本發(fā)明涉及一種染料及其制備方法，特別是涉及一種水溶性PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY熒光染料及其制備方法。

背景技術(shù)：
在分子和細(xì)胞水平上對(duì)生命或體內(nèi)的生理、病理過程進(jìn)行的無創(chuàng)、實(shí)時(shí)成像，可在機(jī)體尚未出現(xiàn)形態(tài)學(xué)變化之前即對(duì)疾病做出準(zhǔn)確診斷極具意義。熒光染料作為功能型染料在這一領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，備受矚目。在眾多染料中，氟硼二吡咯甲川(BF2-dipyrrolemethene，簡(jiǎn)稱BODIPY)類熒光染料，具有熒光量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好、吸收和發(fā)射波長(zhǎng)位于可見光區(qū)，易于調(diào)控等諸多優(yōu)點(diǎn)而被廣泛研究，其分子易修飾。氮雜氟硼二吡咯甲川(BF2-azadipyrrolemethene，簡(jiǎn)稱azaBODIPY)染料是近年來受到廣泛關(guān)注的一類新型近紅外熒光染料，該類染料具有吸收和發(fā)射波長(zhǎng)長(zhǎng)，光穩(wěn)定性好、半峰寬窄、量子產(chǎn)率高、摩爾消光系數(shù)大等特點(diǎn)，在生物分析領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，已經(jīng)成為近年來研究的熱點(diǎn)。但有分子難修飾的不足。近年來，亞甲基二吡咯/氮雜亞甲基二吡咯絡(luò)合BF2而生成的BODIPY/azaBODIPY得到了廣泛的發(fā)展，Shen研究小組和Burgess研究小組做了系統(tǒng)的報(bào)道。而現(xiàn)報(bào)道的BODIPY/azaBODIPY由于其疏水性，限制其體內(nèi)/體外應(yīng)用。亞甲基二吡咯/氮雜亞甲基二吡咯作為配體，絡(luò)合Si及過渡金屬，也有一些報(bào)道。例如以Si為中心的SiR3-BODIPY的化合物，但穩(wěn)定性很差；而以金屬離子（例如Zn，Ni，Sn，Cu，Co，F(xiàn)e等）為中心的M-BODIPY的金屬錯(cuò)體，穩(wěn)定也不好，量子產(chǎn)率很低。它們的實(shí)際應(yīng)用基本不可能。但是，亞甲基二吡咯/氮雜亞甲基二吡咯作為配體，絡(luò)合PnO2(Pn=P,As,Sb,Bi）的染料從沒有報(bào)道過及考察過。長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光染料，降低生物體內(nèi)物質(zhì)的自吸收和自發(fā)熒光的干擾，提高檢測(cè)的靈敏度和選擇性、提高熒光成像（治療）效率。長(zhǎng)波長(zhǎng)熒光染料普遍量子產(chǎn)率低，但增加分子剛性/凍結(jié)旋轉(zhuǎn)可以有效提高熒光量子產(chǎn)率。因此，在母核剛性修飾尋求突破。在此，我們引入新的戰(zhàn)略設(shè)計(jì)，從經(jīng)典傳統(tǒng)的BODIPY/azaBODIPY發(fā)展的新型染料PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY（PnO2-phosphorusdipyrrolemethene，簡(jiǎn)稱PnO2-PODIPY;PnO2-azaphosphorusdipyrrolemethene，簡(jiǎn)稱PnO2-azaPODIPY）。這種染料是以亞甲基二吡咯/氮雜亞甲基二吡咯絡(luò)合PnO2發(fā)展的PO2-BODIPY/PO2-azaBODIPY染料。我們預(yù)期的設(shè)計(jì)的新型PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY染料為進(jìn)一步應(yīng)用于生物學(xué)研究的發(fā)展提供新式染料，豐富染料家族的種類。作為新式的染料，在具備經(jīng)典傳統(tǒng)的BODIPY/azaBODIPY染料的光譜性能等優(yōu)點(diǎn)之外，最大的特征是良好的水溶性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種水溶性PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY熒光染料及其制備方法，該熒光染料具有如下特點(diǎn)：中心原子是以Pn(Pn=P,As,Sb,Bi）絡(luò)合的六配位的熒光染料，具有很好的水溶性，同時(shí)本發(fā)明所述染料在生物應(yīng)用方面具有良好的細(xì)胞透膜性。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有存在的BODIPY/azaBODIPY染料的不足，在其基礎(chǔ)上改進(jìn)，提供了一類結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，長(zhǎng)波長(zhǎng)，且具有良好的細(xì)胞透膜性的新型化合物PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY。其具有的下列結(jié)構(gòu)通式I/II：其中，R1-R7選自-H、-Ph、-Me、-Et、-OH、-OMe、-OEt、-N(Me)2、-N(Et)2等基團(tuán)；R8選自R8-1、R8-2、R8-3、R8-4、R8-5、R8-6、R8-7和R8-8等基團(tuán)。R1-R7選自-Ph、-Me、-Ar、萘基、芘基等基團(tuán)。虛線，代表不熔合苯環(huán)與熔合苯環(huán)兩種分子結(jié)構(gòu)。具有上述通式I/II的新型熒光染料可用于生物染色，細(xì)胞成像，實(shí)施例子中列舉了將其中的一個(gè)染料應(yīng)用于細(xì)胞成像，顯示出此類化合物具有良好的穩(wěn)定性，具有很好的水溶性，同時(shí)有一定的透膜性。本發(fā)明的這類熒光染料同時(shí)還具有新穎的光譜特性。本發(fā)明的另一方面是以Pn原子為中心六配位的全新的PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY熒光染料，突出特征是良好的水溶性。本發(fā)明的再一方面：提供一種新式制備本發(fā)明所述的熒光染料的方法，所述方法包括如下步驟：（1）在氬氣保護(hù)下，相應(yīng)的醛和相應(yīng)的吡咯溶解在二氯甲烷中，加入一滴三氟乙酸，室溫?cái)嚢?，過夜反應(yīng)。用TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，加入DDQ，攪拌30分鐘。反應(yīng)液用冰淬滅。用二氯甲烷萃取，減壓蒸餾，剩余物用硅膠柱提純，展開劑為二氯甲烷/正己烷，得到亞甲基二吡咯III固體。其中，R1-R7選自-H、-Ph、-Me、-Et、-OH、-OMe、-OEt、-N(Me)2、-N(Et)2等基團(tuán)；R8選自R8-1、R8-2、R8-3、R8-4、R8-5、R8-6、R8-7和R8-8等基團(tuán)。（2）在敞開的體系下，將步驟（1）得到固體III溶解在二氯甲烷中，然后加入三乙胺，反應(yīng)半小時(shí)。最后，加入PnOCl3((Pn=P,As,Sb,Bi）)，反應(yīng)3小時(shí)?；旌衔镉帽銣?。用二氯甲烷萃取，減壓蒸餾，剩余物用硅膠柱提純展開劑為二氯甲烷/正己烷，得到固體I。(3)開放體系下，加入苯基取代的吡咯、冰醋酸(、醋酸酐，冰浴下加入亞硝酸鈉，室溫反應(yīng)0.5h，轉(zhuǎn)移至80°C反應(yīng)0.5h，反應(yīng)結(jié)束。緩慢加入冰水淬滅反應(yīng)，會(huì)有固體析出，過濾出固體。濾餅用二氯甲烷溶解，以二氯甲烷為淋洗劑，以氧化鋁為固定相過柱，旋干溶劑，得到氮雜次甲基二吡咯IV固體。R1-R7選自-Ph、-Me、-Ar、萘基、芘基等基團(tuán)。虛線，代表不熔合苯環(huán)與熔合苯環(huán)兩種分子結(jié)構(gòu)。(4)將得到固體IV，在開放體系下，加入二氯甲烷、三乙胺，繼續(xù)攪拌30分鐘。緩慢滴入加入PnOCl3((Pn=P,As,Sb,Bi）)，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8小時(shí)。加入冰水淬滅反應(yīng)，二氯甲烷分液萃取，有機(jī)層水洗，無水硫酸鈉干燥，旋干，柱層析，展開劑為二氯甲烷/正己烷，得到有金屬光澤的固體II。其中II結(jié)構(gòu)中，R”選自-H、-OH、-OMe、-OEt、-N(Me)2和-N(Et)2；虛線，代表不熔合苯環(huán)與熔合苯環(huán)兩種分子結(jié)構(gòu)。本發(fā)明改進(jìn)現(xiàn)有BODIPY/azaBODIPY熒光染料光譜上的不足，設(shè)計(jì)合成新型的PnO2絡(luò)合的PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY熒光染料。該類熒光染料具有光穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，同時(shí)這類染料具有有優(yōu)異的水溶性，具有細(xì)胞透膜性，可以應(yīng)用于生物染料，細(xì)胞成像方面的研究。附圖說明圖1是本發(fā)明的新型熒光染料的結(jié)構(gòu)通式I。圖2是本發(fā)明的新型熒光染料的結(jié)構(gòu)通式II。圖3是本發(fā)明的新型熒光染料I-1的磷譜。圖4是本發(fā)明的新型熒光染料III-1的吸收（λabs=450nminCH2Cl2）。圖5是本發(fā)明的新型熒光染料I-1的吸收光譜（a:λabs=513nminCH2Cl2;b:λabs=505nminH2O）與熒光光譜(c:λem=520nminH2O）。主要對(duì)比PO2絡(luò)合前后光譜行為的表現(xiàn)。圖6是本發(fā)明的熒光染料III-1的CH2Cl2溶液中的顏色（左圖）；本發(fā)明熒光染料I-1在純水中溶解的顏色（右圖）。圖7是本發(fā)明的新型熒光染料IIa-1的磷譜。圖8是本發(fā)明的新型熒光染料IVa-1的吸收（λabs=597nminCH2Cl2）。圖9是本發(fā)明的新型熒光染料IIa-1的吸收（a:λabs=625nminH2O）與熒光光譜（b:λem=675nminH2O）。主要對(duì)比PO2絡(luò)合前后光譜行為的表現(xiàn)。圖10是本發(fā)明的新型熒光染料IVa-1的CH2Cl2中的顏色（左圖）；本發(fā)明熒光染料IIa-1在純水中溶解的顏色（右圖）。圖11是本發(fā)明的新型熒光染料IIa-1的對(duì)活細(xì)胞Hep-2細(xì)胞染色的熒光顯微照片。所用的儀器為共聚焦激光掃描顯微鏡。型號(hào)：ArrayScan?VTIHCSReader。激光發(fā)光通道：590nm。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖所示實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。除另有說明外，本文中使用的術(shù)語具有如下含義。其中，R1-R7選自-H、-Ph、-Me、-Et、-OH、-OMe、-OEt、-N(Me)2、-N(Et)2等基團(tuán)，優(yōu)先選為-Me；R8選自R8-1、R8-2、R8-3、R8-4、R8-5、R8-6、R8-7和R8-8等基團(tuán)，R8優(yōu)先選為對(duì)硝基苯基。在本發(fā)明通式II中，R1-R7選自-Ph、-Me、-Ar、萘基、芘基等基團(tuán)；虛線，代表不熔合苯環(huán)（a）與熔合苯環(huán)(b)兩種分子結(jié)構(gòu)。R1-R7優(yōu)先選為-Ph;優(yōu)先采用不熔合苯環(huán)的分子結(jié)構(gòu)。本發(fā)明提供一種新式制備本發(fā)明所述的熒光染料PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY的方法，即首先制備中間體III/IV，其次制備的中間體與PnOCl3(Pn=P,As,Sb,Bi)絡(luò)合，最后水解，得到本發(fā)明所述的化合物。具體實(shí)施方案如下所述。（1）在氬氣保護(hù)下，相應(yīng)的醛和相應(yīng)的吡咯溶解在二氯甲烷中，加入一滴三氟乙酸，室溫?cái)嚢瑁^夜反應(yīng)。用TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束，DDQ加入，攪拌30分鐘。反應(yīng)液用冰淬滅。用二氯甲烷萃取，減壓蒸餾，剩余物用硅膠柱提純，展開劑為二氯甲烷/正己烷，得到固體III。反應(yīng)時(shí)間2-15小時(shí)。相應(yīng)的醛與相應(yīng)的吡咯的投料摩爾比為1:2。（2）在敞開體系下，將得到固體III溶解在二氯甲烷中，然后加入三乙胺，反應(yīng)半小時(shí)。最后，加入PnOCl3(Pn=P,As,Sb,Bi），室溫下反應(yīng)8小時(shí)。把冰水緩慢加入，進(jìn)行水解反應(yīng)。而后用二氯甲烷萃取，減壓蒸餾，剩余物用硅膠柱提純展開劑為二氯甲烷/正己烷，得到固體I。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，反應(yīng)溫度25度，室溫即可。反應(yīng)時(shí)間1-5小時(shí)。固體III與三乙胺的投料摩爾比為1:5；固體III與PnOCl3(Pn=P,As,Sb,Bi）的投料摩爾比為1:10。緩慢加入冰水，進(jìn)行水解反應(yīng)，完成PnO2的絡(luò)合，生成染料I。(3)敞開體系下，加入苯基取代的吡咯、冰醋酸、醋酸酐，冰浴下加入亞硝酸鈉，室溫反應(yīng)0.5h，轉(zhuǎn)移至80°C反應(yīng)0.5h，反應(yīng)結(jié)束。加入冰水淬滅反應(yīng)，會(huì)有固體析出，過濾出固體。濾餅用二氯甲烷溶解，以二氯甲烷為淋洗劑，以氧化鋁為固定相過柱，旋干溶劑，得到固體IV。吡咯與亞硝酸鈉的投料摩爾比嚴(yán)格為2:1。(4)將得到固體IV，開放體系下，加入二氯甲烷、三乙胺，繼續(xù)攪拌50分鐘。緩慢滴入PnOCl3(Pn=P,As,Sb,Bi），室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)。加入冰水淬滅反應(yīng)，二氯甲烷分液萃取，有機(jī)層水洗，無水硫酸鈉干燥，旋干，柱層析，展開劑為二氯甲烷/正己烷，得到有金屬光澤的固體II。固體IV與三乙胺的投料摩爾比為1:5；固體IV與PnOCl3(Pn=P,As,Sb,Bi）的投料摩爾比為1:8。緩慢加入冰水，進(jìn)行水解反應(yīng)，完成PnO2的絡(luò)合，生成固體II。對(duì)本發(fā)明采用上述方法合成的新型熒光染料的化合物，采用核磁共振圖譜包括1HNMR和31PNMR，質(zhì)譜來確定其結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所述的PnO2-PODIPY/PnO2-azaPODIPY熒光染料具有如下特點(diǎn)：所述的化合物最大優(yōu)點(diǎn)是具有良好的水溶性，可用于生理環(huán)境下的細(xì)胞成像。所述的化合物II的熒光發(fā)射波長(zhǎng)大于600nm，可用于細(xì)胞成像，避免生物自身的熒光背景干擾。所述的化合物具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性。所述的化合物毒副性小，原料易得，結(jié)構(gòu)經(jīng)典，簡(jiǎn)單，易于制備，易產(chǎn)業(yè)化，經(jīng)兩步反應(yīng)即可得到目標(biāo)化合物。本發(fā)明的這些特征和優(yōu)點(diǎn)以及其他特征和優(yōu)點(diǎn)在參考以下附圖和本發(fā)明的具體實(shí)施方式之后將變得顯而易見。鑒于此，本發(fā)明所述的熒光染料進(jìn)行生物染色時(shí)，需要其他組分，如溶劑，pH調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明化合物進(jìn)行生物樣品染色后，樣品在熒光激活細(xì)胞分選儀器中進(jìn)行分析，測(cè)定裝置由激發(fā)的熒光染料產(chǎn)生的發(fā)射光。本發(fā)明上述的熒光染料可以直接配制成水溶液，能夠穩(wěn)定存在。實(shí)施例1制備熒光染料I-1（1）中間體化合物III-1的合成。在氬氣保護(hù)下，對(duì)硝基苯基醛（300mg,0.19mmol）和2,4-二甲基吡咯（0.51ml,0.49mmol）溶解在二氯甲烷（20ml）中，加入一滴三氟乙酸，室溫?cái)嚢?，反?yīng)12h。用TLC檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束，DDQ（900mg）加入，攪拌30分鐘。反應(yīng)液用冰淬滅。用二氯甲烷萃取，減壓蒸餾，剩余物用硅膠柱提純，展開劑為二氯甲烷/正己烷，得到黃色固體III-1（183.2mg,30%）。（2）PO2-PODIPY染料I-1的合成。在敞開體系下，將得到固體III-1（64.2mg）溶解在二氯甲烷（20ml）中，然后加入三乙胺（0.7ml），反應(yīng)10分鐘。而后，加入三氯氧磷（1.2ml），室溫下反應(yīng)1小時(shí)。把冰水緩慢加入，進(jìn)行水解反應(yīng)。而后用二氯甲烷(50ml)萃取，MgSO4進(jìn)行干燥，而后減壓蒸餾，剩余物用硅膠柱提純展開劑為二氯甲烷/正己烷，得到粉紅色固體I-1（58.1mg,76%）。1HNMR(500MHz,CDCl3)8.46(d,J=7.5Hz,2H),7.69(d,J=7.5Hz,2H),6.25(s,2H),2.77(s,6H),2.54(s,6H).31PNMR(202MHz,CDCl3)-0.5.ESI-MS:m/z=383.1.實(shí)施例2制備熒光染料IIa-1（1）中間體化合物IVa-1的合成開放體系下，加入2,4-二苯基吡咯（43.8mg,0.2mmol）、冰醋酸(1ml)、醋酸酐（0.4ml），冰浴下加入亞硝酸鈉（6.9mg,0.1mmol），室溫反應(yīng)0.5h，轉(zhuǎn)移至80°C反應(yīng)0.5h，反應(yīng)結(jié)束。加入冰水淬滅反應(yīng)，會(huì)有固體析出，過濾出固體。濾餅用二氯甲烷溶解，以二氯甲烷為淋洗劑，以氧化鋁為固定相過柱，旋干溶劑，得到藍(lán)紫色固體IVa-1（35.9mg,80%）。1HNMR(400MHz,CDCl3)8.04-8.08(m,4H),7.94-7.97(m,4H),7.33-7.57(m,12H),7.21(s,2H)(NHnotobserved).13CNMR(CDCl3)155.1,149.6,142.7,133.7,132.2,130.1,129.2,129.1,128.3,128.0,126.6,114.9.（2）PO2-azaPODIPY染料IIa-1的合成。在敞開體系下，將得到固體IVa-1（20.3mg）溶解在二氯甲烷（20ml）中，然后加入三乙胺（0.5ml），反應(yīng)10分鐘。而后，加入三氯氧磷（1ml），室溫下反應(yīng)1小時(shí)。把冰水緩慢加入，進(jìn)行水解反應(yīng)。而后用二氯甲烷(50ml)萃取，MgSO4進(jìn)行干燥，而后減壓蒸餾，剩余物用硅膠柱提純展開劑為二氯甲烷/正己烷，得到藍(lán)色固體IIa-1（19.6mg,85%）。1HNMR(500MHz,CDCl3)8.14-8.17(m,4H),7.69(d,J=7.0Hz,4H),7.63(d,J=7.0Hz,6H),7.48(t,J=7.0Hz,2H),7.32-7.35(m,6H).31PNMR(202MHz,CDCl3)0.3.ESI-MS:m/z=511.2.共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察化合物IIa-1對(duì)活細(xì)胞Hep-2細(xì)胞的染色：將化合物IIa-1（濃度5.0×10-5M，40的PBS溶液)加入2ml的Hep-2細(xì)胞用常規(guī)的DMEM培養(yǎng)液（10%胎牛血清，0.2%NaHCO3水溶液，青霉素100U/mL）。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105mL-1，置于無菌蓋玻片的培養(yǎng)皿中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱放置1h，用沒有血清的DMPE清洗3次，除去沒有貼壁的細(xì)胞，獲取貼壁的Hep-2細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)用。熒光成像前，用PBS緩沖溶液沖洗。實(shí)施例2化合物對(duì)Hep-2細(xì)胞的激光共聚焦成像。由圖可見，經(jīng)化合物染色后，在37℃撫育30分鐘的一組細(xì)胞呈現(xiàn)出強(qiáng)的熒光，細(xì)胞清晰可見。說明此種染料對(duì)Hep-2細(xì)胞有很好的成像作用。所用儀器共聚焦激光掃描顯微鏡，型號(hào)ArrayScan?VTIHCSReader。激光發(fā)射通道561nm。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)化實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在本發(fā)明核心構(gòu)思以次甲基二吡咯/氮雜亞甲基二吡咯等配體與PnO2(Pn=P,As,Sb,Bi)絡(luò)合的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單演繹和替換，都應(yīng)該視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。作為本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的域的普通技術(shù)人員來說，在基于本發(fā)明熒光染料用于染色的相同作用機(jī)理的考慮下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推理，得到本發(fā)明的化合物的其他應(yīng)用用途，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。