào)強(qiáng)度。從兩圖中均可以看出，在注射該探針后第17小時(shí)，腫瘤部位的光聲信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最大，成像效果顯著。

圖14為實(shí)施例1制得的探針對(duì)荷瘤老鼠的光動(dòng)力治療效果圖。圖中“圓點(diǎn)”代表的光照組是僅對(duì)荷瘤老鼠進(jìn)行光照(未加探針)；“正三角形”組為加探針但未進(jìn)行光照組；“倒三角形”為加探針并光照組，具體為將該探針配制成濃度為5μm的pbs溶液，在荷瘤老鼠的腫瘤進(jìn)行原位注射，并采用功率30mw·cm²、波長為660nm的激光照射5分鐘，總共進(jìn)行一次光照，然后測試15天內(nèi)的腫瘤的大小變化。

從圖14可以明顯看出，給荷瘤小鼠注射所述探針并光照后，腫瘤逐漸減小，治療9天后腫瘤明顯減小，而其他三組的腫瘤均持續(xù)增大。對(duì)比說明，本探針對(duì)荷瘤老鼠有顯著的光動(dòng)力治療效果。當(dāng)所述探針受到660nm的激光照射時(shí)，吸收光子能量，由基態(tài)變成激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的光敏物質(zhì)很不穩(wěn)定，迅速經(jīng)過化學(xué)退激過程釋放出能量而返回基態(tài)，其化學(xué)退激過程可以生成活性氧物種，其中最主要的是單線態(tài)氧(¹o2)，活性氧作為主要細(xì)胞毒劑能與多種生物大分子相互作用，損傷病變細(xì)胞結(jié)構(gòu)或影響其功能，因而所述探針能對(duì)腫瘤產(chǎn)生治療作用。

以上表征說明，本發(fā)明提供的多功能近紅外熒光探針既可以用于檢測細(xì)胞內(nèi)ph，又可檢測硫醇分子，還可進(jìn)行光聲成像和光動(dòng)力治療，是一個(gè)集多模態(tài)成像、診斷-治療為一體的多功能探針。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。