熒光素標(biāo)記的dna探針的基因檢測(cè)系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及一種基因檢測(cè)系統(tǒng)，特別涉及一種DNA電化學(xué)生物傳感器。
【背景技術(shù)】
[0002]眾所周知，DNA傳感器是以DNA為敏感元件，通過(guò)換能器將DNA與DNA、DNA與RNA、DNA與其它有機(jī)無(wú)機(jī)離子之間的作用的生物學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)榭蓹z測(cè)的光、電、聲波等物理信號(hào)的電化學(xué)生物傳感器。它們是基于探針DNA變化發(fā)展而來(lái)的一種新型的DNA傳感器。其中，探針DNA是以病原微生物DNA或RNA的特異性片段為模板，人工合成的帶有放射性或生物素標(biāo)記的單鏈DNA片段，可以是線狀或者環(huán)狀DNA，可用來(lái)快速檢測(cè)病原體。探針DNA—般一端修飾巰基，一端修飾已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或熒光染料等指示劑。通過(guò)金-硫鍵的作用自組裝到金電極表面。與固定的靶DNA互補(bǔ)雜交后，探針DNA的構(gòu)型會(huì)改變，使得探針DNA指示劑與電極表面的電子傳遞效率改變，從而改變電信號(hào)，完成指示雜交，可以判定膜上是否有同源的核酸分子存在。探針DNA利用了 DNA分子雜交原理，可以用來(lái)診斷寄生蟲(chóng)病，現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查及蟲(chóng)種鑒定，可用于病毒性肝炎的診斷，遺傳性疾病的診斷，可用于檢測(cè)飲用水病毒含量。
[0003]目前，這種簡(jiǎn)單的傳感器被廣泛地應(yīng)用于DNA、酶、金屬離子和有機(jī)小分子的研究。但是有些DNA的構(gòu)象改變非常復(fù)雜，而對(duì)于簡(jiǎn)單的傳感器，其靈敏度和選擇性還需要進(jìn)一步提尚O
[0004]如中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)第102286371號(hào)提供的一種基于探針DNA控制組裝界面的交流阻抗型DNA電化學(xué)傳感器，包括電極和捕獲探針DNA，電極采用金電極，捕獲探針DNA采用巰基修飾的DNA，其特征是巰基修飾的DNA在室溫下與金電極通過(guò)Au-S鍵的化學(xué)鍵合作用以及探針堿基部分與金的吸附作用而修飾到金電極表面使捕獲探針DNA平躺于金電極表面形成捕獲探針DNA組裝層;在捕獲探針DNA組裝層的表面有牛血清白蛋白作為封閉劑和保護(hù)劑。通過(guò)雜交前后阻抗值的變化作為指示信號(hào)，該方法利用表面組裝化學(xué)技術(shù)構(gòu)建“平躺”型DNA探針識(shí)別界面，同時(shí)使探針的形態(tài)不受空白雜交條件的影響而保持平躺于電極表面。然而，該發(fā)明提供的DNA電化學(xué)傳感器的DNA探針是平躺在電極表面，并沒(méi)有形成具有高靈敏性的DNA探針弓裝結(jié)構(gòu)，“平躺’型DNA探針遮蓋電化學(xué)傳感器面積較大，傳感器所結(jié)合的DNA探針數(shù)量少。
[0005]又如中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)第103048369號(hào)提供的一種基于還原氧化石墨烯-納米金復(fù)合材料的金黃色葡萄球菌無(wú)標(biāo)記電化學(xué)適配體傳感器，基于還原氧化石墨稀-納米金復(fù)合材料結(jié)合適配體檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法，其基本原理是利用還原氧化石墨烯-納米金復(fù)合材料，用層層自組裝的方法修飾巰基化的金黃色葡萄球菌全菌捕獲探針。當(dāng)探針在金黃色葡萄球菌菌液中孵育，它的有效結(jié)合位點(diǎn)會(huì)與金黃色葡萄球菌結(jié)合，將其包裹在三維空間結(jié)構(gòu)中，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)菌的全菌“捕獲”。由于結(jié)合目標(biāo)菌后會(huì)阻礙電極表面的電子傳輸，使電化學(xué)阻抗值增大，利用阻值的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)金黃色葡萄球菌的定量檢測(cè)。但該電化學(xué)適配體傳感器中納米金顆粒直接自組裝在玻碳電極表面的石墨稀膜上，這使得玻碳電極包覆石墨烯膜的工藝復(fù)雜成本高;此外，所選用DNA探針為一端修飾有巰基的DNA探針，不能形成弓形構(gòu)造，不利于提高檢測(cè)靈敏度。
[0006]再如中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)第102788824號(hào)提供的一種DNA生物傳感器制備方法，DNA生物傳感器中硅片基底和金膜基底由石墨烯自組裝薄膜組成，其中硅片基底為通過(guò)十八烷基三甲氧基硅烷自組裝上石墨烯薄膜，而金膜基底為通過(guò)1-十八硫醇自組裝上石墨烯薄膜。通過(guò)各種電學(xué)測(cè)試表明，自組裝前后及DNA固定雜交前后電性能、元素組成及結(jié)構(gòu)有明顯的變化，并能明顯觀察到目標(biāo)DNA濃度的變化對(duì)其峰值的影響。然而，該DNA生物傳感器制備方法提供的DNA生物傳感器未采用三電極系統(tǒng)，其DNA探針也并沒(méi)有形成具有高靈敏性的弓裝結(jié)構(gòu)。
[0007]還如中國(guó)專(zhuān)利第104569101號(hào)公開(kāi)的一種DNA電化學(xué)生物傳感器及其制備方法，其包括金電極、與目的DNA序列互補(bǔ)的互補(bǔ)DNA、導(dǎo)電納米顆粒以及可溶性電化學(xué)活性試劑，其中一段互補(bǔ)的單鏈DNA作為捕獲探針組裝于金電極上，并利用該單鏈DNA與導(dǎo)電納米顆粒的結(jié)合作為電化學(xué)信號(hào)的轉(zhuǎn)換單元，對(duì)DNA雜交事件進(jìn)行電化學(xué)響應(yīng)。該方法將吸附了導(dǎo)電納米顆粒的巰基化DNA修飾金電極作為信號(hào)轉(zhuǎn)換電極，利用可溶性電化學(xué)活性試劑的電極反應(yīng)，基于DNA序列之間的堿基互補(bǔ)配對(duì)作用，對(duì)目標(biāo)物DNA進(jìn)行電化學(xué)響應(yīng)和檢測(cè)。然而，該DNA電化學(xué)生物傳感器提供的DNA電化學(xué)傳感器并沒(méi)有形成具有高靈敏性的DNA探針弓裝結(jié)構(gòu)，而且是用金電極電解的方式制得納米金顆粒，造價(jià)高而靈敏度低。
[0008]綜上所述，盡管對(duì)DNA電化學(xué)生物傳感器已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，但是提高檢測(cè)靈敏度和選擇性、降低DNA電化學(xué)生物傳感器的成本依然是目前研究的重要方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本實(shí)用新型的目的是為了克服以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種熒光素標(biāo)記的DNA探針的基因檢測(cè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠提供更多DNA探針結(jié)合位點(diǎn)，靈敏測(cè)得系統(tǒng)電路電流變化，減少成本、節(jié)約材料。
[0010]根據(jù)本實(shí)用新型的一個(gè)方面，提供一種熒光素標(biāo)記的DNA探針的基因檢測(cè)系統(tǒng)，包括:電流檢測(cè)裝置、用于盛放電解液的電解池、置于電解液中的三電極組，三電極組包括工作電極、參比電極和對(duì)電極，工作電極、參比電極和對(duì)電極分別通過(guò)引線與電流檢測(cè)裝置的第一接線端、第二接線端和第三接線端電連接，工作電極為摻石墨烯玻碳電極，其中，摻石墨稀玻碳電極中的石墨稀質(zhì)量百分含量為10%。?15%。，包覆金納米顆粒的聚合物微球自組裝在摻石墨烯玻碳電極表面形成包覆聚合物微球納米金層，DNA探針結(jié)合于包覆聚合物微球納米金層上。
[0011]優(yōu)選地，聚合物微球?yàn)镻oly(E⑶ΜΑ-co-VPy)微球。此外，聚合物微球也可以選擇Po Iy (EGDMA-co-HEMA)微球。
[0012]優(yōu)選地，電流檢測(cè)裝置控制電極電勢(shì)在一定范圍內(nèi)以恒定的變化速率掃描，使得電極電勢(shì)從第一電勢(shì)變化至第二電勢(shì)，再按相同速率從第二電勢(shì)變化至第一電勢(shì)，同時(shí)記錄相應(yīng)的響應(yīng)電流，得到伏安特性曲線。
[0013]可選擇地，使用的電流檢測(cè)裝置可為電化學(xué)工作站，型號(hào)為CHI600E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)，或者選用型號(hào)為RST5200電化學(xué)工作站(鄭州世瑞思儀器科技有限公司)。
[0014]可選擇地，電流檢測(cè)裝置的第一接線端、第二接線端和第三接線端分別對(duì)應(yīng)于電化學(xué)工作站的工作電極接入端、參比電極接入端和對(duì)電極接入端。
[0015]可選擇地，DNA探針的兩端分別修飾有熒光素和巰基，巰基與納米金層通過(guò)金-硫鍵結(jié)合，通過(guò)納米金層對(duì)DNA探針上修飾的熒光素的表面吸附力使DNA探針彎曲形成弓型結(jié)構(gòu)，形成DNA探針層。
[0016]可選擇地，包覆Poly (EGDMA-co-VPy)微球納米金層表面組裝一層牛血清蛋白分子層以覆蓋包覆Poly(EGDMA-C0-VPy)微球納米金層上未與DNA探針結(jié)合的區(qū)域。
[0017]根據(jù)本實(shí)用新型的另一方面，提供一種熒光素標(biāo)記的DNA探針的基因檢測(cè)系統(tǒng)的制備方法，包括:(1)、按質(zhì)量比20?30:1準(zhǔn)備聚丙烯腈樹(shù)脂和石墨烯，將準(zhǔn)備好的聚丙烯腈樹(shù)脂在氬氣氣氛中緩慢加熱至1200攝氏度?1800攝氏度得到玻碳，將玻碳降溫至800攝氏度?1000攝氏度加入準(zhǔn)備好的石墨烯攪拌混合后冷卻得到摻石墨烯玻碳；(2)、根據(jù)所需尺寸切割摻石墨烯玻碳獲得摻石墨烯玻碳電極；(3)、將得到的摻石墨烯玻碳電極依次在硝酸溶液、二次蒸餾水、丙酮中超聲洗滌5?10分鐘；(4)、準(zhǔn)備粒徑350?550納米的Poly(EGDMA-co-VPy)微球；(5)、按體積比I?3:1準(zhǔn)備檸檬酸鈉溶液和氯金酸溶液，將準(zhǔn)備好的氯金酸溶液按體積比為0.001?0.01:1加入到超純水中加熱，沸騰后加入準(zhǔn)備好的檸檬酸鈉溶液，充分?jǐn)嚢璺磻?yīng)液并保持沸騰態(tài)30?50分鐘，當(dāng)溶液顏色變成酒紅色時(shí)停止加熱，反應(yīng)液自然冷卻至室溫后冷凍分離提純，得到納米金顆粒溶液；(6)、將步驟(4)準(zhǔn)備的P0ly(EGDMA-C0-VPy)微球加入到步驟(5)制得的納米金顆粒溶液中震蕩30?50分鐘，得到納米金顆粒包覆Poly(EGDMA-Co-VPy)微球的自組裝溶液；(7)、將摻石墨烯玻碳電極放入到納米金顆粒包覆Po I y (E⑶MA-co-VPy)微球的自組裝溶液中，密封浸泡2?5小時(shí)，取出摻石墨烯玻碳電極后用去離子水沖洗，氮?dú)獯蹈桑瓿杉{米金顆粒包覆Poly(EGDMA-C0-VPy)微球與摻石墨烯玻碳電極的自組裝，在摻石墨稀玻碳電極上形成包覆Poly (EGDMA-co-VPy)微球的納米金層；
(8)、將裝配有巰基和熒光素的DNA探針溶液滴涂在摻石墨烯玻碳電極的納米金層上，晾干后用二次水(二次蒸餾水)清洗，氮?dú)獯蹈桑玫紻NA探針修飾的摻石墨烯玻碳電極。
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