專利名稱：熒光標(biāo)記的O⁶-芐基鳥嘌呤及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬化學(xué)藥物，涉及一類在活細(xì)胞中標(biāo)記功能態(tài)MGMT蛋白的小分子熒光探針，其制備方法，以及用其進(jìn)行標(biāo)記的方法。該類探針是氟硼熒光染料(boron dipyrromethene B0DIPY)熒光基團(tuán)修飾的O6-芐基鳥嘌呤類化合物，具有良好的細(xì)胞膜通透性以及對功能態(tài)MGMT蛋白的選擇性。在活細(xì)胞中，它們可以與功能態(tài)的MGMT蛋白結(jié)合， MGMT蛋白隨即催化探針分子結(jié)構(gòu)中的BODIPY-芐基部分共價結(jié)合于MGMT第145位半胱氨酸的巰基上，導(dǎo)致功能態(tài)的MGMT失活，同時由于獲得BODIPY熒光基團(tuán)而被標(biāo)記，并能被定性定量檢測。
背景技術(shù)：
近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率持續(xù)升高，已成為嚴(yán)重威脅人類生命的最大殺手之一。 目前，化療已成為臨床治療腫瘤的重要手段，而烷化劑作為傳統(tǒng)的化療藥物之一，因其低廉的價格而受到患者青睞，多年來仍然活躍在臨床抗腫瘤一線，是臨床化療方案中不可或缺的藥品。烷化劑在體內(nèi)能形成缺電子活潑中間體或其它具有活潑親電性基團(tuán)的化合物，進(jìn)而與DNA中富電子基團(tuán)發(fā)生共價結(jié)合，使DNA分子喪失活性或發(fā)生斷裂，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。DNA結(jié)構(gòu)中有許多可被烷基化的位點(diǎn)，各位點(diǎn)的反應(yīng)活性不同，烷基化后所造成的損傷程度亦不相同，其中以鳥嘌呤O6-位烷基化所造成的損傷最為嚴(yán)重，是細(xì)胞中主要的致突變、致凋亡損傷。O6-甲基鳥嘌呤 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶(O6- methylguanine DNAmethyltransferase, MGMT)是從細(xì)菌到哺乳動物細(xì)胞中廣泛存在的DNA損傷修復(fù)酶，特異性修復(fù)DNA結(jié)構(gòu)中鳥嘌呤O6-位的烷基化損傷。活性態(tài)MGMT在不需任何輔助因子或其它蛋白質(zhì)的條件下，不可逆地催化DNA分子中鳥嘌呤O6-位上的烷基轉(zhuǎn)移至其第145位的半胱氨酸巰基上，使DNA的結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)正常，同時自身獲得烷基而失活。MGTM的修復(fù)作用是細(xì)胞對烷化劑藥物產(chǎn)生耐藥性的根本原因。腫瘤細(xì)胞中MGMT 酶活性水平與細(xì)胞對烷化劑藥物的敏感性直接相關(guān)。因此，檢測并確定細(xì)胞中MGMT酶活水平的高低，有可能預(yù)見烷化劑類藥物的治療效果。但由于不同腫瘤細(xì)胞中MGMT的酶活水平差異較大，而同種腫瘤組織中MGMT酶活水平也存在顯著的個體差異，因此，建立分析腫瘤細(xì)胞中MGMT酶活水平的方法，對于實(shí)施腫瘤預(yù)見性個體化化療方案，合理使用化療藥物， 提高療效，具有重要的參考意義。已報導(dǎo)的MGMT酶活水平檢測方法包括標(biāo)記DNA法、標(biāo)記寡核苷酸法及單克隆抗體法。標(biāo)記DNA法和標(biāo)記寡核苷酸法利用[3H]標(biāo)記的DNA或[3H]標(biāo)記的寡核苷酸對MGMT 蛋白進(jìn)行放射性標(biāo)記。雖然這兩種方法都具有較高的靈敏性，但由于用到了放射性同位素， 因而對實(shí)驗(yàn)條件要求較高，必須在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行；另外，放射性同位素對環(huán)境產(chǎn)生的污染危害極大；再者，DNA及寡核苷酸作為生物分子，細(xì)胞膜通透性差，使得標(biāo)記實(shí)驗(yàn)只能在細(xì)胞勻漿液中進(jìn)行；其次，標(biāo)記DNA及標(biāo)記寡核苷酸的制備過程復(fù)雜，穩(wěn)定性差，不易于長期保存，這些都制約了上述兩種方法的廣泛應(yīng)用。單克隆抗體法雖然避免了放射性同位素的應(yīng)用，但抗體作為生物分子同樣具有細(xì)胞膜通透性差、穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)；更重要的是，抗體通過識別抗原表位與蛋白結(jié)合，因而結(jié)果并不能反映蛋白質(zhì)的功能狀態(tài)。上述3種檢測方法，均由于檢測試劑的體積大、膜通透性差的缺點(diǎn)而被限制了在活細(xì)胞中的應(yīng)用。與之相反，熒光標(biāo)記的小分子探針則具有良好的細(xì)胞膜通透性，適宜在活細(xì)胞中的應(yīng)用；熒光檢測基團(tuán)與放射性同位素相比，無毒無害且靈敏性高；不僅如此，基于蛋白質(zhì)的強(qiáng)效抑制劑而設(shè)計的小分子熒光探針將特異結(jié)合功能態(tài)的蛋白質(zhì)，因而檢測結(jié)果能真實(shí)反映蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的功能態(tài)水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種熒光標(biāo)記的O6-芐基鳥嘌呤，具有以下式I通式
其中
熒光基團(tuán)的修飾位置位于芐基的間位或?qū)ξ?；m代表0-5的自然數(shù)；修飾用的焚光基團(tuán)氟硼熒光染料(boron dipyrromethene, B0DIPY)選用1，3，5，7-四甲基-8-丁酰-BODIPY0 本發(fā)明的又一個目的是提供式I代表的熒光標(biāo)記的O6-芐基鳥嘌呤的制備方法， 通過以下2種制備方法實(shí)現(xiàn) 制備方法(l)，m代表1-5
(A)芐位引入疊氮基醚鏈的苯甲酸乙酯中間體II的制備稱取適量疊氮基單取代的縮乙醇，溶于干燥四氫呋喃，加入1當(dāng)量NaH，室溫攪拌5分鐘后，加入1當(dāng)量對(或間)溴甲基 (或氯甲基)苯甲酸乙酯，繼續(xù)于室溫下反應(yīng)3小時后，加水悴滅，粗產(chǎn)品以乙酸乙酯萃取，有機(jī)相濃縮后硅膠柱層析純化，體積比為3:1的石油醚/乙酸乙酯洗脫，得無色油狀物II ；
(B)芐醇中間體III的制備稱取適量的苯甲酸乙酯中間體II，溶于干燥四氫呋喃中， 加入1.5當(dāng)量LiAlH4,回流攪拌反應(yīng)3小時后，自然冷至室溫，加水悴滅，產(chǎn)品以乙酸乙酯萃取，減壓旋除溶劑后，濾液減壓濃縮得淡黃色油狀物。該油狀物繼而溶于無水乙醇中，依次加入1當(dāng)量三乙胺及1當(dāng)量三氟乙酸乙酯，室溫攪拌反應(yīng)5小時后，減壓蒸除溶劑，粗產(chǎn)品以硅膠柱層析純化，石油醚/乙酸乙酯(K/Y = 1:1)洗脫，得無色油狀物III ；
(C)芐基的對/間位引入醚狀連接鏈的O6-芐基鳥嘌呤中間體IV的制備稱取適量中
權(quán)利要求
1. 一種熒光標(biāo)記的O6-芐基鳥嘌呤，具有以下式I通式:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光標(biāo)記的O6-芐基鳥嘌呤的制備方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)芐位引入疊氮基醚鏈的苯甲酸乙酯中間體II的制備稱取疊氮基單取代的縮乙醇，溶于干燥四氫呋喃，加入1當(dāng)量NaH，室溫攪拌5分鐘后，加入1當(dāng)量對或間溴甲基苯甲酸乙酯或者對或間氯甲基苯甲酸乙酯，繼續(xù)于室溫下反應(yīng)3小時后，加水悴滅，粗產(chǎn)品以乙酸乙酯萃取，有機(jī)相濃縮后硅膠柱層析純化，體積比為3:1的石油醚/乙酸乙酯洗脫，得無色油狀物II ；(2)芐醇中間體III的制備稱取苯甲酸乙酯中間體II，溶于干燥四氫呋喃中，加入1.5 當(dāng)量LiAlH4,回流攪拌反應(yīng)3小時后，自然冷至室溫，加水悴滅，產(chǎn)品以乙酸乙酯萃取，減壓旋除溶劑后，濾液減壓濃縮得淡黃色油狀物，該油狀物繼而溶于無水乙醇中，依次加入1當(dāng)量三乙胺及1當(dāng)量三氟乙酸乙酯，室溫攪拌反應(yīng)5小時后，減壓蒸除溶劑，粗產(chǎn)品以硅膠柱層析純化，用體積比為1:1的石油醚/乙酸乙酯洗脫，得無色油狀物III ；(3)芐基的對/間位引入醚狀連接鏈的O6-芐基鳥嘌呤中間體IV的制備稱取中間體 III，溶于干燥DMF中，加入1當(dāng)量NaH，室溫攪拌5分鐘后，加入1當(dāng)量的6-氯鳥嘌呤，繼續(xù)于室溫攪拌反應(yīng)5小時，減壓蒸除溶劑，所得粗產(chǎn)品以硅膠柱層析純化，用體積比為30 1的二氯甲烷/甲醇洗脫，得無色膠狀物，即為中間體IV ；(4)探針分子I的合成稱取中間體IV溶于甲醇中，攪拌溶解后加入5當(dāng)量的碳酸鉀， 反應(yīng)液于60°C攪拌2小時后，冷至室溫，減壓蒸除溶劑，加入少量無水甲醇，濾除固體不溶物，濾液中依次加入1當(dāng)量1，3，5，7-四甲基-8- 丁酰-BODIPY-tV-琥珀酰亞胺酯及1當(dāng)量三乙胺，室溫攪拌3小時后，減壓蒸除溶劑，粗產(chǎn)品硅膠柱層析純化，用體積比為8:1的二氯甲烷/甲醇洗脫，得目的化合物Ia-I j，為磚紅色固體，合成路線如下
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光標(biāo)記的O6-芐基鳥嘌呤的制備方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)稱取06-[4-(氨甲基)芐基]鳥嘌呤或06-[3-(氨甲基)芐基]鳥嘌呤溶于干燥甲醇中，加入1當(dāng)量1，3，5，7-四甲基-8- 丁酰-BODIPY-tV-琥珀酰亞胺酯及1. 5當(dāng)量三乙胺，室溫攪拌3小時后，減壓蒸除溶劑，甲醇重結(jié)晶，得目的化合物讓-11，為磚紅色固體，合成路線如下
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種熒光標(biāo)記的O6-芐基鳥嘌呤在制備用于標(biāo)記活細(xì)胞中活性態(tài)MGMT的探針分子中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種熒光標(biāo)記的O6-芐基鳥嘌呤，通過不同長度的醚狀連接鏈，在O6-芐基鳥嘌呤的芐基對位或間位引入了1,3,5,7-四甲基-8-丁酰-BODIPY熒光基團(tuán)。本發(fā)明提供了一類用于在活細(xì)胞中標(biāo)記功能態(tài)MGMT蛋白的小分子熒光探針。該類探針分子是依據(jù)MGMT的催化機(jī)理而設(shè)計的共價抑制劑，它們具有良好的細(xì)胞膜通透性，可對細(xì)胞內(nèi)的MGMT產(chǎn)生抑制作用，并對其進(jìn)行熒光標(biāo)記，可在制備用于標(biāo)記活細(xì)胞中活性態(tài)MGMT的探針分子中的應(yīng)用；結(jié)構(gòu)通式為。
文檔編號C09K11/06GK102443018SQ201110292860
公開日2012年5月9日 申請日期2011年10月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月6日
發(fā)明者何俏軍, 李新, 楊波, 胡永洲, 錢石靜 申請人:浙江大學(xué)