專(zhuān)利名稱(chēng)：檢測(cè)恩諾沙星的熒光微球免疫層析檢測(cè)卡及其制備方法
檢測(cè)恩諾沙星的熒光微球免疫層析檢測(cè)卡及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及一種利用熒光微球免疫層析技 術(shù)定性檢測(cè)恩諾沙星的檢測(cè)卡及其制備方法。
背景技術(shù)：
恩諾沙星(Enrofloxacin，ENR)又名乙基環(huán)丙沙星，為第一個(gè)畜禽專(zhuān)用的氟喹諾 酮類(lèi)藥物，1983年由德國(guó)拜耳公司首先研發(fā)成功，我國(guó)于1994年投放市場(chǎng)。因其能抑制 細(xì)菌DNA螺旋酶，抗菌譜廣、高效、低毒、組織穿透力強(qiáng)，已成為獸醫(yī)臨診和水產(chǎn)養(yǎng)殖 中最重要的抗感染藥物之一，被大量用于治療、預(yù)防疾病和促進(jìn)生長(zhǎng)。該藥內(nèi)服及肌肉 注射吸收迅速，且在體內(nèi)代謝為同樣具有抗菌活性的環(huán)丙沙星，代謝物生成及消除均緩 慢，分布廣泛。但人類(lèi)食用被此藥物污染的動(dòng)物食品后，可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)正常菌群產(chǎn)生耐 藥性，引起人體中毒或過(guò)敏反應(yīng)，影響體內(nèi)核酸的合成，具有潛在的致癌性。美國(guó)、歐 盟以及我國(guó)都對(duì)恩諾沙星的使用進(jìn)行了嚴(yán)格控制。美國(guó)禁止使用恩諾沙星于畜禽養(yǎng)殖； 歐盟法規(guī)中明確規(guī)定恩諾沙星檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為魚(yú)肉和脂肪部分為O.lmg/kg，肝、腎部分為 0.2mg/kg。
目前，針對(duì)恩諾沙星的檢測(cè)和監(jiān)控方法包括確證法和篩查法兩大類(lèi)。確證法主 要包括高效液相色譜、氣相色譜、逆流色譜、離子色譜、離子阱質(zhì)譜、等離子質(zhì)譜、液 質(zhì)或氣質(zhì)聯(lián)用等利用高端設(shè)備為輔助手段的方法。以上方法雖然敏感、特異、穩(wěn)定，但 是存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，一般條件下檢測(cè)通量不高，同時(shí)需要昂貴的設(shè)備支撐，因此確證法 大多用于有疑問(wèn)事件的仲裁；篩查方法一般是指快速檢測(cè)方法。ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè) 定)以及膠體金免疫層析法是目前國(guó)際公認(rèn)的主流技術(shù)，這兩種方法具有檢測(cè)速度快， 價(jià)格便宜，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，是目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)的主要監(jiān)控方法。但ELISA檢測(cè)仍需 專(zhuān)業(yè)人員，且需要較長(zhǎng)的時(shí)間顯示結(jié)果；膠體金法一般情況下對(duì)恩諾沙星能進(jìn)行定性分 析，檢測(cè)時(shí)間比較短(10-15min)。目前國(guó)內(nèi)使用的快速試劑，不管采用何種原理，由于 其靈敏性限制，不能將樣品進(jìn)行多倍稀釋?zhuān)灾劣跇悠分械母蓴_成分比較多，導(dǎo)致實(shí)際 樣品檢測(cè)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生假陰性或假陽(yáng)性現(xiàn)象。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種靈敏度高、操作 簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、價(jià)格低廉的檢測(cè)恩諾沙星的熒光微球免疫層析檢測(cè)卡；本發(fā)明的另一 個(gè)目的是提供上述檢測(cè)卡的制備方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采取的一個(gè)技術(shù)方案是
提供一種檢測(cè)恩諾沙星的熒光微球免疫層析檢測(cè)卡，該檢測(cè)卡為單卡型，由一 張免疫層析試紙條、底卡及面卡構(gòu)成。免疫層析試紙條是在底板上依次搭接地粘貼濾 紙、樣本墊、玻璃纖維膜、NC膜(硝酸纖維素膜)和吸水紙而制成的，所述的玻璃纖維 膜上噴涂有熒光微球，所述的NC膜上固定有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)；所述玻璃纖維膜上噴涂的熒光微球?yàn)闊晒馕⑶驑?biāo)記的抗恩諾沙星抗體，所述硝酸纖維素膜上檢測(cè)區(qū)噴涂有載體 蛋白質(zhì)與恩諾沙星的偶聯(lián)抗原，所述質(zhì)控區(qū)都固定有抗鼠抗體。
所述熒光微球是直徑為0.01 Ιμιη的用二氧化硅包裹熒光物質(zhì)的微球，其表面 連接有活性基團(tuán)，或與鏈霉親和素偶聯(lián)；所述熒光物質(zhì)包括有機(jī)或無(wú)機(jī)的熒光物質(zhì)或多 種熒光物質(zhì)的摻和物以及量子點(diǎn)。
所述的活性基團(tuán)為-CHO、-COOH、-OH、-NH2或-SH;所述的熒光物質(zhì)為菲咯啉聯(lián)釕有機(jī)染料、異硫氰根熒光素、異硫氰根羅丹明、6-羧基熒光素酰胺酯、3， 6-二乙氧基熒烷、3-二乙基氨基-7-(2’ -氯苯胺基)熒烷、洛丹明B、洛丹明110、洛丹 明123和洛丹明10、1，8-萘二酰亞胺4-位被烷氧基或芳氧基取代的熒光物質(zhì)、1，8-萘 二酰亞胺中引入磺酸基，羧基和季銨鹽水溶性基團(tuán)的熒光染料、1，8-萘酸酐與鄰苯二胺 縮合所得到的匹茜酮類(lèi)熒光材料、三氟甲醛香豆素、雙熒光團(tuán)香豆素、1，2，3，3-四甲 基吲哚基團(tuán)香豆素有機(jī)熒光染料或多種熒光物質(zhì)的摻和物以及量子點(diǎn)。
本發(fā)明采取的另一個(gè)技術(shù)方案是提供一種上述檢測(cè)恩諾沙星的熒光微球免疫層 析檢測(cè)卡的制備方法，具體包括以下步驟
1.免疫層析試紙條的制備
(1)熒光微球墊的制備
用熒光微球標(biāo)記抗體，并將其噴涂在玻璃纖維膜上。
取市售的熒光微球在IOOOXg離心10 15η ι，收集沉淀，用0.01Μ ρΗ 4.8的 硼酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)微球濃度為OD45tl = 0.2，然后分別加入20 100mg/ml對(duì)乙基-N， N- 二甲基丙基碳二亞胺(EDC) 100 μ 1，2 20mg/ml氮羥基琥珀酰亞胺(NHS) 100 μ 1， 再加入0.01Μ ρΗ4.8的硼酸鹽緩沖液，振蕩混勻，室溫孵育10 30min后，IOOOXg離 心5 15η ι，沉淀用0.01Μ ρΗ 7 8的硼酸鹽緩沖液重懸，并調(diào)節(jié)微球濃度為OD45tl為 0.2 1.0，在0.1ml的該熒光微球中加入1 IOyg抗恩諾沙星抗體，充分混勻后，室溫 攪拌反應(yīng)1 4h，超純水離心洗滌2 5次，沉淀用0.01M pH 7.2PBS (磷酸鹽緩沖液， 其中包含5%蔗糖和0.05% Tween-20)復(fù)溶沉淀至起始體積后，用BIODOT操作平臺(tái)噴涂 至玻璃纖維膜上，25°C真空干燥1 Zh，放于干燥環(huán)境備用。
(2)檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)的制備
分別將載體蛋白質(zhì)和恩諾沙星的偶聯(lián)抗原，抗鼠抗體噴到硝酸纖維素膜上，制 成檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)；所述的載體蛋白是牛血清白蛋白或卵清白蛋白。
用0.01M pH 7.4PBS (磷酸鹽緩沖液，其中包含5%蔗糖和0.05%吐溫-20)分別 調(diào)節(jié)偶聯(lián)抗原和抗鼠抗體的濃度為0.5 S.Omg/ml，噴膜量為0.7 μ L/cm，檢測(cè)區(qū)噴涂偶 聯(lián)抗原，質(zhì)控區(qū)噴涂抗鼠抗體，兩區(qū)相隔5mm，質(zhì)控區(qū)距離NC膜一端2mm，37°C烘干 過(guò)夜后，在室溫干燥環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?br> (3)組裝和剪切
在粘性底板上依次搭接地粘貼濾紙、樣本墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜及 吸水紙，并剪切成適當(dāng)寬度即成為免疫層析試紙條。
2.免疫層析試紙條的組裝
將根據(jù)上述方法制備的恩諾沙星試紙條固定在底卡上，然后在試紙條表面用面 卡壓緊，即成為免疫層析檢測(cè)卡。底卡和面卡一般都為塑料卡，底卡能使試紙條上的樣5本墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水紙緊密結(jié)合，面卡可保護(hù)試紙條，使其不受損 壞。面卡上預(yù)留加樣孔和觀察窗各兩個(gè)，加樣孔的位置與試紙條的樣本墊對(duì)應(yīng)，觀察窗 的位置與試紙條的硝酸纖維素膜對(duì)應(yīng)。
用上述的熒光微球免疫層析檢測(cè)卡定性檢測(cè)恩諾沙星，包括以下步驟
(1)免疫層析檢測(cè)卡的加樣孔中加入待檢樣本，反應(yīng)3 20min后，將檢測(cè)卡放 入檢測(cè)窗口；
(2)截留在檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光微球在最佳激發(fā)燈源下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光條 帶；
C3)發(fā)射的熒光經(jīng)濾除雜光后，用肉眼觀察是否有熒光信號(hào)；當(dāng)樣本中不含有 被檢測(cè)物質(zhì)時(shí)，檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)均出現(xiàn)一條熒光條帶，即檢測(cè)樣本為陰性；當(dāng)樣本中 含有過(guò)量被檢測(cè)物質(zhì)時(shí)，檢測(cè)區(qū)無(wú)熒光條帶，質(zhì)控區(qū)有一條熒光條帶，檢測(cè)樣本即為陽(yáng) 性。
當(dāng)樣本中含有不過(guò)量被檢測(cè)物質(zhì)時(shí)，檢測(cè)區(qū)有一條弱熒光條帶，質(zhì)控區(qū)有一條 熒光條帶，檢測(cè)樣本即為弱陽(yáng)性。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下
1.熒光物質(zhì)被入射光激發(fā)后，返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出熒光，可以在與激發(fā)光源垂直 的方向進(jìn)行檢測(cè)，因此熒光不受來(lái)自激發(fā)光本底的干擾，靈敏度大大提高，其靈敏度是 用傳統(tǒng)染料和有色標(biāo)記物質(zhì)檢測(cè)方法的10 1000倍。另外，熒光標(biāo)記檢測(cè)方法還具有 操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)；
2.熒光微球是核殼雙結(jié)構(gòu)，克服了常規(guī)熒光微球的染料泄露，抗溶液干擾能力 差等缺點(diǎn)，增加了熒光微球的穩(wěn)定性和熒光壽命；
3.熒光微球表面修飾活性基團(tuán)，采用化學(xué)偶聯(lián)方法來(lái)標(biāo)記抗體或抗原，形成抗 體或抗原與微球的穩(wěn)定結(jié)合；
4.通過(guò)簡(jiǎn)易的濾光片裝置能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)恩諾沙星的定性檢測(cè)。
用本發(fā)明的方法制備的熒光微球免疫層析檢測(cè)卡來(lái)測(cè)試100例已知注射恩諾沙 星的雞肉樣，準(zhǔn)確率均達(dá)到100%，表明本發(fā)明提供的熒光微球免疫層析法結(jié)果準(zhǔn)確， 檢測(cè)快速，操作簡(jiǎn)便，靈敏度高。本發(fā)明檢測(cè)的樣本包括水產(chǎn)品和畜禽類(lèi)的肉、肝和腎寸。


圖1是免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖2是免疫層析檢測(cè)卡的結(jié)構(gòu)示意圖3是熒光微球免疫層析檢測(cè)卡檢測(cè)原理圖。
如圖1所示，該免疫層析試紙條的構(gòu)成為在粘性底板18上，依次搭接地粘貼 濾紙11、樣本墊12、噴涂有熒光微球標(biāo)記的抗恩諾沙星抗體的玻璃纖維膜13、噴涂有恩 諾沙星偶聯(lián)抗原的檢測(cè)區(qū)15和噴涂有抗鼠抗體的質(zhì)控區(qū)16的硝酸纖維素膜14和吸水紙 17,檢測(cè)區(qū)15和質(zhì)控區(qū)16相隔5mm，質(zhì)控區(qū)距離NC膜一端2mm。
如圖2所示，該免疫層析檢測(cè)卡是單卡型的，由檢測(cè)恩諾沙星免疫層析試紙條 固定在底卡21上而形成，具體構(gòu)造包括底卡21、面卡22、加樣孔23、觀察窗M、NC膜25、質(zhì)控區(qū)洸、檢測(cè)區(qū)27。
如圖1、2和3所示，檢測(cè)原理如下在檢測(cè)卡的加樣孔23中加入待檢樣本，樣 本溶解玻璃纖維膜13上噴涂的熒光微球標(biāo)記的抗恩諾沙星抗體，通過(guò)毛細(xì)作用在玻璃纖 維膜13上向前泳動(dòng)，同時(shí)樣本中的恩諾沙星與相應(yīng)的熒光微球標(biāo)記物反應(yīng)；反應(yīng)液經(jīng)過(guò) 檢測(cè)區(qū)15時(shí)，與檢測(cè)區(qū)15的噴涂物反應(yīng)，并富積在檢測(cè)區(qū)15;將檢測(cè)卡放入檢測(cè)窗口 31，待檢樣本33在光源32激發(fā)下，發(fā)射的熒光34通過(guò)單色濾光片35過(guò)濾后，通過(guò)觀察 窗口 36在檢測(cè)區(qū)15觀察是否有的熒光條帶，質(zhì)控區(qū)不管樣本是陰性還是陽(yáng)性都會(huì)出現(xiàn)熒 光條帶。檢測(cè)區(qū)15若無(wú)熒光條帶，樣本是陽(yáng)性，檢測(cè)區(qū)15若有熒光條帶，樣本是陰性。
如圖3所示，熒光微球免疫層析定性檢測(cè)恩諾沙星的檢測(cè)步驟如下
(1)在檢測(cè)卡的加樣孔中滴加待檢樣本，反應(yīng)3 20η ι后，將其放入檢測(cè)窗口 31 ；
(2)檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)被截留的熒光微球33在最佳激發(fā)光源32激發(fā)下，發(fā)出熒 光33通過(guò)單色濾光片34，在觀察窗口 35判斷樣本的陰陽(yáng)性。所述的最佳激發(fā)光源指在 400-460nm激發(fā)光源激發(fā)下，熒光微球能發(fā)出最強(qiáng)的熒光。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1
1、熒光微球標(biāo)記物的制備(EDC法)
熒光微球標(biāo)記抗恩諾沙星抗體的制備取Img包裹異硫氰根羅丹明有機(jī)染料的 熒光微球在IOOOXg離心ΙΟη ι，收集沉淀，用0.01Μ ρΗ4.8的硼酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)微球濃 度為 OD45tl = 0.2，然后加入 90 μ 1 50mg/ml EDC, 150 μ 1 5mg/ml NHS,振蕩混勻，室溫 孵育20η ι后，IOOOXg離心5η ι，沉淀用0.01Μ ρΗ4.8的硼酸鹽緩沖液溶解，并調(diào)節(jié)微 球濃度為OD45tl為0.5。在0.1ml OD450為0.5的該熒光微球中加入1 μ g抗恩諾沙星抗體， 充分混勻后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h，用超純水洗滌離心3次后，用0.01MpH7.2的PBS (其中 包含5%蔗糖和0.05% Tween-20)重懸沉淀至起始體積后，即為制備好的熒光微球標(biāo)記的 抗恩諾沙星抗體。
2、熒光微球墊的制備
用BIODOT噴點(diǎn)儀，將熒光微球標(biāo)記的抗恩諾沙星抗體噴涂至玻璃纖維膜上， 噴膜量均為4μ1/αη，玻璃纖維膜大小為30X0.8cm，25°C真空干燥1 2h，置于干燥環(huán) 境中備用。
3、NC膜的制備
將牛血清白蛋白與恩諾沙星的偶聯(lián)抗原和抗鼠抗體噴涂到硝酸纖維素膜上用 0.01MpH7.4PBS (磷酸鹽緩沖液，其中包含5%蔗糖和0.05%吐溫-20)將牛血清白蛋白與 恩諾沙星的偶聯(lián)抗原的濃度調(diào)節(jié)為lmg/ml，將其噴涂在硝酸纖維素膜上形成檢測(cè)區(qū)；用 0.01MpH7.2PBS (磷酸鹽緩沖液，其中包含5%蔗糖和0.05%吐溫-20)調(diào)節(jié)抗鼠抗體的濃 度為lmg/ml，將其噴涂在硝酸纖維素膜上形成質(zhì)控區(qū)。兩區(qū)的噴膜量均為0.7 μ L/cm， 兩區(qū)相隔5mm，質(zhì)控區(qū)距離NC膜一端2mm，37°C烘干過(guò)夜后，于室溫干燥環(huán)境下保存
4、熒光微球免疫層析檢測(cè)卡的制備
組裝試紙條A 在塑料底板上依次搭接地粘貼(1)濾紙和樣本墊，樣本墊為一 種經(jīng)過(guò)1-5% Tween-20浸泡處理的玻璃纖維膜；( 噴涂有熒光微球標(biāo)記抗恩諾沙星抗 體的玻璃纖維膜；(3)噴涂有牛血清白蛋白與恩諾沙星的偶聯(lián)抗原作為檢測(cè)區(qū)和抗鼠抗 體作為質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜；(4)吸水紙，組裝完成后剪切成4mm的寬度，即成為免 疫層析試紙條。
把免疫層析試紙條固定在塑料底卡上，試紙條表面用面卡壓緊，面卡在對(duì)應(yīng)每 張?jiān)嚰垪l的樣本墊和硝酸纖維素膜的部位分別預(yù)留加樣孔和觀察窗，制成的免疫層析檢 測(cè)卡可用來(lái)檢測(cè)恩諾沙星。該檢測(cè)卡組裝好后裝入鋁箔袋中，加入干燥劑后封口保存， 于室溫干燥環(huán)境下至少可以保存一年。
5、熒光微球免疫層析定性檢測(cè)恩諾沙星的檢測(cè)步驟如下
(1)平放檢測(cè)卡，待測(cè)雞肉提取液樣品平衡至室溫后，在檢測(cè)卡的加樣孔中滴加 樣品80 μ 1，于室溫下反應(yīng)ΙΟη ι后，將檢測(cè)卡放入檢測(cè)窗口 ；
(2)檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)被截留的熒光微球在最佳激發(fā)光源激發(fā)下，發(fā)出熒光通過(guò) 單色濾光片，在觀察窗口觀察，若試紙條檢測(cè)區(qū)無(wú)熒光條帶，質(zhì)控區(qū)有一條熒光條帶， 判斷樣品為陽(yáng)性。若試紙條檢測(cè)區(qū)有熒光條帶，質(zhì)控區(qū)有一條熒光條帶，判斷樣品為陰 性。
實(shí)施例2
本實(shí)施例的制備方法與實(shí)施例1基本相同，不同點(diǎn)在于
載體蛋白選用卵清白蛋白，標(biāo)記載體熒光微球?yàn)榱孔狱c(diǎn)-二氧化硅核殼雙結(jié)構(gòu) 微球。
用上述熒光微球免疫層析檢測(cè)卡定性檢測(cè)恩諾沙星包括以下步驟
(1)平放檢測(cè)卡，待測(cè)雞肝臟提取液樣平衡至室溫后，在檢測(cè)卡的加樣孔中加入 樣品90 μ 1，于室溫下反應(yīng)15η ι，將檢測(cè)卡放入檢測(cè)窗口；
(2)截留在檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)的熒光微球在最佳激發(fā)光源的激發(fā)下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒 光；在觀察窗口觀察，若試紙條檢測(cè)區(qū)有熒光條帶，質(zhì)控區(qū)有一條熒光條帶，判斷樣品 為陰性；若試紙條檢測(cè)區(qū)無(wú)熒光條帶，質(zhì)控區(qū)有一條熒光條帶，判斷樣品為陽(yáng)性。
實(shí)施例3
本實(shí)施例的制備方法與實(shí)施例1基本相同，不同點(diǎn)在于1、標(biāo)記載體熒光微球 為異硫氰根熒光素-二氧化硅核雙結(jié)構(gòu)微球，且其表面修飾的是鏈霉親和素。2、抗恩諾 沙星抗體可采用EDC方法與生物素偶聯(lián)，EDC方法與實(shí)施例1基本相同。
以上所述的實(shí)施例，只是本發(fā)明較優(yōu)選的具體實(shí)施方式
的一種，本領(lǐng)域的技術(shù) 人員在本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)進(jìn)行的通常變化和替換都應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)恩諾沙星的熒光微球免疫層析檢測(cè)卡，其特征在于用于檢測(cè)恩諾沙星 的試紙條。所述試紙條包括在底板上依次搭接地粘貼的濾紙、樣本墊、玻璃纖維膜、 硝酸纖維素膜和吸水紙；所述的玻璃纖維膜上噴涂有抗恩諾沙星抗體與熒光微球偶聯(lián) 物；所述的硝酸纖維素膜上固定有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)，其硝酸纖維素膜上的檢測(cè)區(qū)噴涂有 載體蛋白質(zhì)與恩諾沙星的偶聯(lián)抗原；所述試紙條的質(zhì)控區(qū)固定有抗鼠抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)恩諾沙星的熒光微球免疫層析檢測(cè)卡，其特征在于 所述熒光微球是直徑為0.01 1 μ m的用二氧化硅包裹熒光物質(zhì)的微球，其表面連接有活 性基團(tuán)，或與鏈霉親和素偶聯(lián)；所述熒光物質(zhì)包括有機(jī)或無(wú)機(jī)的熒光物質(zhì)或多種熒光物 質(zhì)的摻和物及量子點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)的恩諾沙星熒光微球免疫層析檢測(cè)卡，其特征在于 所述的活性基團(tuán)為-COOH、-NH2, -CHO、-OH或-SH;所述的熒光物質(zhì)為菲咯啉聯(lián)釕 有機(jī)染料、異硫氰根熒光素、異硫氰根羅丹明、6-羧基熒光素酰胺酯、3，6-二乙氧基 熒烷、3-二乙基氨基-7-(2’ -氯苯胺基)熒烷、洛丹明B、洛丹明110、洛丹明123和 洛丹明10、1，8-萘二酰亞胺4-位被烷氧基或芳氧基取代的熒光物質(zhì)、1，8-萘二酰亞胺 中引入磺酸基，羧基和季銨鹽水溶性基團(tuán)的熒光染料、1，8-萘酸酐與鄰苯二胺縮合所得 到的匹茜酮類(lèi)熒光材料、三氟甲醛香豆素、雙熒光團(tuán)香豆素、1，2，3，3-四甲基吲哚基 團(tuán)香豆素有機(jī)熒光染料或多種熒光物質(zhì)的摻和物及量子點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)恩諾沙星熒光微球免疫層析檢測(cè)卡的制備方法，其特征 在于，免疫層析試紙條制備步驟包括(1)熒光微球墊的制備用市售的熒光微球標(biāo)記抗恩諾沙星抗體，并將其噴涂在玻 璃纖維膜上得到熒光微球墊；(2)檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)的制備將載體蛋白質(zhì)與恩諾沙星的偶聯(lián)抗原噴涂到硝酸纖維 素膜上的檢測(cè)區(qū)范圍，制成檢測(cè)區(qū)；將抗鼠抗體噴涂到硝酸纖維素膜上的質(zhì)控區(qū)范圍， 制成質(zhì)控區(qū)；(3)組裝和剪切在粘性底板上依次搭接地粘貼濾紙、樣本墊、噴涂有熒光微球標(biāo) 記抗體的玻璃纖維膜、固定有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜及吸水紙，并剪切成所需 的寬度即成為免疫層析試紙條；按照上述步驟制得檢測(cè)恩諾沙星試紙條。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)恩諾沙星的熒光微球免疫層析檢測(cè)卡的制備方法，其特 征在于，所述熒光微球標(biāo)記抗體的制備方法如下取熒光微球在IOOOXg離心10 15min，離心后收集沉淀，用0.01M pH 4.8的硼酸 鹽緩沖液調(diào)節(jié)微球濃度為OD45tl = 0.2，然后分別加入20 100mg/ml對(duì)乙基_N，N_ 二 甲基丙基碳二亞胺100 μ 1，2 20mg/ml氮羥基琥珀酰亞胺ΙΟΟμΙ，再加入0.01Μ pH 4.8 的硼酸鹽緩沖液，振蕩混勻，室溫孵育10 30min后，IOOOXg離心5 15min，沉淀用 0.01M pH 7 8的硼酸鹽緩沖液重懸，并調(diào)節(jié)微球濃度為OD45tl在0.2 1.0，在0.1ml的 該熒光微球中加入1 IOyg抗恩諾沙星抗體，充分混勻后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1 4h，超純 水離心洗滌2 5次，用Ο.ΟΙΜρΗ 7.2磷酸鹽緩沖液復(fù)溶沉淀至起始體積后，用BIODOT 操作平臺(tái)噴涂至玻璃纖維膜上，25°C真空干燥1 2h，置于干燥環(huán)境中備用。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)恩諾沙星的熒光微球免疫層析檢測(cè)卡的制備方法，其特征在于，所述硝酸纖維素膜上檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)的制備方法如下用0.01M pH 7.4磷酸鹽緩沖液分別調(diào)節(jié)載體蛋白質(zhì)和恩諾沙星的偶聯(lián)抗原和抗鼠抗 體的濃度為0.5 S.Omg/ml，噴膜量為0.7 μ 1/cm，檢測(cè)區(qū)噴涂載體蛋白質(zhì)和恩諾沙星的 偶聯(lián)抗原，質(zhì)控區(qū)噴涂抗鼠抗體，兩區(qū)相隔5mm，質(zhì)控區(qū)距離硝酸纖維素膜一端2mm， 37 °C烘干過(guò)夜后，在室溫干燥環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?br> 7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)恩諾沙星的熒光微球免疫層析檢測(cè)卡的制備方法，其特 征在于，免疫層析檢測(cè)卡的制備方法如下將試紙條固定在底卡上，試紙條表面用面卡壓緊，所述面卡上預(yù)留加樣孔和觀察 窗，加樣孔的位置與試紙條的樣本墊對(duì)應(yīng)，觀察窗的位置與試紙條的硝酸纖維素膜對(duì) 應(yīng)，所述底卡和面卡為塑料卡。
8.用權(quán)利要求1、2或3所述的檢測(cè)卡定性檢測(cè)恩諾沙星的方法，其特征在于，包括 以下步驟(1)在免疫層析檢測(cè)卡的加樣孔中加入待檢樣本，反應(yīng)3 20min后，將檢測(cè)卡放入 簡(jiǎn)易熒光分析儀窗口檢測(cè)；(2)熒光微球在激發(fā)燈源下，發(fā)出強(qiáng)烈的熒光條帶；(3)發(fā)射的熒光經(jīng)濾除雜光后，用肉眼觀察是否有熒光信號(hào)；當(dāng)樣本中不含有被檢 測(cè)物質(zhì)時(shí)，檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)均出現(xiàn)一條熒光條帶，即檢測(cè)樣本為陰性；當(dāng)樣本中含有過(guò) 量被檢測(cè)物質(zhì)時(shí)，檢測(cè)區(qū)無(wú)熒光條帶，質(zhì)控區(qū)有一條熒光條帶，檢測(cè)樣本即為陽(yáng)性。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)恩諾沙星的熒光微球免疫層析檢測(cè)卡及其制備方法。其構(gòu)成依次包括濾紙、樣本墊、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水紙，所述的玻璃纖維膜上噴涂有熒光微球標(biāo)記的抗體；所述的硝酸纖維素膜上固定有檢測(cè)區(qū)和質(zhì)控區(qū)；所述的檢測(cè)區(qū)噴有恩諾沙星與載體蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物；所述的質(zhì)控區(qū)噴有抗鼠抗體。本發(fā)明以二氧化硅與熒光物質(zhì)復(fù)合的核殼雙結(jié)構(gòu)發(fā)光納米粒子為標(biāo)記，采用競(jìng)爭(zhēng)阻斷模式的免疫層析技術(shù)，實(shí)現(xiàn)恩諾沙星快速免疫分析。在檢測(cè)過(guò)程中，采用熒光微球最佳激發(fā)光源進(jìn)行激發(fā)，發(fā)射出的熒光通過(guò)濾光片裝置后用肉眼觀察檢測(cè)線(xiàn)是否有熒光物質(zhì)，本發(fā)明具有靈敏度高、檢測(cè)快速、操作方便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C09K11/08GK102023210SQ20091009206
公開(kāi)日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2009年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月21日
發(fā)明者李林, 楊曉慧, 熊勇華, 賴(lài)衛(wèi)華, 陳雪嵐, 魏華 申請(qǐng)人:北京中德大地食品安全技術(shù)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司