一種獲得穩(wěn)定的煙粉虱MED隱種BtTRP基因突變系的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種獲得穩(wěn)定的煙粉虱MED隱種BtTRP基因突變系的方法。所述方法包括以下步驟：BtTRP基因突變品系的獲得、獲得親本F0代、獲得雜交F1代、自交F2代；高溫脅迫檢測，及低溫脅迫檢測，獲得穩(wěn)定的煙粉虱MED隱種BtTRP基因突變系。
【專利說明】
-種獲得穩(wěn)定的煙粉動MED隱種BtTRP基因突變系的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程領(lǐng)域，具體設(shè)及一種獲得穩(wěn)定的煙粉風(fēng)M抓隱種化TRP基因突 變系的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙粉風(fēng) Bemisia tabaci(Gennadius)屬半翅目（Hemiptera)粉風(fēng)科 (Aleyrodidae)，小粉風(fēng)屬Bemisia，屬于世界性的入侵害蟲。煙粉風(fēng)M抓隱種自2003年首次 在中國云南昆明發(fā)現(xiàn)，至今為止，已幾乎遍布全國各省，并逐漸取代煙粉風(fēng)MEAM1隱種，成為 危害我國農(nóng)作物的主要煙粉風(fēng)隱種。對于煙粉風(fēng)M抓隱種快速入侵適應(yīng)并在我國成為優(yōu)勢 種的機制研究備受研究者的青睞，其中入侵機制的分子生物學(xué)研究是研究熱點之一。但由 于煙粉風(fēng)是非模式物種，相關(guān)的基因組信息比較少，能進行機理研究的實驗工具和手段也 比較缺乏，因此對其發(fā)生機制仍不清楚。Clustered regularly interspaced short 口日1；[]1化0111；[。'696日13(〔1?15?10/〔1?15?1?-日3 30。1日16(1(化3)技術(shù)的誕生打破了模式物種與 非模式物種之間的壁壘，使得在非模式物種中進行遺傳修飾變成現(xiàn)實。
[0003] CRISPR/Cas是細菌特有的一種獲得性免疫系統(tǒng)，其原理是通過在生物基因組特定 位點制造 DNA雙鏈斷裂(double-strand break,DSB)損傷，從而激活機體自身的DNA損傷修 復(fù)機制，在此過程中引發(fā)各種變異。CRISPR/tas9技術(shù)的誕生打破了模式物種與非模式物種 之間的壁壘，使得在非模式物種中進行遺傳修飾變成現(xiàn)實。然而，CRISPR/化s9系統(tǒng)存在脫 祀效應(yīng)的問題，限制其從核基因水平抑制目的基因表達的技術(shù)效果，難W達到持久穩(wěn)定的 效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種獲得穩(wěn)定的煙粉風(fēng)M邸隱種化TRP基因突變系的方法。
[0005] 根據(jù)本發(fā)明的獲得CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導(dǎo)的煙粉風(fēng)M抓隱種化TRP基因突變系的方 法包括W下步驟：
[0006] (l)BtTRP基因突變品系的獲得，包括W下步驟：
[0007] (1 -1) BtTRP 基因 sgRNA 引物的設(shè)計：
[000引基于煙粉風(fēng)MED隱種的BtTRP基因序列，設(shè)計SgRNA的祀標位點，引物序列如下：
[0009] MED-F：
[0010] GAAATTAATACGACTCACTATAGGACCAGGAGAGAGGCAAACTCGTTTTAGAGCTAGA
[0011] AATAGC；
[0012] sgRNA-R：
[00。] AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTMC
[0014] TTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC，
[0015] (1-2)合成化 TRP 基因 SgRNA，
[0016] (1-3)合成化39111尺酷，
[0017] (1-4)顯微注射，將步驟（1-2)獲得的BtTRP基因 sgRNA和步驟（1-3)獲得的 化s9mRNA混合，摩爾比為2:1，注射至煙粉風(fēng)M抓隱種紅眼期偽蛹，培育獲得化TRP基因突變 品系；
[001引（2)獲得親本F0代；
[0019] (3)獲得雜交F1代；
[0020] (4)獲得自交F2代；
[0021] (5)高溫脅迫檢測，及低溫脅迫檢測，獲得穩(wěn)定的煙粉風(fēng)M抓隱種化TRP基因突變 系。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的獲得CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導(dǎo)的煙粉風(fēng)M抓隱種化TRP基因突變系的方 法，其中，在步驟(1-4)中，注射后的煙粉風(fēng)M邸隱種紅眼期偽蛹的培育條件為:溫度為26±1 °(：，相對濕度60-80%，光周期為161^:80。
[0023] 本發(fā)明基于煙粉風(fēng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)平臺，研究CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導(dǎo)煙粉風(fēng)MED 隱種化TRP基因突變的遺傳性分析。
[0024] 本發(fā)明通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的煙粉風(fēng)M邸隱種突變品系和煙粉風(fēng)M抓隱種野 生型品系進行雜交，對雜交后代的高低溫脅迫檢測，進而探究CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導(dǎo)基因突 變的可遺傳性。本發(fā)明使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)所誘導(dǎo)的基因突變可通過種系間遺傳給后代， 形成穩(wěn)定的突變品系，為進一步利用誘導(dǎo)基因突變來實現(xiàn)害蟲的生物防治提供理論基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0025] 圖1不同雜交組合F2代煙粉風(fēng)之間耐熱性表型值差異，即觀察高溫脅迫后擊倒時 間。數(shù)據(jù)為均值±標準誤，單個處理樣本量為500頭。小寫字母表示耐熱性存在顯著差異。(P <0.05)
[0026] 圖2不同雜交組合F2代煙粉風(fēng)之間耐寒性表型值差異，即觀察低溫脅迫后恢復(fù)時 間。數(shù)據(jù)為均值±標準誤，單個處理樣本量為500頭。小寫字母表示耐熱性存在顯著差異。(P <0.05)
【具體實施方式】
[0027] 實施例1:煙粉風(fēng)M邸隱種化TRP基因突變品系的獲得
[002引 UBtTRP基因 SgRNA引物的設(shè)計：
[0029] 基于煙粉風(fēng)MED隱種的BtTRP基因序列，設(shè)計SgRNA的祀標位點，引物序列如下：
[0030] MED-F：
[0031] GAAATTAATACGACTCACTATAGGACCAGGAGAGAGGCAAACTCGTTTTAGAGCTAGA
[0032] AATAGC；
[0033] sgRNA-R：
[0034] AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAAC
[0035] TTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC 〇
[0036] 2、合成化 TRP 基因 SgRNA:
[0037] 3、合成 Cas9mRNA
[0038] 4、顯微注射
[0039] 注射試劑:在30化體系中，將0.扣g sgRNA和lOiig化s9mRNA混合(大約摩爾比為2: 1 )，溶于化L 3M的醋酸鋼溶液中（pH 5.2)，并用3倍體積的無水乙醇沉淀濃縮(-20°C過夜沉 淀）。12000巧m離屯、30min，加75 %的乙醇，12000巧m離屯、5min，重復(fù)一次，注射前用11化水重 〇
[0040] 注射方法:收集煙粉風(fēng)M抓隱種紅眼期偽蛹，排列并粘附在事先貼有透氣雙面膠的 蓋玻片表面上。使用Femtojet Express化ppendo;rf)，femtotip 11針化ppendo;rf)和 InjectMan NI 2顯微注射儀，從尾端注射，注射壓強為llOOhPa左右，注射時間為0.1 s。
[0041 ]培育方法:將蓋玻片放置在瓊脂培養(yǎng)基上，放入人工氣候箱中使其完成發(fā)育。溫度 為26±rC，相對濕度60-80%，光周期為16L:8D。
[0042] 5、BtTRP基因突變品系獲得
[0043] 上述所獲得的顯微注射sgRNA和化s9mRNA混合液誘導(dǎo)形成的突變型煙粉風(fēng)即為煙 粉風(fēng)M邸隱種化TRP基因突變品系。
[0044] 實施例2: CRISPR/化s9系統(tǒng)誘導(dǎo)的煙粉風(fēng)M抓隱種化TRP基因突變品系的遺傳性分 析
[0045] 通過CRISPR/化s9技術(shù)獲得煙粉風(fēng)M抓隱種化TRP基因突變品系：sgRNA引物的設(shè)計 和合成、&s9mRNA的合成、顯微注射和化TRP基因突變品系的獲得，同實施例1。
[0046] (1)親本F0代的獲得:室溫下收集初羽化的BtTRP基因突變品系（顯微注射sgRNA和 化s9mRNA混合液誘導(dǎo)形成的突變型煙粉風(fēng)）（<化)于離屯、管，每管一頭，在顯微鏡下觀察并 區(qū)分雌雄，進行分組并記錄，作為基因突變品系的親本F0代，"培育方法"同實施例1。同理， 收集初羽化的野生型煙粉風(fēng)（<化)于PCR管，每管一頭，在解剖鏡下觀察并區(qū)分雌雄，進行 分組并記錄，作為野生型F0代，"培育方法"同實施例1。
[0047] (2)雜交F1代的獲得:將辨明雌雄并分組的F0代煙粉風(fēng)按照表1的組合進行雜交 后，放置于棉花上產(chǎn)卵3天，產(chǎn)卵后的棉花置于人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)(溫度為26±rc，相對濕 度60-80%，光周期為16L:8D)e3天后，收集煙粉風(fēng)于PCR管。每個組合5個重復(fù)，每個重復(fù)100 對成蟲。培養(yǎng)25天左右，收集小于3天蟲齡的煙粉風(fēng)作為F1代。
[004引表1雜交組合處理
[0049]
[0050] (3)自交F2代的獲得:收集F1代初羽化的煙粉風(fēng)（<化)于PCR管，每管一頭成蟲，在 解剖鏡下觀察區(qū)分雌雄進行分組，在同一雜交組合的F1代中選取雌雄個體，放置于棉花上 產(chǎn)卵3天，產(chǎn)卵后的棉花置于人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)(溫度為26±rC，相對濕度60-80%，光周期 為16L: 8D)。3天后，收集煙粉風(fēng)于PCR管。每個組合5個重復(fù)，每個重復(fù)100對成蟲。培養(yǎng)25天 左右，收集小于3天蟲齡的煙粉風(fēng)作為F2代。
[0051] (4)雜交后代高溫脅迫處理統(tǒng)計擊倒時間：用吸蟲器收集初羽化煙粉風(fēng)成蟲（< 化），放入PCR管，管口塞已消毒的脫脂棉團，每管1頭成蟲，分別編號。將裝有煙粉風(fēng)的PCR管 5個一組，同時插入漂浮板，將漂浮板置于由德國化ber溫度控制器（CC-106A,Germany， Huber Kiillcmaschinenbau GmbH)控溫的水浴槽內(nèi)，溫度提前設(shè)置為恒溫45°C，保持液面與脫 脂棉團下端齊平，使整個PCR管腔體都浸沒水中。在PCR管置于水浴槽內(nèi)Imin后，開始計時， 觀察管內(nèi)煙粉風(fēng)的活動狀態(tài)，W煙粉風(fēng)失去對身體的控制能力，無法自主站立作為熱擊倒 計時結(jié)束的標準，并將運段時間作為高溫擊倒時間TKD化eat knockdown time)。
[0052] 如圖1所示，不同雜交組合F2代煙粉風(fēng)之間耐熱性表型值差異，即觀察高溫脅迫后 擊倒時間。數(shù)據(jù)為均值±標準誤，單個處理樣本量為500頭。小寫字母表示耐熱性存在顯著 差異。(P<0.05)。
[0053] (5)雜交后代低溫脅迫處理統(tǒng)計恢復(fù)時間：用吸蟲器收集初羽化煙粉風(fēng)成蟲（< 化），放入PCR管，管口塞已消毒的脫脂棉團，每管1頭成蟲，分別編號。將裝有煙粉風(fēng)的PCR管 10個一組，同時插入塑料泡沫制成的漂浮板，將漂浮板置于由德國化ber溫度控制器(撕- 106A, Germany,化ber Kiii化m化chincnbauGmbH)控溫的內(nèi)置溫控腔體內(nèi)，腔體內(nèi)溫度提前設(shè) 置恒溫于-5°C，保持液面與脫脂棉團下端齊平，使整個PCR管腔體浸沒水中，并將低溫腔體 蓋嚴。在PCR管置于水浴槽內(nèi)lOmin后，迅速將其取出，擦干管壁上的水，置于室溫26°C環(huán)境 下，開始計時。觀察管內(nèi)煙粉風(fēng)的活動狀態(tài)，W煙粉風(fēng)逐漸恢復(fù)對身體的控制能力，能夠自 主站立作為冷擊倒恢復(fù)計時的標準，將運段時間作為冷致昏恢復(fù)時間TRC(chillcoma recovery time)。
[0054] 如圖2所示，不同雜交組合F2代煙粉風(fēng)之間耐寒性表型值差異，即觀察低溫脅迫后 恢復(fù)時間。數(shù)據(jù)為均值±標準誤，單個處理樣本量為500頭。小寫字母表示耐熱性存在顯著 差異（P<0.05)。
【主權(quán)項】
1. 一種獲得CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導(dǎo)的煙粉虱MED隱種BtTRP基因突變系的方法，其特征 在于，所述方法包括以下步驟： (1) BtTRP基因突變品系的獲得，包括以下步驟： (1 -1) BtTRP基因 sgRNA引物的設(shè)計： 基于煙粉虱MED隱種的BtTRP基因序列，設(shè)計sgRNA的靶標位點，引物序列如下： MED-F： GAAATTAATACGACTCACTATAGGACCAGGAGAGAGGCAAACTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC； sgRNA-R： AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCT CTAAAAC， (1-2)合成 BtTRP 基因 sgRNA， (1-3)合成〇3891111?熟， (1 -4)顯微注射，將步驟（1 -2)獲得的BtTRP基因 sgRNA和步驟（1 -3)獲得的Cas9mRNA混 合，摩爾比為2:1，注射至煙粉虱MED隱種紅眼期偽蛹，培育獲得BtTRP基因突變品系； (2) 獲得親本FOR; (3) 獲得雜交FIR; (4) 獲得自交F2代； (5) 高溫脅迫檢測，及低溫脅迫檢測，獲得穩(wěn)定的煙粉虱MED隱種BtTRP基因突變系。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的獲得CRI SPR/Cas9系統(tǒng)誘導(dǎo)的煙粉虱MED隱種BtTRP基因突變 系的方法，其特征在于，在步驟（1-4)中，注射后的煙粉虱MED隱種紅眼期偽蛹的培育條件 為:溫度為26±1°C，相對濕度60-80%，光周期為16L:8D。
【文檔編號】C12N15/89GK106047936SQ201610417540
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】呂志創(chuàng), 王原, 劉萬學(xué), 萬方浩
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所