專利名稱：一種病毒檢測系統(tǒng)及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病毒檢測系統(tǒng)和一種病毒檢測方法，特別涉及一種SARS病毒的檢測系統(tǒng)及檢測方法。
背景技術(shù)：
SARS(嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥，又名非典型性肺炎，以下簡稱SARS)是二十一世紀(jì)最新發(fā)現(xiàn)的一種非常嚴(yán)重的傳染病。SARS與已知的由肺炎支原體、肺炎衣原體、軍團(tuán)菌及常見的呼吸道病毒所導(dǎo)致的肺炎不同。兩者相比，SARS的主要傳播途徑是通過飛沫近距離傳播，傳染性極強(qiáng)?，F(xiàn)已查明，SARS病毒是一種新型的冠狀病毒，其結(jié)構(gòu)是由蛋白質(zhì)外殼包裹下的RNA病毒，其微粒比較大，直徑約0.1至0.12微米。冠狀病毒病毒體的分子質(zhì)量為4×108Da，在CsCl中的浮力密度為1.23-1.24克/厘米3；在蔗糖中的浮力密度為1.15-1.19克/厘米3，沉降系數(shù)為300-500S20W。SARS病毒體在有Mg2+存在的情況下相對保持穩(wěn)定，對熱、脂溶劑、非離子去污劑、甲醛和氧化劑敏感。冠狀病毒形狀不規(guī)則，有包膜，包膜上有間隔約20nm的突起，使病毒顆粒外形如日冕或冠狀。冠狀病毒顆粒呈中等多形性的球形或橢圓形，基底窄，末端呈棒棍狀。冠狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白包括N蛋白、M蛋白、E蛋白、S蛋白和HE蛋白。
人類對冠狀病毒早有研究，其歷史可追溯到1933年。Baudette等描述了小雞的“哮喘病”，1937年首次從小雞體內(nèi)分離出冠狀病毒，分離的病毒被鑒定為傳染性支氣管類病毒。1965年Tyrrell和Byhve首次在體外用人胎鼻和氣管培養(yǎng)方法，從普通感冒病人鼻洗液中分離出一株病毒，命名為B814病毒。1967年Melntosh等用人胚氣管培養(yǎng)從感冒病人中分離到一批病毒，其代表株是OC43。1968年June Almeida和Tyrell對這些病毒進(jìn)行了形態(tài)學(xué)研究，電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)這些病毒的包膜上有形狀類似日冕的棘突，故提出命名這類病毒為冠狀病毒。1975年國際病毒命名委員會正式命名了冠狀病毒科。
自SARS病原冠狀病毒確定以后，全世界多家機(jī)構(gòu)開始了診斷和檢測技術(shù)的研究。目前SARS冠狀病毒檢測和診斷技術(shù)的研究和開發(fā)主要方向有兩大類基于病毒抗原和抗體反應(yīng)的免疫學(xué)檢測技術(shù)以及針對病毒RNA的核酸檢測技術(shù)(也稱為分子生物學(xué)檢測技術(shù))。
1、免疫學(xué)檢測技術(shù)目前，SARS免疫學(xué)檢測主要是針對SARS冠狀病毒感染所引起的抗體應(yīng)答反應(yīng)。目前正在研究和進(jìn)行臨床測試的方法主要有以下幾種(1)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng))用于SARS病人血清中IgM和IgG抗體測定，大約在發(fā)病后10～21天可以檢測出來。
(2)IFA(熒光免疫測定法)用于SARS病人血清中IgM抗體測定，大約在發(fā)病后10天可以檢測到。這是一種可靠的測定方法，但需要借助于熒光顯微鏡進(jìn)行測定。
現(xiàn)在主要的免疫學(xué)檢測，如ELISA和IFA等，通過檢測抗體，可以了解病毒感染以及疾病發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。然而這二種方法作為SARS臨床診斷方法都存在局限性。第一種測試方法ELISA，雖然能夠可靠地測定病毒抗體，但只能在臨床癥狀發(fā)作20天后才能檢測到，因此不能作為早期診斷以防止感染者把病毒傳染給他人。第二種IFA方法，此法在感染后10天能準(zhǔn)確地測定抗體，但該方法需要有固定的病毒(或病毒抗原)、熒光顯微鏡和有經(jīng)驗(yàn)的檢驗(yàn)技術(shù)人員。
最近，中山大學(xué)附屬醫(yī)院的李剛教授經(jīng)過對21例SARS患者不同時(shí)期血清調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)了其變化規(guī)律。他們分別檢測了IgM和IgG兩種抗體，發(fā)現(xiàn)在發(fā)病一周內(nèi)，兩種抗體均未產(chǎn)生。IgM抗體在發(fā)病10-14天時(shí)出現(xiàn)并很快達(dá)到高峰，60天時(shí)約1/3的患者仍可檢測到IgM抗體，90天時(shí)基本消失。IgG型抗體亦可在10-14天時(shí)檢測到，但滴度較低，60天時(shí)達(dá)到高峰，90天時(shí)仍維持在高水平。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，被調(diào)查的20多例患者在恢復(fù)期全部都有IgG型抗體。
依據(jù)上述SARS檢測技術(shù)開發(fā)的商品有中國科學(xué)院和中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院依據(jù)ELISA法研制出的檢測試劑盒和中國科學(xué)院北京基因組研究所研制的檢測試劑盒；另外，中國疾病預(yù)防控制中心(CDC)還建立了與SARS病人血清中相關(guān)冠狀病毒IgM和IgG抗體特異性酶聯(lián)免疫方法。
2、分子生物學(xué)檢測技術(shù)使用分子生物學(xué)檢測技術(shù)(如PCR)可以檢測出各種樣本(血液、糞便、呼吸道分泌物、組織切片)中的SARS病毒的遺傳物質(zhì)RNA。引物(PCR實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵部分)的設(shè)計(jì)及其合成方法已在世界衛(wèi)生組織(WHO)的官方網(wǎng)站公布，并被世界上許多國家所使用。
PCR方法的優(yōu)點(diǎn)是可以測定SARS病毒的基因，實(shí)現(xiàn)早期診斷。但是它要求引物和模板之間有很強(qiáng)的特異性，而且其靈敏度不高，結(jié)果中有很多假陰性，這就意味著許多實(shí)際攜帶著病毒的人不能被檢測到——對于很容易通過人與人之間的密切接觸傳播的疾病而言，假陰性的檢測結(jié)果預(yù)示著極大的安全隱患。
依據(jù)PCR方法，由專業(yè)定量PCR試劑盒研制的生產(chǎn)廠商ARTUR公司與BernhardNocht研究中心合作開發(fā)了世界首個SARS冠狀病毒定量檢測試劑盒。解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院亦研制了冠狀病毒熒光RNA實(shí)時(shí)熒光RT-RNA檢測試劑盒。
對SARS病毒的早期診斷是防治SARS病最重要的步驟之一，但是在這方面至今仍沒有明顯進(jìn)展。仍需探索適用于病毒早期快速而簡便的診斷方法。
由于SARS病毒主要靠飛沫傳播，對其氣態(tài)病毒直接檢測具有重要的實(shí)用意義。對初期感染SARS病人的攜帶病毒進(jìn)行直接檢測是SARS病毒研究的難點(diǎn)，也是世界矚目的關(guān)鍵課題。壓電晶體免疫傳感器利用抗原抗體間極強(qiáng)親和力的特異性吸附，在氣態(tài)生物大分子的檢測上是極有潛力的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種簡便快速、可以早期診斷并且準(zhǔn)確度高的病毒檢測系統(tǒng)。
本發(fā)明的另一目的是提供一種利用上述病毒檢測系統(tǒng)檢測病毒的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種病毒檢測系統(tǒng)，包括霧化系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和報(bào)警系統(tǒng)；所述霧化系統(tǒng)通過所述檢測系統(tǒng)與所述報(bào)警系統(tǒng)相連。
所述霧化系統(tǒng)包含超聲霧化發(fā)生裝置、超聲換能裝置和霧化控制電路；所述檢測系統(tǒng)包括質(zhì)量測量式免疫傳感器及檢測電路裝置；所述報(bào)警系統(tǒng)為單片機(jī)報(bào)警系統(tǒng)；所述單片機(jī)報(bào)警系統(tǒng)包括差頻器電路、單片機(jī)處理電路和報(bào)警電路。
所述超聲霧化發(fā)生裝置為超聲邏輯振蕩儀；所述超聲換能裝置為壓電陶瓷超聲振蕩晶片；所述超聲邏輯振蕩儀通過霧化控制電路與所述壓電陶瓷超聲振蕩晶片相連；所述質(zhì)量測量式免疫傳感器為涂有抗體薄膜的壓電晶體傳感器，其兩個電極插于所述檢測電路裝置上；所述涂有抗體薄膜的壓電晶體傳感器上方的支架上放置所述壓電陶瓷超聲振蕩晶片；所述涂有抗體薄膜的壓電晶體傳感器與所述壓電陶瓷超聲振蕩晶片及支架置于密閉容器中；所述涂有抗體薄膜的壓電晶體傳感器與所述差頻器電路、單片機(jī)處理電路和報(bào)警電路相連。
所述病毒可以是冠狀病毒，最好為SARS病毒。由于抗體通過其兩個Fab段與抗原的表位接合，這種結(jié)合需要很強(qiáng)的結(jié)構(gòu)特異性，因此，所述壓電晶體傳感器只會對SARS病毒產(chǎn)生特異性吸附，對其他冠狀病毒或其他病毒的吸附很弱。
一種病毒檢測方法，其步驟如下(1)取各種含病毒樣本(血液、糞便、呼吸道分泌物或組織切片)，經(jīng)過處理，提取，培養(yǎng)，配制成溶液；
(2)取上述溶液，滴加至超聲霧化發(fā)生裝置；(3)超聲換能裝置向所述超聲發(fā)生裝置傳遞能量，對其上的溶液進(jìn)行超聲氣霧化；(4)密閉容器內(nèi)安裝有涂有抗體薄膜的質(zhì)量測量式免疫傳感器和檢測電路板，氣霧化的病毒被吸附在所述質(zhì)量測量式免疫傳感器的芯片上；(5)所述質(zhì)量測量式免疫傳感器與報(bào)警裝置相連，被吸附病毒量達(dá)到一定程度，報(bào)警裝置即發(fā)出報(bào)警信號。
所述超聲霧化發(fā)生裝置為超聲邏輯振蕩儀；所述超聲換能裝置為壓電陶瓷超聲振蕩晶片；所述超聲邏輯振蕩儀通過霧化控制電路與所述壓電陶瓷超聲振蕩晶片相連；所述質(zhì)量測量式免疫傳感器為涂有抗體薄膜的壓電晶體傳感器，其兩個電極插于所述檢測電路裝置上；所述涂有抗體薄膜的壓電晶體傳感器上方的支架上放置所述壓電陶瓷超聲振蕩晶片；所述涂有抗體薄膜的壓電晶體傳感器與所述壓電陶瓷超聲振蕩晶片及支架置于密閉容器中；所述涂有抗體薄膜的壓電晶體傳感器與所述差頻器電路、單片機(jī)處理電路和報(bào)警電路相連。
一種優(yōu)選技術(shù)方案，其特征在于所述含病毒樣本用量為0.5-1.5μL。
一種優(yōu)選技術(shù)方案，其特征在于所述超聲換能裝置向所述超聲發(fā)生裝置傳遞的能量為440mA的電流；所述壓電陶瓷超聲振蕩晶片的振蕩時(shí)間為0.09秒，振蕩間隔為0.2秒，振蕩次數(shù)為15次。
一種優(yōu)選技術(shù)方案，其特征在于所述含病毒樣本的濃度為0.6-4μg/μL。
本發(fā)明中所用的壓電晶體傳感器是在壓電晶體的電極上固定抗體，制成抗體薄膜。當(dāng)抗體薄膜遇到空氣中的病毒抗原時(shí)，抗原與抗體發(fā)生結(jié)合產(chǎn)生免疫反應(yīng)而使壓電晶體的質(zhì)量增加導(dǎo)致頻率發(fā)生改變，而達(dá)到檢測的目的?？乖涂贵w結(jié)合的生物力都是分子間的非共價(jià)鍵力，如氫鍵、范德華力、靜電作用、疏水作用。因而，壓電晶體傳感器在解析充分后能重復(fù)使用。
壓電晶體傳感器是最常見的一種質(zhì)量測量式免疫傳感器。它的原理是石英晶片在振蕩電路中振蕩時(shí)有一基礎(chǔ)頻率，當(dāng)樣品中的抗原或抗體與包被在晶片上的抗體或抗原結(jié)合時(shí)，由于負(fù)載的增加，晶片的振蕩頻率會相應(yīng)減少，其減少值與吸附上去的質(zhì)量有相關(guān)性，其選擇性是依賴于抗原和抗體的特異性反應(yīng)。
下面通過附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但并不意味著對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。


圖1是本發(fā)明病毒檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是空白晶片基線穩(wěn)定性曲線；圖3對氧磷免疫傳感器基線穩(wěn)定性曲線；圖4是空白晶片對對氧磷的響應(yīng)曲線；圖5是蛋白A膜對對氧磷的響應(yīng)曲線；圖6是對氧磷壓電傳感器對對氧磷的檢測曲線；圖7是SARS壓電晶體傳感器基線穩(wěn)定性曲線；圖8是蛋白A膜對PBS中SARS病毒的檢測曲線；圖9是蛋白A+SARS抗體膜對PBS中SARS病毒的檢測曲線；圖10是SARS壓電晶體傳感器對PBS水溶液的響應(yīng)曲線；圖11是SARS壓電晶體傳感器對PBS中SARS病毒的響應(yīng)曲線；圖12是SARS壓電晶體傳感器對PBS中SARS病毒的工作曲線；圖13是SARS壓電晶體傳感器對廣州01號病毒水溶液的檢測曲線；圖14是SARS壓電晶體傳感器對PBS的檢測曲線；圖15是SARS壓電晶體傳感器對A1號流感病毒的檢測曲線；圖16是SARS壓電晶體傳感器對PBS的檢測曲線；圖17是SARS壓電晶體傳感器對唾液的響應(yīng)曲線；圖18是SARS壓電晶體傳感器對唾液中病毒的響應(yīng)曲線；圖19是SARS壓電晶體傳感器對唾液中病毒的工作曲線；圖20是不同人群唾液響應(yīng)值分布圖。
具體實(shí)施例方式
如圖1所示，一種SARS病毒檢測系統(tǒng)，包括Agilent 53131A型頻率計(jì)8；北京707廠制造的石英壓電晶體傳感器3——9MHz石英倍金電極壓電晶體(外徑×厚度為12.5×0.2mm，電極直徑為6mm)；DPS-3015雙直流穩(wěn)壓電源1；亞都科技股份有限公司制造的亞都超聲波邏輯振蕩儀7；鍍鈦壓電陶瓷振蕩晶片4(直徑2cm，振蕩電流440mA，振蕩時(shí)間0.09秒，間隔時(shí)間0.20秒，振蕩次數(shù)15次)；氣室5；玻璃支架6及檢測電路板2組成。
DPS-3015雙直流穩(wěn)壓電源1與檢測電路板2相連；檢測電路板2上方置一玻璃罩，玻璃罩內(nèi)放置一石英壓電晶體傳感器3與檢測電路板2相連；石英壓電晶體傳感器3上方設(shè)置一玻璃支架6；玻璃支架6上置一壓電陶瓷超聲振蕩晶片4；壓電陶瓷超聲振蕩晶片4與所述亞都超聲邏輯振蕩儀7相連接；檢測電路板2通過Agilent 53131A型頻率計(jì)8與一計(jì)算機(jī)相連接。
生物壓電傳感器以特制的壓電石英晶體為基片，這種晶體同其它壓電石英晶體相比個頭稍大，因生化穩(wěn)定性的需要，電極采用純金的所謂“倍金”工藝，晶體諧振頻率一般在9-10MHz。
壓電晶體傳感器的電路實(shí)際上是一石英晶體穩(wěn)頻的高頻振蕩電路，其基本結(jié)構(gòu)為一塊石英晶體和兩個高速CMOS雙輸入端與非門電路組成；兩個與非門組成高頻放大電路，石英晶體與電容C2串聯(lián)后，形成放大電路的強(qiáng)烈正反饋，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的高頻振蕩，經(jīng)過一塊與非門電路緩沖放大后輸出至主機(jī)電路，由于采用高速CMOS集成電路，容易起振，且振蕩信號非常穩(wěn)定。
壓電晶體傳感器上的抗體薄膜遇到抗原后，由于抗原與抗體發(fā)生結(jié)合而使壓電晶體的頻率發(fā)生改變，通過頻率計(jì)可以將這種頻率的變化轉(zhuǎn)變?yōu)閿?shù)字信號而被計(jì)錄下來。Agilent 53131A頻率計(jì)8提供了RS-232端口，通過此端口可以將以字符形式給出的數(shù)字值傳輸給計(jì)算機(jī)。
本發(fā)明的病毒檢測系統(tǒng)可使用壓電晶體傳感器對氣態(tài)抗原進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測涂有抗體薄膜的壓電晶體傳感器的兩電極插于檢測電路板上，壓電晶體傳感器上方的玻璃支架上置一壓電陶瓷超聲振蕩晶片，壓電晶體傳感器與超聲振蕩晶片及支架同時(shí)置于玻璃氣室中，玻璃氣室為Φ85×100mm的筒狀玻璃鐘罩(體積為500mL)，用微量進(jìn)樣器將液體樣品置于超聲振蕩晶片上，蓋好玻璃鐘罩，啟動超聲邏輯振蕩儀，超聲振蕩將液體樣品霧化成氣霧，在氣室內(nèi)擴(kuò)散，氣體中擴(kuò)散的病毒在抗體膜上發(fā)生免疫反應(yīng)會產(chǎn)生選擇性吸附，使壓電晶體質(zhì)量增加，導(dǎo)致頻率降低，頻率變化由頻率計(jì)記錄。通過實(shí)時(shí)檢測軟件，由計(jì)算機(jī)記錄并顯示圖形。
實(shí)驗(yàn)例11、對氧磷壓電晶體傳感器1.1試劑(1)、對氧磷抗體，解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；(2)、對氧磷(分子量275，蒸氣壓1599×10-6Pa/20℃，解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供；(3)、可溶性蛋白質(zhì)A，Sigma公司；(4)、聚乙烯亞胺，Acros公司；(5)、3一氨基丙基三乙氧基硅烷，Acros公司；(6)、戊二醛，北京化學(xué)試劑公司。
1.2對氧磷壓電晶體傳感器1.2.1電極預(yù)處理
9MHz金電極壓電晶體，分別用1.2mol/L的NaOH，1.2mol/L的HCI浸泡5min，然后分別用二次蒸餾水、乙醇各洗二次，并用乙醇浸泡。室溫下晾干。
1.2.2成膜將一定量的蛋白質(zhì)A用微量注射器涂于晶片表面，室溫晾干后測定頻率，然后將0.5μL的抗體涂于晶片上，室溫晾干后測頻率。
在圖1的壓電晶體傳感器檢測系統(tǒng)和上述的測試條件下，將未涂膜空白壓電晶片置于電路中，檢測三十分鐘，頻率變化僅14Hz，如圖2所示，這是由晶片的電致噪聲和環(huán)境噪聲對檢測的影響，說明晶片受環(huán)境與電路影響較小，穩(wěn)定性較好。
將制好的對氧磷壓電晶體傳感器連入電路，測試其基頻穩(wěn)定性，如圖3所示，二十分鐘后頻率僅下降了40Hz，該頻率下降值與其對對氧磷的響應(yīng)值相比可以忽略不計(jì)。
用空白晶片檢測對氧磷的響應(yīng)信號，結(jié)果如圖4所示，40分鐘內(nèi)頻率僅漂移7Hz，說明空白晶片對對氧磷沒有吸附，基本上對檢測沒有影響。
蛋白A、聚乙烯亞胺、3一氨基丙基三乙氧基硅烷是常用的生物樣品固定化試劑。為了選擇較好的固定化試劑，分別使用這三種不同膜基質(zhì)固定抗體，比較其固定化效果。
從對抗原的檢測來看，三種基質(zhì)的檢測結(jié)果以蛋白A為好。在下面的實(shí)驗(yàn)中我們選擇使用蛋白質(zhì)A來固定抗體。
蛋白A膜對對氧磷的檢測圖5為蛋白A膜對對氧磷的響應(yīng)曲線。從圖中可見，蛋白A膜對對氧磷的響應(yīng)頻率只有48Hz，說明只涂蛋白A不涂對氧磷抗體的膜，對檢測基本上沒有影響。
對氧磷壓電晶體傳感器對對氧磷的檢測用超聲波霧化器將對氧磷氣化，氣化后的對氧磷與傳感器上的固定的對氧磷抗體發(fā)生選擇性吸附，使質(zhì)量增加而引起頻率下降。圖6是蛋白A為膜基質(zhì)固定對氧磷抗體對氣態(tài)對氧磷的檢測結(jié)果，從圖6中可見，響應(yīng)頻率因不斷吸附對氧磷而呈緩慢下降趨勢，在5分鐘時(shí)達(dá)到最低值，最低下降頻率為3978Hz。與只有蛋白A膜的晶片的檢測結(jié)果相比，無對氧磷抗體時(shí)，傳感器基本沒有響應(yīng)，而固定抗體后，響應(yīng)頻率有了很大的提高，信號明顯。響應(yīng)頻率達(dá)到最低值后，傳感器緩慢解析，使頻率逐漸增加。
從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，用蛋白A做交聯(lián)劑，固定化對氧磷抗體做成的壓電晶體傳感器，可以方便地對被超聲霧化器霧化后的氣態(tài)對氧磷進(jìn)行檢測，反應(yīng)迅速，可在6分鐘內(nèi)完成，且可逆性強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)說明，壓電晶體傳感器可對氣態(tài)小分子抗原進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。
實(shí)驗(yàn)例2SARS壓電晶體傳感器1、樣品和試劑(1)、唾液樣品制備漱口后，靜音15分鐘，取2mL新鮮唾液，置離心機(jī)上以3000轉(zhuǎn)/分的速度離心15分鐘，取上層清液備用。
(2)、SARS病毒唾液制備SARS病毒凍干粉制成唾液標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為4，3，2，1.5，1，0.5mg/mL；(3)、PBS溶液將8.0g NaCI，0.2g KCI，1.44gNa2HPO4，1.44gK2HPO4溶解于800mL蒸餾水中，調(diào)整其PH值至7.4，稀釋為1.0L，分裝，高壓蒸氣滅菌，室溫保存；(4)、SARS馬血清抗體(效價(jià)1∶12800，ELISA法分析；PBS溶液)，37.5mg/mL，解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院；(5)、北京01號SARS滅活病毒(PBS溶液)，4mg/mL，解放軍醫(yī)學(xué)科學(xué)院；(6)、廣州01號SARS滅活病毒(PBS溶液)，1.88mg/mL，解放軍醫(yī)學(xué)科學(xué)院；(7)、A1號滬防流感滅活病毒，效價(jià)為1∶128，中國疾病預(yù)防控制中心病毒研究所；(8)、可溶性蛋白A，Sigma公司；(9)、二次蒸餾水。
2、SARS壓電晶體傳感器的制備取9MHZ金電極，先用5mL1.2mol/L的NaOH溶液浸泡5min，洗凈后再用5mL1.2mol/L的HCI浸泡5min，用二次蒸餾水洗凈后于乙醇中浸泡15min，于空氣中晾干待用。
將一定量(具體的體積和濃度受所需要固定的抗體數(shù)量的影響)蛋白A用微量進(jìn)樣器涂于晶片表面，室溫晾干，再將0.5μLSARS抗體濃度為15.00mg/mL的SARS抗體用微量進(jìn)樣器涂于蛋白A薄膜上，室溫晾干。
3、氣化方式的選擇實(shí)現(xiàn)氣相條件下檢測SARS病毒，關(guān)鍵而重要的一步是將處于溶液中的SARS病毒完全氣化成氣體，對氣化方法的要求是(1)、氣化要完全；(2)、速度快；(3)、樣品用量少；(4)、不改變病毒結(jié)構(gòu)，不損傷病毒；(5)、方法簡便易行。
根據(jù)以上要求，試驗(yàn)比較了自然揮發(fā)法和超聲霧化法。
自然揮發(fā)法(1)將含有及未含有SARS病毒的PBS溶液，在相同條件下分別與壓電晶體傳感器同置于密閉氣室，比較二者由于液體自然揮發(fā)成氣體，導(dǎo)致頻率的下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，二者頻率變化未見差異，說明在自然揮發(fā)情況下水中病毒很難揮發(fā)出來。
(2)將含有及未含有SARS病毒的唾液溶液，在相同條件下分別與壓電晶體傳感器同置于密閉氣室。由于唾液的自然揮發(fā)，導(dǎo)致頻率下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，二者頻率未見明顯差異，說明用自然揮發(fā)方法唾液中的病毒亦難以揮發(fā)。
超聲霧化法本發(fā)明使用亞都科技有限股份公司研制的亞都超聲振蕩儀及直徑為2cm鍍鈦PZT壓電陶瓷晶片對水、唾液等液體樣品進(jìn)行霧化，并對檢測氣室的結(jié)構(gòu)、霧化條件如超聲振蕩時(shí)間、振蕩電流大小、振蕩間隔、振蕩次數(shù)以及液體樣品用量進(jìn)行了詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，當(dāng)液體樣品用量大時(shí)，超聲霧化時(shí)會產(chǎn)生液滴飛濺現(xiàn)象，液體不能完全霧化，使測定結(jié)果不可靠。當(dāng)樣品用量為1μL時(shí)，樣品可以完全霧化，不會在超聲霧化時(shí)產(chǎn)生飛濺現(xiàn)象，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明最佳超聲霧化電流為440mA，振蕩時(shí)間為0.09秒，振蕩間隔為0.2秒，振蕩次數(shù)以15次為宜；檢測氣室的結(jié)構(gòu)以霧化片置傳感器上方可得較好的測試效果。
SARS壓電晶體傳感器的基線穩(wěn)定性曲線實(shí)驗(yàn)測試了SARS壓電免疫傳感器基線穩(wěn)定性，從圖7中可以看出，十分鐘后，SARS壓電晶體傳感器的頻率變化基本上趨于穩(wěn)定，三十分鐘內(nèi)其頻率漂移相差41Hz。實(shí)驗(yàn)說明SARS壓電晶體傳感器具有很好的穩(wěn)定性。
SARS壓電晶體傳感器對PBS中SARS病毒的檢測和蛋白A膜與蛋白A+SARS抗體膜對SARS病毒的檢測為比較抗原與抗體的選擇性反應(yīng)，研究了固定與不固定SARS抗體的蛋白A壓電晶體傳感器對PBS中SARS病毒的響應(yīng)(濃度為3mg/mL)。從檢測結(jié)果來看，用僅有蛋白A的壓電晶體傳感器對PBS溶液中的SARS病毒進(jìn)行檢測，頻率變化為762Hz(如圖8所示)，而涂有SARS抗體的壓電晶體傳感器的頻率變化為4758Hz(如圖9所示)，二圖比較說明蛋白A對檢測信號影響不大，主要是膜層上的抗體與病毒結(jié)合使晶片質(zhì)量增加而引起頻率下降。為了進(jìn)一步驗(yàn)證是否是抗體與抗原的結(jié)合反應(yīng)，本發(fā)明的發(fā)明人又做了下面一組對比實(shí)驗(yàn)。
SARS壓電晶體傳感器對PBS及其中的SARS病毒的檢測為比較SARS壓電晶體傳感器對病毒的響應(yīng)，分別對PBS水溶液與含病毒PBS水溶液(濃度為3mg/mL)進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖9、圖10，從二圖比較可看出，SARS壓電免疫傳感器對PBS的響應(yīng)值為2251Hz，遠(yuǎn)小于對SARS病毒的響應(yīng)值(4758Hz)，這說明頻率的下降主要是抗體與病毒結(jié)合引起的(2507Hz)，因此可以對病毒進(jìn)行檢測。該實(shí)驗(yàn)也說明了SARS壓電晶體傳感器對水蒸氣有吸附，PBS水溶液對檢測有一定的影響。
SARS抗體濃度的影響表1為蛋白質(zhì)A的量一定，涂有0.5μL不同濃度SARS抗體的壓電晶體傳感器對病毒檢測的響應(yīng)。
表1響應(yīng)下降頻率與SARS抗體濃度關(guān)系表

由上表可以看出，當(dāng)抗體濃度為37.5mg/mL時(shí)發(fā)生亂頻現(xiàn)象，無法進(jìn)行檢測，抗體濃度為17.75mg/mL時(shí)，對病毒的響應(yīng)達(dá)5709Hz，但對本底PBS信號也高達(dá)4018Hz，本底信號較大。綜合考慮扣除本底后，SARS抗體濃度以15.00mg/mL較佳，其對病毒的響應(yīng)信號可達(dá)2700Hz。
SARS壓電晶體傳感器對PBS中SARS病毒檢測的工作曲線配制含不同濃度的SARS病毒的PBS水溶液，每次樣品量為1μL，分別檢測病毒濃度為5，3，2，1.5和1mg/mL時(shí)的響應(yīng)信號，扣除PBS本底信號，病毒的響應(yīng)曲線如圖12所示。
為測試SARS壓電晶體傳感器對水及對病毒檢測的精密度，在同一檢測條件下，使用同一傳感器對相同濃度的病毒(1mg/mL)和PBS水溶液進(jìn)行十次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2和表3所示。
表2同一晶片對PBS水溶液的檢測精密度

表3同一晶片對PBS中同一濃度病毒的檢測精密度

由上表可以看出，對PBS十次檢測的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為12.21％，對病毒檢測十次的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.98％。根據(jù)S/N＝2計(jì)算，最低檢出限為0.61μL。
為測試壓電晶體傳感器檢測的平行性，在同一條件，使用不同壓電晶體傳感器對相同量的病毒(1mg/mL)及PBS水溶液進(jìn)行十次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表4所示。
表4不同晶片對PBS及其中的SARS毒的檢測平行性(Hz)

由上表可以看出，制備十個不同的傳感器時(shí)，涂蛋白A后的頻率變化相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.30％，涂抗體后的頻率變化相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.79％，傳感器對PBS十次檢測的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為10.41％，對含相同濃度病毒的PBS水溶液檢測十次的相對標(biāo)準(zhǔn)偏為8.60％?？鄢镜缀髮Σ《卷憫?yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為16.57％。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20％。
SARS壓電晶體傳感器對不同株的病毒響應(yīng)迄今為止，世界范圍內(nèi)已發(fā)現(xiàn)十余種不同的SARS病毒株，國內(nèi)亦有多種，如北京01、02、03號，廣州01、02、03號等。本發(fā)明SARS壓電晶體傳感器是根據(jù)北京01號病毒株誘導(dǎo)而得的馬血清抗體來研制的，為實(shí)驗(yàn)該傳感器對不同株病毒的響應(yīng)，圖13為壓電晶體傳感器對廣州01號病毒PBS水溶液(1.88mg/mL)測試結(jié)果，頻率變化為2903Hz。如圖14所示，同一傳感器在相同條件下對相同量PBS測試頻率變化值為2209Hz。從二圖比較，頻率差值為694Hz。而北京01號SARS病毒吸附曲線上可知，1.88mg/mL病毒可引起的頻率差值為1602Hz。這說明該傳感器可以用于檢測廣州01號SARS病毒，但響應(yīng)值低于對北京01號病毒的檢測。
為了研究其他病毒是否會對SARS壓電晶體傳感器的測量造成干擾，本發(fā)明的發(fā)明人用A1號流感病毒做了實(shí)驗(yàn)，對流感病毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖15所示，響應(yīng)信號為1853Hz。圖16為SARS壓電晶體傳感器對PBS的檢測曲線，響應(yīng)信號為1850Hz。由此可知，流感病毒對檢測沒有明顯影響。
SARS壓電免疫傳感器對唾液及唾液中SARS病毒的檢測結(jié)果為比較同一SARS壓電晶體傳感器對唾液及含病毒的唾液的檢測結(jié)果，做了下述實(shí)驗(yàn)。圖17為SARS免疫傳感器對唾液的響應(yīng)曲線，其頻率下降2520Hz，圖18為相同條件下同一傳感器對病毒(溶劑為同一人的唾液，濃度為4mg/mL)的響應(yīng)曲線，其頻率下降5758Hz，扣除唾液本底，由病毒與抗體結(jié)合引起的頻率下降為此3238Hz，說明響應(yīng)信號明顯，響應(yīng)時(shí)間約為1分鐘。
圖19為同一傳感器對不同濃度的SARS病毒(同一人的唾液)的工作曲線，每次進(jìn)樣量為1μL，病毒的濃度分別為4，3，2，1，0.5mg/mL，扣除唾液本底信號。
為測試傳感器檢測的精密度，在同一條件，使用同一傳感器對同一人的唾液配制的同一濃度的病毒(1mg/mL)及唾液進(jìn)行十次檢測，結(jié)果如表5、表6所示。
表5同一晶片對唾液的檢測精密度

表6同一晶片對唾液中1mg/mL病毒的檢測精密度

由上表可以看出，對PBS十次檢測的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.22％。對病毒十次檢測的相對標(biāo)準(zhǔn)偏為10.39％。根據(jù)S/N＝2計(jì)算，最低檢出限為0.6μg/μL。
為測試傳感器檢測的平行性，在同一條件，使用不同的傳感器對唾液中相同濃度的病毒(1mg/mL)及唾液本底進(jìn)行十次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表7所示。
表7不同晶片對唾液及唾液中病毒的檢測平行性(Hz)

由上表可以看出，對唾液十次檢測的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為14.46％。對含病毒的唾液檢測十次的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.59％。對病毒響應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為16.97％。
同一SARS壓電免疫傳感器對50個人的唾液進(jìn)行檢測?？傮w平均值為2128Hz；其中男性37人，平均值為2070Hz；女性13人，平均值為2298Hz。從年齡階段來看，其檢測結(jié)果如表8所示。
表8不同年齡階段受試者檢測結(jié)果

圖20為歲數(shù)不同的人群唾液響應(yīng)值分布圖，從圖20可見，響應(yīng)值在1600-2700Hz之間，絕大多數(shù)響應(yīng)值在1700-2500Hz(84％)之間。
將SARS壓電晶體傳感器密封放入冰箱冷藏室(4-6℃)保存，每隔5天測試其對病毒(濃度為4mg/mL)及PBS本底的響應(yīng)，測試結(jié)果見表9。
表9傳感器活性測試結(jié)果

由上表可知，用蛋白質(zhì)A固定后的抗體性質(zhì)穩(wěn)定，一個月后活性未見明顯下降。
SARS壓電晶體傳感器可多次使用，一般能連續(xù)使用數(shù)十次。但每次使用后要充分解析，一般以解析到其涂膜后的基頻為宜。
從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出以下結(jié)論1、使用上述超聲霧化方法，可將1μL PBS水溶液和唾液中SARS病毒完全霧化。
2、以蛋白A為交聯(lián)劑，用馬血清SARS抗體制成的壓電免疫傳感器，可在約2分鐘內(nèi)快速檢測出水、唾液中所含的SARS病毒。對PBS中SARS病毒檢測限為0.6μg/μL，對唾液中SARS病毒檢測限為0.6μg/μL。
3、壓電晶體傳感器具有極強(qiáng)的特異性，并要求抗體有較高的效價(jià)。實(shí)驗(yàn)說明，從小湯山SARS定點(diǎn)醫(yī)院得到12個SARS康復(fù)病人血清，從中用(NH4)2SO4沉淀法提取得到抗體，用該抗體制成的壓電晶體傳感器對SARS病毒無響應(yīng)。而用該SARS病毒直接誘導(dǎo)產(chǎn)生的馬血清抗體因具有很高的效價(jià)，制成的壓電晶體傳感器對SARS病毒檢測結(jié)果說明效果良好。
4、用同一壓電晶體傳感器對不同年齡段的50人唾液檢測結(jié)果說明，不同年齡，不同生理狀況的人的唾液檢測結(jié)果是有差異的。但84％的人檢測值是在1700Hz-2500Hz之間(檢測平均值為2128Hz)。
5、同一壓電晶體傳感器對同一人的唾液平行檢測十次，結(jié)果說明檢測相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為11.83％。十個壓電晶體傳感器對同一人唾液檢測結(jié)果說明，雖然傳感器基頻及膜厚略有差別，但其檢測結(jié)果偏差在20％范圍之內(nèi)。
6、因水對檢測有干擾，SARS壓電晶體傳感器的貯存應(yīng)在硅膠或其它干燥劑等存在下密封于冰箱的冷藏室中保存。使用前，應(yīng)在測量環(huán)境中放置一段時(shí)間，使傳感器上抗體薄膜與環(huán)境空氣中的小分子達(dá)到完全平衡，頻率穩(wěn)定后再使用。
7、壓電晶體傳感器可重復(fù)使用數(shù)十次，但每次使用前應(yīng)充分解析，使其恢復(fù)到基頻，解析時(shí)間以十分鐘為宜。
9、用北京01號SARS病毒誘導(dǎo)的馬血清多克隆抗體做成的壓電晶體傳感器不僅可對北京01號SARS病毒檢測，而且可以對不同株的廣州01號SARS病毒進(jìn)行檢測。
權(quán)利要求
1.一種病毒檢測系統(tǒng)，其特征在于包括霧化系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和報(bào)警系統(tǒng)；所述霧化系統(tǒng)通過所述檢測系統(tǒng)與所述報(bào)警系統(tǒng)相連。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒檢測系統(tǒng)，其特征在于所述霧化系統(tǒng)包含超聲霧化發(fā)生裝置、超聲換能裝置和霧化控制電路；所述檢測系統(tǒng)包括質(zhì)量測量式免疫傳感器及檢測電路裝置；所述報(bào)警系統(tǒng)為單片機(jī)報(bào)警系統(tǒng)；所述單片機(jī)報(bào)警系統(tǒng)包括差頻器電路、單片機(jī)處理電路和報(bào)警電路。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的病毒檢測系統(tǒng)，其特征在于所述超聲霧化發(fā)生裝置為超聲邏輯振蕩儀；所述超聲換能裝置為壓電陶瓷超聲振蕩晶片；所述超聲邏輯振蕩儀通過所述霧化控制電路與所述壓電陶瓷超聲振蕩晶片相連；所述質(zhì)量測量式免疫傳感器為涂有抗體薄膜的壓電晶體傳感器，其兩個電極插于所述檢測電路裝置上；所述涂有抗體薄膜的壓電晶體傳感器上方的支架上放置所述壓電陶瓷超聲振蕩晶片；所述涂有抗體薄膜的壓電晶體傳感器與所述壓電陶瓷超聲振蕩晶片及支架置于密閉容器中；所述涂有抗體薄膜的壓電晶體傳感器與所述差頻器電路、單片機(jī)處理電路和報(bào)警電路相連。
4.一種病毒檢測方法，其步驟如下(1)取含病毒的樣本，經(jīng)過處理，提取，培養(yǎng)，配制成溶液；(2)取上述溶液，滴加至超聲霧化發(fā)生裝置；(3)超聲換能裝置向所述超聲發(fā)生裝置傳遞能量，對其上的溶液進(jìn)行超聲氣霧化；(4)密閉容器內(nèi)安裝有涂有抗體薄膜的質(zhì)量測量式免疫傳感器和檢測電路裝置，氣霧化的病毒沉積在所述質(zhì)量測量式免疫傳感器的芯片上；(5)所述質(zhì)量測量式免疫傳感器與報(bào)警裝置相連，被吸附的病毒量達(dá)到一定程度，報(bào)警裝置即發(fā)出報(bào)警信號。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的病毒檢測方法，其特征在于所述質(zhì)量測量式免疫傳感器為涂有抗體薄膜的壓電晶體傳感器。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的病毒檢測方法，其特征在于所述超聲霧化發(fā)生裝置為超聲邏輯振蕩儀；所述超聲換能裝置為壓電陶瓷超聲振蕩晶片。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的病毒檢測方法，其特征在于所述病毒為SARS病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的病毒檢測方法，其特征在于所述超聲換能裝置向所述超聲發(fā)生裝置傳遞的是440mA的電流；所述壓電陶瓷超聲振蕩晶片的振蕩時(shí)間為0.09秒，振蕩間隔為0.2秒，振蕩次數(shù)為15次。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)所述的病毒檢測方法，其特征在于所述含病毒樣本用量為0.5-1.5μL。
10.根據(jù)權(quán)利要求9中所述的病毒檢測方法，其特征在于所述含病毒樣本的濃度為0.6-4μg/μL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種病毒檢測系統(tǒng)及其檢測方法，包括霧化系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和報(bào)警系統(tǒng)；所述霧化系統(tǒng)通過所述檢測系統(tǒng)與所述報(bào)警系統(tǒng)相連。本發(fā)明提供的病毒檢測系統(tǒng)及檢測方法通過將含SARS病毒的唾液樣品完全霧化，實(shí)現(xiàn)了對生物大分子的直接氣相檢測，所用壓電晶體傳感器具有極強(qiáng)的特異性。該方法簡便快速、可以早期診斷SARS病毒并且準(zhǔn)確度較高。
文檔編號B05B17/04GK1563995SQ20041003271
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月16日
發(fā)明者左伯莉, 蔣劍影, 李善茂, 王希良, 張金芳, 陳傳治, 郭釗, 張紅興, 田光 申請人:中國人民解放軍防化指揮工程學(xué)院