專(zhuān)利名稱(chēng)：一種從偽枝藻中提取偽枝藻素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和資源利用與可持續(xù)發(fā)展領(lǐng)域，更具體涉及一種利用偽枝藻提取偽枝藻素的方法。
背景技術(shù)：
目前，對(duì)偽枝藻的利用一般只停留在進(jìn)行人工藻結(jié)皮上，對(duì)偽枝藻的其他應(yīng)用開(kāi)發(fā)幾乎還是一片空白，更不用說(shuō)從偽枝藻中提取偽枝藻素并加以利用了。
偽枝藻素(scytonemin)是一類(lèi)黃褐色，脂溶性二聚體色素，分子量為544Da，結(jié)構(gòu)為吲哚或酚亞基，其最大吸收峰在384nm。很多荒漠藍(lán)藻都含有偽枝藻素，這種偽枝藻素具有抗紫外輻射的特性，從而保護(hù)偽枝藻免受紫外光的傷害，為偽枝藻的正常生長(zhǎng)創(chuàng)造條件。偽枝藻素的這種具有極強(qiáng)的抗紫外輻射的能力，可用于化妝品工業(yè)。而目前，我國(guó)使用的色素主要是化學(xué)合成色素，長(zhǎng)期使用合成色素，對(duì)人體皮膚造成損害，從而不利于人類(lèi)健康。
目前，國(guó)內(nèi)對(duì)偽枝藻素的提取涉足甚少，并且其提取方法繁瑣，成本高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從偽枝藻中提取偽枝藻素的方法，該方法簡(jiǎn)便，操作方便，設(shè)備簡(jiǎn)單、安全可靠，成本低，產(chǎn)品質(zhì)量好，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)。
從偽枝藻中提取偽枝藻素的具體步驟如下1、培養(yǎng)液的配制每升水加入磷酸氫二鉀0.02-0.05g、硫酸鎂0.06-0.09g、氯化鈣0.02-0.05g、檸檬酸0.004-0.008g、檸檬酸鐵銨0.004-0.008g、乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)0.001-0.003g、碳酸鈉0.01-0.04g，微量元素溶液A50.5-2ml；2、偽枝藻的培養(yǎng)(1)一級(jí)培養(yǎng)由試管原種接入三角瓶(150-200ml)，靜止培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)，通氣培養(yǎng)時(shí)，調(diào)節(jié)氣流大小在1.5-3.5L.min-1，氣流經(jīng)過(guò)棉花球進(jìn)行無(wú)菌處理，光強(qiáng)控制在65-85μE.m-2.s-1，溫度控制在22-35℃。當(dāng)培養(yǎng)5-10天后，轉(zhuǎn)入到二級(jí)培養(yǎng)。
(2)二級(jí)培養(yǎng)將一級(jí)培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到培養(yǎng)瓶(500-1000ml)，通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流大小在2.5-5L.min-1，無(wú)菌處理，光強(qiáng)控制在75-95μE.m-2.s-1，溫度控制在22-35℃。當(dāng)培養(yǎng)5-10天后，轉(zhuǎn)入到三級(jí)培養(yǎng)。
(3)三級(jí)培養(yǎng)將二級(jí)培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到培養(yǎng)瓶(5000-20000ml)，通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流大小在3-6L.min-1，無(wú)菌處理，光強(qiáng)控制在70-100μE.m-2.s-1，溫度控制在22-35℃。當(dāng)培養(yǎng)5-10天后，為繼續(xù)培養(yǎng)的接種種源。
(4)繼續(xù)培養(yǎng)采用三級(jí)培養(yǎng)后的藻種，按每升培養(yǎng)液中接入0.2-0.5g(濕重)偽枝藻的比例到開(kāi)放式跑道循環(huán)培養(yǎng)池中，進(jìn)行大量培養(yǎng)。采用玻璃溫棚控制溫度在28-30℃，利用自然光進(jìn)行光照，光強(qiáng)控制在80-120μE.m-2.s-1，采用葉輪或潛水泵攪動(dòng)培養(yǎng)基。在收獲之前的3-6天內(nèi)，每天兩次采用UV-B照射，光強(qiáng)控制在120-160μE.m-2.s-1，每次時(shí)間在5-10分鐘。
3、偽枝藻藻粉的制備將培養(yǎng)10-20天后的偽枝藻用泵抽到過(guò)濾裝置——振動(dòng)斜面篩上，經(jīng)過(guò)振動(dòng)斜面篩后，收得偽枝藻藻漿，然后將藻漿經(jīng)過(guò)離心機(jī)離心，獲得偽枝藻藻泥。經(jīng)濃縮、脫水、干燥、粉碎后得到偽枝藻藻粉。
4、偽枝藻素(scytonemin)的提取將藻粉在28-32℃下，加入無(wú)水甲醇(藻粉∶甲醇＝1∶8-12，W/V)，利用攪拌器不停地?cái)嚢璩樘?0min，抽提2-3次，直到抽提液顏色很淺。在大型離心機(jī)中，5000-8000g離心10-15min，收集上清液，然后向沉淀物中加入乙酸乙酯(其體積為前面所用甲醇總體積的十分之一)，28-32℃下繼續(xù)抽提，離心，收集上清液，與甲醇抽提液合并。然后向合并后的抽提液中加入其一半體積的蒸餾水，于-5--10℃下放置10-15分鐘，即可見(jiàn)偽枝藻素(scytonemin)沉淀析出。
5、偽枝藻素的收獲與干燥將上述含偽枝藻素的溶液于大型離心機(jī)中5000-8000g離心10-15min，收集沉淀物。-60--110℃下冷凍干燥。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和顯著的效果方法易行、操作方便、設(shè)備簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)快捷、產(chǎn)量高、產(chǎn)品質(zhì)量好、安全可靠，適用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
提取偽枝藻素的具體實(shí)施步驟如下1、培養(yǎng)液的配制每升水加入硝磷酸氫二鉀0.04g、硫酸鎂0.075g、氯化鈣0.036g、檸檬酸0.006g、檸檬酸鐵銨0.006g、乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)0.001g、碳酸鈉0.02g，微量元素溶液A51ml；2、偽枝藻的培養(yǎng)(1)一級(jí)培養(yǎng)由試管原種接入三角瓶(150-200ml)，靜止培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)，通氣培養(yǎng)時(shí)，調(diào)節(jié)氣流大小在2.5L.min-1，氣流經(jīng)過(guò)棉花球進(jìn)行無(wú)菌處理，光強(qiáng)控制在70μE.m-2.s-1，溫度控制在30℃。當(dāng)培養(yǎng)7-10天后，轉(zhuǎn)入到二級(jí)培養(yǎng)。
(2)二級(jí)培養(yǎng)將一級(jí)培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到培養(yǎng)瓶(500-1000ml)，通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流大小在3L.min-1，無(wú)菌處理方法同上，光強(qiáng)控制在80μE.m-2.s-1，溫度控制在30℃。當(dāng)培養(yǎng)7-10天后，轉(zhuǎn)入到三級(jí)培養(yǎng)。
(3)三級(jí)培養(yǎng)將二級(jí)培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到培養(yǎng)瓶(5000-20000ml)，通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流大小在5L.min-1，無(wú)菌處理方法同上，光強(qiáng)控制在90μE.m-2.s-1，溫度控制在30℃。當(dāng)培養(yǎng)7-10天后，為繼續(xù)培養(yǎng)的接種種源。
(4)繼續(xù)培養(yǎng)采用三級(jí)培養(yǎng)后的藻種，按每升培養(yǎng)液0.3-0.4g濕重的比例接入到開(kāi)放式跑道循環(huán)培養(yǎng)池中，進(jìn)行大量培養(yǎng)。采用玻璃溫棚控制溫度在30℃，利用自然光進(jìn)行光照，光強(qiáng)控制在100-120μE.m-2.s-1，采用葉輪或潛水泵攪動(dòng)培養(yǎng)基。在收獲之前的3-6天內(nèi)，每天兩次采用UV-B照射，光強(qiáng)控制在140-160μE.m-2.s-1，每次時(shí)間在5-10分鐘。
3、偽枝藻藻粉的制備將培養(yǎng)10-20天后的偽枝藻用泵抽到過(guò)濾裝置——振動(dòng)斜面篩上，經(jīng)過(guò)振動(dòng)斜面篩后，收得偽枝藻藻漿，然后將藻漿經(jīng)過(guò)離心機(jī)離心，獲得偽枝藻藻泥。經(jīng)濃縮、脫水、干燥、粉碎(常規(guī)工藝)后得到偽枝藻藻粉。
4、偽枝藻素(scytonemin)的提取將藻粉在30℃下，加入無(wú)水甲醇(藻粉∶甲醇＝1∶10，W/V)，利用攪拌器不停地?cái)嚢璩樘?0min，抽提2-3次，直至抽提液顏色很淺。在大型離心機(jī)中，5000-8000g離心10-15min，收集上清液，然后向沉淀物中加入乙酸乙酯(其體積為前面所用甲醇總體積的十分之一)，30℃下繼續(xù)抽提，離心，收集上清液，與甲醇抽提液合并。然后向合并后的抽提液中加入其一半體積的蒸餾水，于-5℃下放置10-15分鐘，即可見(jiàn)偽枝藻素沉淀析出。
5、偽枝藻素的收獲與干燥將上述含偽枝藻素的溶液于大型離心機(jī)中5000-8000g離心10-15min，收集沉淀物。-100℃下冷凍干燥。
權(quán)利要求
1.一種從偽枝藻中提取偽枝藻素的方法，包括如下步驟A、培養(yǎng)液的配制每升水加入磷酸氫二鉀0.02-0.05g、硫酸鎂0.06-0.09g、氯化鈣0.02-0.05g、檸檬酸0.004-0.008g、檸檬酸鐵銨0.004-0.008g、乙二胺四乙酸二鈉鹽0.001-0.003g、碳酸鈉0.01-0.04g，微量元素溶液A50.5-2ml；B、偽枝藻的培養(yǎng)首先是一級(jí)培養(yǎng)，由試管原種接入三角瓶中，通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流在1.5-3.5L.min-1，氣流經(jīng)過(guò)棉花球進(jìn)行無(wú)菌處理，光強(qiáng)控制在65-85μE.m-2.s-1，溫度控制在22-35℃，當(dāng)培養(yǎng)5-10天后，轉(zhuǎn)入到二級(jí)培養(yǎng)；其次是二級(jí)培養(yǎng)，將一級(jí)培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到培養(yǎng)瓶中，通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流在2.5-5L.min-1，無(wú)菌處理，光強(qiáng)控制在75-95μE.m-2.s-1，溫度控制在22-35℃，當(dāng)培養(yǎng)5-10天后，轉(zhuǎn)入到三級(jí)培養(yǎng)；第三是三級(jí)培養(yǎng)，將二級(jí)培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物接入到培養(yǎng)瓶中，通氣培養(yǎng)，調(diào)節(jié)氣流在3-6L.min-1，無(wú)菌處理，光強(qiáng)控制在70-100μE.m-2.s-1，溫度控制在22-35℃，當(dāng)培養(yǎng)5-10天后，為繼續(xù)培養(yǎng)的接種種源；第四是繼續(xù)培養(yǎng)，采用三級(jí)培養(yǎng)后的藻種，按每升培養(yǎng)液0.2-0.5g濕重的比例接入到開(kāi)放式跑道循環(huán)培養(yǎng)池中，進(jìn)行培養(yǎng)，采用玻璃溫棚控制溫度在28-30℃，利用自然光進(jìn)行光照，光強(qiáng)控制在80-120μE.m-2.s-1，采用葉輪或潛水泵攪動(dòng)培養(yǎng)基，在收獲之前的3-6天內(nèi)，每天兩次采用UV-B照射，光強(qiáng)控制在120-160μE.m-2.s-1，每次時(shí)間在5-10分鐘；C、偽枝藻藻粉的制備將培養(yǎng)10-20天后的偽枝藻用泵抽到過(guò)濾裝置——振動(dòng)斜面篩上，經(jīng)過(guò)振動(dòng)斜面篩后，收得偽枝藻藻漿，然后將藻漿經(jīng)過(guò)離心機(jī)離心，獲得偽枝藻藻泥，經(jīng)濃縮、脫水、干燥、粉碎后得到偽枝藻藻粉；D、偽枝藻素的提取將藻粉在28-32℃下，加入8-12倍體積的無(wú)水甲醇，利用攪拌器不停地?cái)嚢璩樘?0min，抽提2-3次，直到抽提液顏色很淺，在離心機(jī)中，5000-8000g離心10-15min，收集上清液，然后向沉淀物中加入乙酸乙酯，28-32℃下繼續(xù)抽提，離心，收集上清液，與甲醇抽提液合并，然后向合并后的抽提液中加入其一半體積的蒸餾水，于-5--10℃下放置10-15分鐘后，偽枝藻素沉淀便析出；E、偽枝藻素的收獲與干燥將上述含偽枝藻素的溶液于離心機(jī)中5000-8000g離心10-15min，收集沉淀物，-60--110℃下冷凍干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種從偽枝藻中提取偽枝藻素的方法。首先是配制偽枝藻培養(yǎng)液采用磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈣、檸檬酸、檸檬酸鐵銨、乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)、碳酸鈉，微量元素溶液A
文檔編號(hào)C09B61/00GK1563205SQ20041001292
公開(kāi)日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月27日
發(fā)明者劉永定, 謝作明, 沈銀武, 黃澤波, 胡春香, 李敦海, 陳蘭洲 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所