本發(fā)明涉及一種熒光探針及其制備方法，以及其在水溶液中、凝膠中和細(xì)胞中檢測(cè)核酸G-四鏈體二級(jí)結(jié)構(gòu)的用途。

背景技術(shù)：

核酸不但是一切生物細(xì)胞的基本成分，還對(duì)生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、遺傳及變異等重大生命現(xiàn)象起主宰作用。核酸大分子分為兩類(lèi)：脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，在蛋白質(zhì)的復(fù)制和合成中起著儲(chǔ)存和傳遞遺傳信息的作用。

G-四鏈體(G-quadruplex)是一種特殊的核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)。人類(lèi)基因組中很多富鳥(niǎo)嘌呤區(qū)域具有形成這一結(jié)構(gòu)的能力，包括端粒末端鳥(niǎo)嘌呤重復(fù)序列，以及多種基因的啟動(dòng)子區(qū)域，如c-kit、c-myc、c-myb、bcl-2、PDGF、kRAS、VEGF、Rb和胰島素基因等。G-四鏈體結(jié)構(gòu)具有多態(tài)性，鏈的數(shù)量和取向、loop的連接方式以及鳥(niǎo)嘌呤的糖苷扭轉(zhuǎn)角以及與羰基負(fù)電中心配位的金屬離子等多方面決定了G-四鏈體的類(lèi)型和構(gòu)象，這些差異性也為蛋白和小分子化合物提供了多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。根據(jù)鏈的取向不同，G-四鏈體分為正平行，反平行與混合型三種構(gòu)象。

G-四鏈體結(jié)構(gòu)的形成對(duì)于體內(nèi)的一系列生理過(guò)程都存在調(diào)控作用。研究證明，某些啟動(dòng)子區(qū)域的G-四鏈體結(jié)構(gòu)會(huì)顯著影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，因此G-四鏈體結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是起到分子開(kāi)關(guān)的功能，其形成和拆散可能涉及到信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖等一系列體內(nèi)重要的生理過(guò)程。所以，在體內(nèi)或者體外試驗(yàn)中，能夠特異性地檢測(cè)出G-四鏈體結(jié)構(gòu)的存在或者形成，對(duì)于研究G-四鏈體結(jié)構(gòu)的相關(guān)生物學(xué)功能以及開(kāi)發(fā)以G-四鏈體結(jié)構(gòu)為靶點(diǎn)的抗癌藥物等方面都具有非常重要的作用。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于核酸標(biāo)記的要求越來(lái)越高，以往通過(guò)同位素效應(yīng)來(lái)進(jìn)行DNA分子測(cè)序的方法已經(jīng)無(wú)法滿(mǎn)足需求，而熒光標(biāo)記作為一種具有檢測(cè)速度快、重復(fù)性好、用樣量少、無(wú)輻射等優(yōu)點(diǎn)的標(biāo)記技術(shù)受到廣泛重視，并取得迅速發(fā)展。最近Feng課題研究組利用2，6-二甲基吡啶作為原料合成出了吡啶二乙烯衍生物C61，選擇性地在活細(xì)胞核染色，使細(xì)胞核發(fā)出綠色熒光，是優(yōu)良的活細(xì)胞DNA熒光探針。但是，C61不能從其他形式的核酸分子中有效地識(shí)別G-四鏈體二級(jí)結(jié)構(gòu)，因而選擇性較差限制了C61的應(yīng)用。為了改良TO的選擇性，我們?cè)O(shè)計(jì)得到了一類(lèi)結(jié)構(gòu)新穎的，且對(duì)核酸G-四鏈體結(jié)構(gòu)專(zhuān)一性強(qiáng)的的熒光探針。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種熒光探針。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述探針的制備方法。

本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供上述探針在檢測(cè)水溶液中、凝膠中和細(xì)胞中G-四鏈體結(jié)構(gòu)的應(yīng)用。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的：

本發(fā)明提供了一種熒光探針，其結(jié)構(gòu)式為下式I所示：

式中R₁選自-----H、

本發(fā)明同時(shí)提供了上述探針的制備方法，表示如下：

或者

具體步驟為：

先用環(huán)丁砜、碘甲烷反應(yīng)，得到化合物(或)；再將在正丁醇中，與4-甲基哌啶，不同側(cè)鏈反應(yīng)，得到對(duì)應(yīng)產(chǎn)物最終產(chǎn)物

本發(fā)明還提供了上述探針在檢測(cè)水溶液中、凝膠中和細(xì)胞中G-四鏈體結(jié)構(gòu)的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的探針由于具有較大的電子共軛體系和平面，探針?lè)肿觾?nèi)的電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)的強(qiáng)弱可以影響分子的熒光發(fā)射強(qiáng)度。當(dāng)與G-四鏈體結(jié)構(gòu)發(fā)生特異性的作用后，分子內(nèi)的可轉(zhuǎn)動(dòng)的雙鍵的柔性受到限制，使分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)增強(qiáng)，熒光也有明顯增強(qiáng)。同時(shí)，該類(lèi)探針的分子結(jié)構(gòu)的柔性的共軛平面，具有可以轉(zhuǎn)動(dòng)的鍵，使其可以比較容易堆積在G四分體的平面上，進(jìn)而與G-四鏈體具有較強(qiáng)的作用力，同時(shí)與其他二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸作用較弱。所以，將該探針與不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸混合時(shí)，如果該核酸是G-四鏈體結(jié)構(gòu)時(shí)，其與探針?lè)肿娱g的特異性作用，產(chǎn)生熒光光譜的改變。當(dāng)核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)為其他結(jié)構(gòu)時(shí)，則不會(huì)產(chǎn)生明顯的信號(hào)變化。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)該類(lèi)探針制備簡(jiǎn)單，易得，并且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，便于儲(chǔ)存。

(2)本發(fā)明提供的探針具有較低的生物毒性、光毒性和光漂白性，且光穩(wěn)定性佳。

(3)本發(fā)明提供的探針具有良好的水溶性和良好的細(xì)胞膜通透性。

(4)本發(fā)明提供的探針的光譜范圍與生物樣品的光譜范圍有足夠大的差異，在非G-四鏈體存在的溶液及細(xì)胞內(nèi)具有較低的熒光背景。

(5)本發(fā)明提供的探針可以特異性地檢測(cè)識(shí)別G-四鏈體結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了G-四鏈體結(jié)

構(gòu)與其他二級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)分，用簡(jiǎn)單的熒光光譜儀，甚至只需普通紫外燈照射下，肉眼觀察就可以識(shí)別出核酸樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)，快捷，操作簡(jiǎn)便，成本低廉，并且可以實(shí)現(xiàn)實(shí)地檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1為探針3c與random，4A4T，LQ1，telo2四種核酸在1∶1濃度下的熒光譜。

圖2為探針3c滴定G-四鏈體DNA(telo21)的熒光光譜。

圖3為探針3c滴定G-四鏈體DNA(telo21)的熒光光譜中DNA濃度c與(F-F₀)/F₀的擬合曲線(xiàn)。

圖4為探針3c浸染雙鏈DNA(ds26)和G-四鏈體DNA(telo21)的聚丙酰胺凝膠電泳圖。

圖5為探針3c和染料DAPI染PC3細(xì)胞的細(xì)胞成像圖。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)具體的實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。通過(guò)熒光光譜實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明涉及的化合物6a由于具有較大的電子共軛體系和平面，與G-四鏈體結(jié)構(gòu)發(fā)生特異性的堆積作用后，熒光光譜發(fā)生明顯變化，熒光強(qiáng)度增加，甚至只需普通紫外燈照射下，肉眼觀察，同時(shí)與其他二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸作用較弱，沒(méi)有明顯的熒光信號(hào)響應(yīng)，使該類(lèi)探針具有很好的特異性識(shí)別作用。所以，我們將該探針與不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的DNA混合時(shí)，當(dāng)該DNA為G-四鏈體結(jié)構(gòu)時(shí)，其與探針?lè)肿娱g的特異性作用，產(chǎn)生熒光光譜的改變。當(dāng)DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)為其他結(jié)構(gòu)時(shí)，則不會(huì)產(chǎn)生明顯的信號(hào)變化。以其中化合物3c為例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的熒光探針在熒光法(包括熒光顯微鏡和熒光凝膠成像儀)檢測(cè)水溶液中、凝膠中和細(xì)胞中G-四鏈體核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)的應(yīng)用。

實(shí)施例一：化合物3c的合成

在通風(fēng)櫥用天平分別稱(chēng)取2，6-二甲基吡啶1.10g、環(huán)丁砜5.00g、碘甲烷2.50g，置于50mL圓底燒瓶并加入攪拌子，50℃油浴，開(kāi)啟磁力攪拌。反應(yīng)體系無(wú)明顯變化，無(wú)回流。4h后停止反應(yīng)，圓底燒瓶?jī)?nèi)有白色固體。冷卻至室溫后，加入15mL乙酸乙酯，有白色固體析出。繼續(xù)磁力攪拌0.5h，抽濾，濾渣用乙酸乙酯淋洗。干燥后稱(chēng)重，得1，2，6-三甲基吡啶鎓碘鹽M-DP 2.44g，產(chǎn)率95.31％。產(chǎn)品為白色固體顆粒。然后分別稱(chēng)取M-DP 0.51g、吲哚-3-甲醛ID 1.00g，正丁醇15mL、4-甲基哌啶15滴，先后置于50mL圓底燒瓶，120℃油浴，開(kāi)啟冷凝水和磁力攪拌，。隨著體系溫度升高，固體開(kāi)始溶解，體系顏色由無(wú)色向棕紅色變化并逐漸加深。體系輕微回流。1.5h后停止反應(yīng)，圓底燒瓶?jī)?nèi)固液相共存，液相呈現(xiàn)棕紅色，固相呈現(xiàn)暗紅色。冷卻至室溫后，冰浴降溫析出固體，趁冷抽濾，濾渣用正丁醇淋洗。干燥濾渣后稱(chēng)重，得0.75g化合物3c。產(chǎn)率72.82％。產(chǎn)品為棕紅色細(xì)粉固體顆粒?？偖a(chǎn)率：69.4％。¹HNMR(300MHz，DMSO-d₆)δ(ppm)：11.92(s，2H)，8.24(t，J＝12.0Hz，1H)，8.10(m，J＝18.0Hz，6H)，8.03(d，J＝12.0Hz，2H)，7.52(m，J＝8.0Hz，2H)，7.33(d，J＝12.0Hz，2H)，7.24(m，J＝18.0Hz，4H)，4.27(s，3H)。

實(shí)施例二：化合物6a的合成

在通風(fēng)櫥分別稱(chēng)取2，4，6-三甲基吡啶1.10g、環(huán)丁砜5.00g、碘甲烷2.20g，置于50mL 圓底燒瓶并加入攪拌子，放入70℃油浴，開(kāi)啟冷凝水與磁力攪拌。2h后反應(yīng)停止，圓底燒瓶?jī)?nèi)有白色固體，溶液呈淡黃綠色。冷卻至室溫后，往燒瓶?jī)?nèi)加入15mL乙酸乙酯，有白色固體析出。磁力攪拌0.5h，抽濾，濾渣用適量乙酸乙酯淋洗。干燥濾渣后稱(chēng)重，得1，2，4，6-四甲基吡啶鎓碘鹽M-TP 2.25g。產(chǎn)率85.50％。然后分別稱(chēng)取M-TP 0.54g、4-甲硫基苯甲醛1.66g、正丁醇15mL、4-甲基哌啶15滴，先后置于50mL圓底燒瓶，95℃油浴，開(kāi)啟冷凝水和磁力攪拌。隨著溫度升高，固體開(kāi)始溶解，體系顏色由淡黃綠色變?yōu)槌燃t色。隨著反應(yīng)的進(jìn)行紅色逐漸加深。1.5h后停止反應(yīng)，圓底燒瓶?jī)?nèi)固液相共存，液相呈現(xiàn)酒紅色，固相呈現(xiàn)橙紅色。將圓底燒瓶移出加熱裝置，冷卻至室溫后，抽濾，濾渣用正丁醇淋洗。干燥濾渣后稱(chēng)重，得化合物6a 1.31g。產(chǎn)率97.31％。產(chǎn)品為橙紅色細(xì)粉固體顆粒。總產(chǎn)率83.2％。¹HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：8.36(s,2H)，8.08(p，J＝9Hz,2H)，7.83～7.60(m，J＝69Hz,12H)，7.46～7.37(m，J＝27Hz,6H)，2.55(s,9H)。

實(shí)施例三：化合物6b的合成

在通風(fēng)櫥分別稱(chēng)取2，4，6-三甲基吡啶1.10g、環(huán)丁砜5.00g、碘甲烷2.20g，置于50mL圓底燒瓶并加入攪拌子，放入70℃油浴，開(kāi)啟冷凝水與磁力攪拌。2h后反應(yīng)停止，圓底燒瓶?jī)?nèi)有白色固體，溶液呈淡黃綠色。冷卻至室溫后，往燒瓶?jī)?nèi)加入15mL乙酸乙酯，有白色固體析出。磁力攪拌0.5h，抽濾，濾渣用適量乙酸乙酯淋洗。干燥濾渣后稱(chēng)重，得1，2，4，6-四甲基吡啶鎓碘鹽M-TP 2.25g。產(chǎn)率85.50％。然后分別稱(chēng)取M-TP 0.54g、吲哚-3-甲醛1.45g，正丁醇15mL、4-甲基哌啶15滴，先后置于50mL圓底燒瓶，110℃油浴，開(kāi)啟冷凝水和磁力攪拌。隨著溫度升高，固體開(kāi)始溶解，體系顏色由無(wú)色向棕紅色變化并逐漸加深。1.5h后停止反應(yīng)，圓底燒瓶?jī)?nèi)固液相共存，液相呈現(xiàn)棕紅色，固相呈現(xiàn)暗紅色。冷卻至室溫后，大量固體析出，用正丁醇淋洗。干燥濾渣后稱(chēng)重，得化合物6c，1-甲基-2，4，6-三(吲哚-3-乙烯)吡啶0.85g。產(chǎn)率65.38％。產(chǎn)品為棕紅色細(xì)粉固體顆粒?？偖a(chǎn)率：55.93％.¹HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm)：11.86(s，3H)，8.23(s，2H)，8.30～7.91(m，9H)，7.52(d，J＝6Hz，4H)，7.33～7.19(m，J＝42Hz，8H)，4.16(s，3H)。

實(shí)施例四：化合物6b的核酸選擇性

DNA配置：DNA樣品購(gòu)自英駿生物技術(shù)有限公司。將DNA適量溶于Tris-HCl的緩沖液中(pH 7.4，100mM Tris，60mM KCl)或者Tris-醋酸緩沖中(pH 5.5，100mM Tris，60mM KCl)，超微量紫外定濃，在95℃下加熱5min后緩慢冷卻退火到室溫作為儲(chǔ)存液，4℃儲(chǔ)存。

將5mM的化合物儲(chǔ)備液稀釋成5μM的濃度，再加入不同種類(lèi)的核酸用熒光分光光度計(jì)(狹縫寬度＝10mm，掃描速度＝200，λex＝486nm)測(cè)出其各自的熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)這一系類(lèi)化 合物與G-四鏈體DNA結(jié)合之后熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。

表1 本專(zhuān)利所用DNA種類(lèi)及序列表

實(shí)施例五：檢測(cè)限的測(cè)定

將5mM的化合物儲(chǔ)備液稀釋成5μM的濃度，再在熒光分光光度計(jì)(狹縫寬度＝10mm，掃描速度＝200，λex＝486nm)掃描，再往其中慢慢加入Telo21的DNA做到使其飽和。檢測(cè)限的計(jì)算公式

LOD＝K×S_b/m

LOD(化合物的結(jié)合常數(shù))，m是濃度C與(F-F₀)/F₀的所做直線(xiàn)的斜率，S_b為用儀器空白多次測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差，K值按照國(guó)際純粹和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)建議通常取為3。

由此計(jì)算出化合物6b對(duì)Telo21DNA的檢測(cè)限為33nM.

實(shí)施例六：核酸凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

配制20％聚丙烯酰胺凝膠，灌制凝膠，待凝膠冷卻之后取出梳子和隔板，放入電泳槽中，緩沖液淹沒(méi)過(guò)膠1-2mm為止，DNA濃度為5μM，上樣量為15μL，接通電泳儀電源，20V恒壓1h，然后100V恒壓2h，關(guān)閉電源。取出凝膠塊，用化合物和SYBR Green I分別浸染，最后用凝膠成像儀成像。

實(shí)施例七：細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)

先將細(xì)胞接種于6孔板中，使細(xì)胞的密度約為2×10³個(gè)/mL，然后在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。棄去6孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的1×PBS洗3次，然后再加入預(yù)冷的純甲醇1.5mL/孔，常溫避光放置1min，棄去純甲醇并再用預(yù)冷的1×PBS洗3次，加入1mL/孔5μM的化合物放置15min。棄去上步6孔板中的化合物溶液，用預(yù)冷的1×PBS洗3次，在上述6孔板中加入1μM的DAPI溶液1mL/孔，37℃放置2min，然后再用預(yù)冷的1×PBS洗6次，每次浸泡5min。在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。