專利名稱：吲哚類菁染料嵌入的硅殼熒光納米顆粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米材料領(lǐng)域，特別涉及一種將在近紅外區(qū)可發(fā)熒光的吲哚類菁染料嵌入的熒光硅殼納米顆粒及其制備方法。
背景技術(shù)：
吲哚類菁染料(其代表性化合物Cy3、Cy5)的特點是摩爾消光系數(shù)大，與生物基質(zhì)結(jié)合后熒光增強，易于合成得到在近紅外及紅外區(qū)有吸收的熒光染料。因絕大多數(shù)生物基質(zhì)在近紅外區(qū)無吸收，用于生物檢測時無背景干擾。這些染料近年來已廣泛應(yīng)用于各種生物分析技術(shù)。包括生物大分子的定量測定、DNA測序、熒光免疫分析檢測及原位熒光雜交技術(shù)等。
目前，納米顆粒因其可修飾性、靶向性等等優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥的各個領(lǐng)域。把染料嵌入至納米顆粒中，由此而發(fā)展起來的熒光納米顆粒，不僅可以避免染料與所研究的生物體發(fā)生直接的接觸，提高安全性，更能提高標記后的熒光強度，從而提高檢測的靈敏度。以往所發(fā)展的熒光納米顆粒，它們所包埋的染料，激發(fā)和發(fā)射波長都比較短，難以完成在近紅外區(qū)進行樣品檢測的需要。而把吲哚類菁染料包埋到納米顆粒中，無疑發(fā)展了一種可以在近紅外區(qū)進行檢測的熒光納米顆?！，F(xiàn)有的熒光納米顆粒以純?nèi)玖蠟楹?，而吲哚類菁染料的分子量較小，如果直接包埋到顆粒里會導致嚴重的染料泄漏。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可以在近紅外區(qū)進行檢測，既可避免染料的泄漏，又能顯著提高染料的包埋效率的吲哚菁染料(如Cy5、Cy3)硅殼熒光納米顆粒及其工藝簡單、物理性質(zhì)穩(wěn)定的制備方法。
本發(fā)明的吲哚類菁染料硅殼熒光納米顆粒，其為核殼型納米顆粒，其外殼成分為二氧化硅，內(nèi)核材料為結(jié)合了免疫球蛋白的吲哚類菁染料。其制備方法為在吲哚類菁染料(如Cy5、Cy3菁染料系列)上結(jié)合上免疫球蛋白，以此為內(nèi)核材料，通過油包水的原理制備了在近紅外區(qū)可產(chǎn)生熒光的硅殼熒光納米顆粒。
其具體步驟如下①將NaHCO3溶于水中，配成1mol/L的NaHCO3溶液，其pH值范圍在8.0到8.5之間；②將免疫球蛋白溶于0.1mol/L的NaHCO3緩沖溶液中，得到濃度為2mg/ml的免疫球蛋白溶液。該濃度的NaHCO3由第一步的1mol/L的NaHCO3用超純水稀釋10倍而成。再把2mg/ml的免疫球蛋白溶液和1mol/L的NaHCO3溶液以10∶1的比例混合均勻，得到免疫球蛋白溶液b；③使用超純水將染料配成10mg/ml；④將染料溶液和免疫球蛋白溶液b以體積比為1∶25到1∶30之間的比例混合，并立即攪拌。反應(yīng)持續(xù)輕微攪拌2h。最終得到的結(jié)合了免疫球蛋白的吲哚類菁染料溶液稱為反應(yīng)液a；⑤在磁力攪拌下依次加入環(huán)己烷、正己醇、和聚氧乙烯辛烷基苯酚醚-100，其體積比為4∶1∶1到5∶1∶1之間；另外加入超純水及反應(yīng)液a，其體積比為4∶1，攪拌5min至澄清。接著依次加入體積比范圍為1∶1到1∶4之間的氨水和正硅酸乙酯.在磁力攪拌下反應(yīng)24h即可得吲哚類菁染料熒光納米顆粒溶液。
本發(fā)明具有以下特點1、制備方法簡便易行，制備過程中染料損失量少，制備出的納米顆粒尺寸均一；2、吲哚類菁染料的性質(zhì)不穩(wěn)定，在水溶液中溶液水解，而制備吲哚類菁染料(Cy5、Cy3菁染料系列)硅殼熒光納米顆?？梢员苊馊玖吓c水環(huán)境直接接觸。
3、吲哚類菁染料(Cy5、Cy3菁染料系列)硅殼熒光納米顆粒的物理穩(wěn)定性較好，經(jīng)過一段時間保存后未見有染料泄漏、粒徑大小變化不大；4、吲哚類菁染料(Cy5、Cy3菁染料系列)包埋成為納米級微粒，使得染料與生物機體隔離起來，避免了染料對機體造成的不利影響，同時可以大大提高標記生物體所得標本的熒光強度，從而提高檢測的靈敏度。
5、吲哚類菁染料(Cy5、Cy3菁染料系列)硅殼熒光納米顆粒同時也具有良好的光穩(wěn)定性，可以完成對生物標本標記后的長時間檢測。同時，也發(fā)展了一種可以在近紅外區(qū)進行檢測的熒光納米顆粒。
6、吲哚類菁染料(Cy5、Cy3菁染料系列)硅殼熒光納米顆粒具有的二氧化硅外殼，適于進行生物結(jié)合。
7、由于吲哚類菁染料的分子量較小，直接包埋到顆粒里會導致嚴重的染料泄漏，所以本發(fā)明將其標記到結(jié)構(gòu)復雜，分子量大的免疫球蛋白上，既避免了染料的泄漏，又提高了染料的包埋效率。


圖1為Cy5、Cy3菁染料系列熒光納米顆粒結(jié)構(gòu)示意圖。
圖中 1二氧化硅外殼 2染料標記的人免疫球蛋白分子圖2為Cy5熒光納米顆粒和Cy5純?nèi)玖先芤旱臒晒夤庾V比較圖。
圖中 1 Cy5納米顆粒的激發(fā)光譜 2 Cy5染料溶液的激發(fā)光譜3 Cy5染料溶液的發(fā)射光譜 4 Cy5納米顆粒的發(fā)射光譜圖3為Cy5熒光納米顆粒透射電子顯微鏡表征圖。
圖4為Cy5熒光納米顆粒的光穩(wěn)定性圖。
圖中 1 Cy5熒光納米顆粒的光穩(wěn)定性圖2 Cy5染料溶液的光穩(wěn)定性5為Cy5熒光納米顆粒的染料泄漏考察圖。
具體實施例方式實施例1Cy5染料嵌入的硅殼熒光納米顆粒的制備(核為結(jié)合了人免疫球蛋白的Cy5染料)稱取約84mg NaHCO3溶于1ml水中，配成1ml1mol/L的NaHCO3溶液，其pH值約為8.3；將1mg人免疫球蛋白溶于0.5ml0.1mol/L的NaHCO3緩沖溶液中，得到2mg/ml的免疫球蛋白溶液，再加入50μl1mol/L的NaHCO3緩沖溶液，并混合均勻，得到人免疫球蛋白溶液b。使用超純水將Cy5染料配成10mg/ml，取20μl Cy5染料溶液加入人免疫球蛋白溶液b中，并立即攪拌。反應(yīng)持續(xù)輕微攪拌2h，最終得到的結(jié)合了人免疫球蛋白的Cy5染料溶液稱為反應(yīng)液a。在磁力攪拌下依次加入7.5ml環(huán)己烷，1.8ml正己醇，1.8ml聚氧乙烯辛烷基苯酚醚-100，400μl超純水及100μl反應(yīng)液a，攪拌5min至澄清。接著依次加入200μl氨水和400μl正硅酸乙酯.在磁力攪拌下反應(yīng)24h即可得粒徑范圍為50～100nm的Cy5的熒光納米顆粒。
實施例2Cy3染料嵌入的硅殼熒光納米顆粒的制備(核為結(jié)合了人免疫球蛋白的Cy3染料)稱取約84mg NaHCO3溶于1ml水中，配成1ml1mol/L的NaHCO3溶液，其pH值約為8.3；將1mg人免疫球蛋白溶于0.5ml0.1mol/L的NaHCO3緩沖溶液中，得到2mg/ml的免疫球蛋白溶液，再加入50μl1mol/L的NaHCO3緩沖溶液，并混合均勻，得到人免疫球蛋白溶液b。使用超純水將Cy3染料配成10mg/ml，取20μl Cy3染料溶液加入人免疫球蛋白溶液b中，并立即攪拌。反應(yīng)持續(xù)輕微攪拌2h，最終得到的結(jié)合了人免疫球蛋白的Cy3染料溶液稱為反應(yīng)液a。在磁力攪拌下依次加入7.5ml環(huán)己烷，1.8ml正己醇，1.8ml聚氧乙烯辛烷基苯酚醚-100，400μl超純水及100μl反應(yīng)液a，攪拌5min至澄清。接著依次加入200μl氨水和200μl正硅酸乙酯.在磁力攪拌下反應(yīng)24h即可得粒徑范圍為40～100nm的Cy3的熒光納米顆粒。
實施例3Cy5染料嵌入的硅殼熒光納米顆粒的制備(核為結(jié)合了羊免疫球蛋白的Cy5染料)稱取約84mg NaHCO3溶于1ml水中，配成1ml1mol/L的NaHCO3溶液，其pH值約為8.3；將1mg羊免疫球蛋白溶于0.5ml0.1mol/L的NaHCO3緩沖溶液中，得到2mg/ml的羊免疫球蛋白溶液，再加入50μl1mol/L的NaHCO3緩沖溶液，并混合均勻，得到羊免疫球蛋白溶液b。使用超純水將Cy5染料配成10mg/ml，取20μl Cy5染料溶液加入羊免疫球蛋白溶液b中，并立即攪拌。反應(yīng)持續(xù)輕微攪拌2h，最終得到的結(jié)合了羊免疫球蛋白IgG的Cy5染料溶液稱為反應(yīng)液a。在磁力攪拌下依次加入15ml環(huán)己烷，3.6ml正己醇，3.6ml聚氧乙烯辛烷基苯酚醚-100，800μl超純水及200μl反應(yīng)液a，攪拌5min至澄清。接著依次加入400μl氨水和400μl正硅酸乙酯.在磁力攪拌下反應(yīng)24h即可得粒徑范圍為50～100nm的Cy5的熒光納米顆粒。
上述實例1、2所制備的Cy5、Cy3菁染料系列熒光納米顆粒其結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。Cy系列的熒光納米顆粒其外殼為二氧化硅1，內(nèi)殼為Cy染料標記的人免疫球蛋白分子2。
實施例1Cy5熒光納米顆粒熒光光譜性質(zhì)通過熒光分光光度計進行波長掃描，結(jié)果見圖2.從圖中可知，在染料包埋前后，Cy5染料的熒光光譜性質(zhì)沒有發(fā)生改變。
實施例1Cy5熒光納米顆粒的形貌通過透射電子顯微鏡表征，結(jié)果見圖3。本發(fā)明制備的納米顆粒呈完整的球形，分散性好，粒徑均勻。納米顆粒的平均粒徑為50nm。
實施例1Cy5熒光納米顆粒的光穩(wěn)定性考察，結(jié)果見圖4。在激光共聚焦激發(fā)30分鐘后，Cy5染料溶液1的熒光強度下降為原來的18％，而Cy5熒光納米顆粒2的熒光強度仍為原來的82％，說明Cy5納米顆粒具有良好的光穩(wěn)定性。
實施例1Cy5熒光納米顆粒的染料泄漏情況考察，結(jié)果見圖5。經(jīng)丙酮析出的納米顆粒用無水乙醇和水分別超聲洗滌數(shù)次除去多余的表面活性劑和物理吸附在SiO2殼層上的有機染料后，在浸泡在水中，每隔一定時間除去納米顆粒懸浮液中的上清，所得的顆粒重新分散在水中用熒光儀F-2500測熒光。在20h內(nèi)，Cy5熒光納米顆粒的熒光強度仍為原來的95％以上，說明Cy5染料泄漏很少。
權(quán)利要求
1.一種吲哚類菁染料熒光納米顆粒，其特征為為核殼型納米顆粒，其殼成分為二氧化硅，內(nèi)核材料為結(jié)合了免疫球蛋白的吲哚類菁染料。
2.一種如權(quán)利要求1所述的吲哚類菁染料熒光納米顆粒的制備方法，其特征在于以免疫球蛋白為載體，標記上吲哚類菁染料后，被包埋到核殼型的納米顆粒中，采用反相微乳液法制備在近紅外區(qū)可發(fā)熒光的納米顆粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的吲哚類菁染料熒光納米顆粒制備方法，其特征在于具體步驟為①將NaHCO3溶于水中，配成1mol/L的NaHCO3溶液，其pH值范圍在8.0到8.5之間；②將免疫球蛋白溶于0.1mol/L的NaHCO3緩沖溶液中，得到濃度為2mg/ml的免疫球蛋白溶液，該濃度的NaHCO3由第一步的1mol/L的NaHCO3溶液用超純水稀釋10倍而成；再把2mol/L的免疫球蛋白溶液和1mol/L的NaHCO3溶液以10∶1的比例混合均勻，得到免疫球蛋白溶液b；③使用超純水將染料配成10mg/ml；④將染料溶液和免疫球蛋白溶液b以體積比為1∶25到1∶30之間的比例混合，并立即攪拌；反應(yīng)持續(xù)輕微攪拌2h；最終得到的結(jié)合了免疫球蛋白的吲哚類菁染料溶液稱為反應(yīng)液a；⑤在磁力攪拌下依次加入環(huán)己烷、正己醇、聚氧乙烯辛烷基苯酚醚-100，其體積比為4∶1∶1到5∶1∶1之間；另外加入超純水及反應(yīng)液a，其體積比為4∶1，攪拌5min至澄清；接著依次加入體積比為1∶1到1∶4之間的氨水和正硅酸乙酯，在磁力攪拌下反應(yīng)24h即可得吲哚類菁染料熒光納米顆粒溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種吲哚菁染料(Cy染料系列)嵌入的硅殼熒光納米顆粒及其制備方法，旨在提供一種工藝簡單、物理性質(zhì)穩(wěn)定，并能顯著提高染料的包埋效率的硅殼熒光納米顆粒及其制備方法。吲哚菁染料(Cy染料系列)嵌入的硅殼熒光納米顆粒特征為為核殼型納米顆粒，其殼成分為二氧化硅，內(nèi)核材料為結(jié)合了免疫球蛋白的吲哚類菁染料。其制備方法是以人免疫球蛋白為載體，標記上吲哚菁染料后，被包埋到核殼型的納米顆粒中，采用反相微乳液法制備了在近紅外區(qū)可產(chǎn)生熒光的納米顆粒。
文檔編號C09K11/02GK1654592SQ20051003115
公開日2005年8月17日 申請日期2005年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月17日
發(fā)明者王柯敏, 譚蔚泓, 何曉曉, 陳基耘, 秦迪嵐 申請人:湖南大學