一種長孢被孢霉pfy發(fā)酵黃姜提取薯蕷皂素的新工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種長孢被孢霉PFY發(fā)酵黃姜提取薯蕷皂素的新工藝，黃姜漿料用淀粉酶糖化后再接入長孢被孢霉PFY進行發(fā)酵，從發(fā)酵后的固體剩余物中提取油脂后，再用酸水解，從酸水解后的固體剩余物中提取薯蕷皂素。該方法與預發(fā)酵—酸水解法相比，消耗濃鹽酸的量可減少80?90%，皂素收率提高10%以上，另外得到兩種副產(chǎn)品：糖濃度為6%?10%的淀粉糖化液和產(chǎn)率為黃姜干重1.5%?3%的微生物油脂。
【專利說明】
一種長孢被孢霉PFY發(fā)酵黃姜提取薯蕷皂素的新工藝
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及一種長孢被孢霉PFY發(fā)酵黃姜提取薯蕷皂素的新工藝。首先通過淀粉酶酶解糖化，使黃姜淀粉轉化為可溶于水的糖，然后將剩余固體物用長孢被孢霉PFY發(fā)酵，降解掉大部分的纖維素，再進行酸解，最后提取皂素，形成酶解/發(fā)酵一一酸解聯(lián)合法生產(chǎn)薯蕷皂素新工藝。
【背景技術】
[0002]皂素是合成腎上腺皮質激素類藥物的主要原料，隨著其在臨床醫(yī)學上的使用率的提升，皂素的需求量也隨著增加。皂素一般從黃姜中提取得到，近年來黃姜種植業(yè)得到了很大的發(fā)展，并且成為部分農(nóng)村和山區(qū)人民的主要經(jīng)濟來源，也逐步成了地區(qū)性的產(chǎn)業(yè)。但是皂素生產(chǎn)企業(yè)作為一類化工企業(yè)，其帶來的污染也是非常嚴重的。黃姜主要種植地區(qū)和加工企業(yè)在湖北省長江流域沿線，企業(yè)的污水和廢渣嚴重威脅著該地區(qū)丹江和漢江的生態(tài)環(huán)境。加之近年來“南水北調工程”的實施，為了保護水源的安全，很多環(huán)評和排污不達標的生產(chǎn)加工企業(yè)都陸續(xù)被迀離甚至停產(chǎn)。在國家新的改革發(fā)展形勢下，污染問題已經(jīng)上升為制約皂素企業(yè)進一步發(fā)展的主要原因之一，也是眼下必須攻克的難題。
[0003]目前眾多科研工作者致力于薯蕷皂素的清潔生產(chǎn)工藝研究。大致的方向分為兩種，一種是在傳統(tǒng)的無機酸水解工藝基礎上進行工藝改進，另一種是開發(fā)非無機酸水解的清潔工藝。非無機酸的清潔生產(chǎn)工藝，包括離子交換樹脂催化法、離子液體催化法、生物轉化法以及熱分解處理法等。非無機酸水解清潔生產(chǎn)工藝藝幾乎實現(xiàn)了零污染排放，這與傳統(tǒng)無機酸有著本質的區(qū)別。但是非無機酸清潔生產(chǎn)工藝存在產(chǎn)率低、成本高等的問題。在國內(nèi)的皂素產(chǎn)業(yè)一般仍然選擇使用酸水解工藝，酸水解工藝開發(fā)最早，條件最成熟。
[0004]酸水解工藝一般包括直接酸水解工藝及改進后的預發(fā)酵-酸解聯(lián)合法工藝。在酸解過程中，黃姜含有的淀粉和纖維素也會被水解轉變?yōu)閱翁?、低聚糖等可溶于水的糖類以及高聚糖等，酸解液中含有較高濃度的而糖類物質。通過酸解作用，使得薯蕷皂苷連接的糖苷鍵斷裂，釋放出薯蕷皂素。再用相應的溶劑將薯蕷皂素從固體剩余物中萃取出來。通過后續(xù)的重結晶可得到高純度的薯蕷皂素成品。
[0005]直接酸水解法制備薯蕷皂素的得率不理想，其主要原因是薯蕷皂苷通過糖苷鍵與細胞壁上的纖維素相連，酸解作用不足以有效的打斷薯蕷皂素與糖殘基之間的連接。另一個原因是是薯蕷皂苷存在于細胞內(nèi)部，細胞壁上的組織比較堅韌，酸不足以穿透植物組織。更深層次的原因就是薯蕷皂素本身的分子結構歧鏈糖基在酸水解進行時產(chǎn)生了位阻，使得水解不完全，薯蕷皂素得率低。
[0006]四川省生物研究所薯蕷綜合利用組在《植物學報》1975年第3期上發(fā)表的《預發(fā)酵提高薯蕷皂素產(chǎn)率及淀粉綜合利用的研究》一文中最早對預發(fā)酵一酸水解法進行了介紹，最優(yōu)化方案為發(fā)酵溫度39-42 °C，發(fā)酵時間48 h，酸解固液比1:5，所用硫酸濃度為0.5mol/L，薯蕷皂素得率平均值為2.67%。與直接酸水解法(酸濃度為1!1101/1)相比，薯蕷皂素得率可提高23.4-39.8%。平均每批物料55.4kg，水解液體積平均為255L，生產(chǎn)Ig薯蕷皂素的水解液為172mL。
[0007]長孢被孢霉PFYdoriiereDa.elongata PFY)(CN 102618447A)為一株降解纖維素生產(chǎn)微生物油脂的真菌，由本實驗室從土壤中篩選出并保藏，其種屬由真菌的形態(tài)學和ITS全序列分析進行鑒定。姚日生等人利用長孢被孢霉PFY進行稻草秸桿的液態(tài)發(fā)酵，在秸桿濃度為20 g/L時，油脂產(chǎn)率為8.15 %。產(chǎn)生的微生物油脂中含有飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，組分含量分別為40%和56%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種長孢被孢霉PFY發(fā)酵黃姜提取薯蕷皂素的新工藝。
[0009]本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
一種長孢被孢霉PFY發(fā)酵黃姜提取薯蕷皂素的新工藝，包括以下步驟:
(I)將新鮮黃姜攪拌清洗去除泥沙，粉碎成黃姜漿料a;
(2 )加入淀粉酶進行酶解糖化，將糖化液離心，取出固體物b;
(3)把(2)中固體物b投入預混發(fā)酵培養(yǎng)基中，配置為成品發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后接種長孢被孢霉PFY，培養(yǎng)，將發(fā)酵液離心，取出固體物c，干燥；
(4)用沸程30-600C的石油醚從固體物c中提取油脂，在87-90 V下提取7.6_8h，提取后的剩余固體物記為d;
(5)將(4)中得到的固體物d進行酸解，然后離心分離，將分離后的固形物干燥、粉碎，記為e.’
(6 )用沸程60-90 0C的石油醚從(5 )中得到的粉碎固形物e中提取薯蕷皂素，在98_100 V下提取9.S-1Oh，得薯蕷皂素粗提物，將薯蕷皂素粗提物重結晶得薯蕷皂素純品。
[0010]—種長孢被孢霉PFY發(fā)酵黃姜提取薯蕷皂素的新工藝，所述步驟(2)中淀粉酶糖化前，黃姜漿料需加水調成固含量為15%-20%。
[0011]—種長孢被孢霉PFY發(fā)酵黃姜提取薯蕷皂素的新工藝，所述的淀粉酶為耐高溫α-淀粉酶，糖化時用鹽酸調黃姜漿料至PH為6-7，在100 0C下攪拌糖化2-6 h，酶用量為按照黃姜干重每g加入耐高溫α-淀粉酶50-200單位(U)。
[0012]一種長孢被孢霉PFY發(fā)酵黃姜提取薯蕷皂素的新工藝，所用的長孢被孢霉PFY為Mortierella.elongate CGMCC N0.50700
[0013]一種長孢被孢霉PFY發(fā)酵黃姜提取薯蕷皂素的新工藝，所述步驟(3)中的預混發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:酵母粉3-8 g/L、硫酸銨1-4 g/L、七水硫酸鎂0.3-0.7 g/L、磷酸二氫鉀
0.2-0.8 g/L，固體物b在成品培養(yǎng)基發(fā)酵中的含量為10-150 g/L。
[0014]—種長孢被孢霉PFY發(fā)酵黃姜提取薯蕷皂素的新工藝，所述步驟(3)中培養(yǎng)的條件為溫度30-35 °C、培養(yǎng)基初始pH值4-7、發(fā)酵時間3-10 d、接種量1_10%。
[0015]一種長孢被孢霉PFY發(fā)酵黃姜提取薯蕷皂素的新工藝，酸解所用酸為稀鹽酸，氫離子濃度為0.5-4 mol/L，酸用量為固液比1:3-1:8，酸解溫度100-130°(:，常壓或加壓酸解，酸解時間為0.5-6 ho
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點是:
本發(fā)明首先通過淀粉酶酶解糖化，使黃姜淀粉轉化為可溶于水的糖，再利用產(chǎn)微生物油脂的長孢被孢霉PFY(1 elongata PFY)，降解掉黃姜中大部分的纖維素生產(chǎn)油脂，并聯(lián)合酸解形成酶解/發(fā)酵一一酸解聯(lián)合法生產(chǎn)薯蕷皂素新工藝，大幅度降低了水解用酸量及洗滌用水量，并得到淀粉糖化液和微生物油脂兩種副產(chǎn)品，提高了黃姜資源的綜合利用率。
【附圖說明】
[0017]圖1為:酶解/發(fā)酵-酸解聯(lián)合法生產(chǎn)薯蕷皂素新工藝制備的薯蕷皂素HPLC圖譜；注:測試條件:高效液相色譜儀為日本島津的LC-15C，檢測波長210 nm，色譜柱Pursuit 5C18(150mm X 4.6 mm,5 μπι)，流動相為甲醇-水(95: 5)，流速:1 mL.min_l，進樣量 10 μ
L0
[0018]圖2為:微生物油脂的GC-MS圖譜。注:檢測方法:首先對提取物進行甲酯化，取樣0.lg，加入2mL 0.5N的 1(0!1-0130!1，60°(:水浴中皂化301^11，然后加入11^ 14%的CH3OH-BF3,60°C水浴中振蕩1min，加入ImL飽和的NaCl破乳，取上清液進行分析。
【具體實施方式】
[0019]下面結合實施例對本發(fā)明進一步詳細地描述，但本發(fā)明的實施例方式不限于此: 實施例1
(1)將固含量為25%的新鮮黃姜攪拌清洗去除泥沙，粉碎成黃姜漿料(I);
(2)黃姜漿料加水調成固含量為20%，加入耐高溫α-淀粉酶進行酶解糖化，糖化時用鹽酸調黃姜漿料至PH為6，在100 °C下攪拌糖化5 h，酶用量為按照黃姜干重每g加入耐高溫α-淀粉酶100單位，糖化完畢后，離心，固體剩余33%，取出固體物(2);
(3)把固體物(2)配置成發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基各成分為固體物(2)10g/L、酵母粉5 g/L、硫酸銨3 g/L、七水硫酸鎂0.5 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L;
(4)滅菌后接種長孢被孢霉PFY、接種量5%，搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)基初始pH值5、于30°C下發(fā)酵時間5 d，將發(fā)酵液離心，取出固體物(3 )，干燥，固體剩余40% ；
(5)提取油脂，得剩余固體物(4);
(6)將固體物(4)進行酸解，酸解所用酸為2mol/L稀鹽酸，酸用量為固液比1:8，在100°C下熱壓酸解，酸解時間為4 h。離心分離酸解固體剩余物，干燥后粉碎，得固體物(5);
(7)從固體剩余物(5)中提取薯蕷皂素，所用溶劑為沸程60-90°C石油醚、在100°C下提取 1h;
(8)油脂得率為黃姜原料干重的2.56%，薯蕷皂素得率為黃姜原料干重的2.97%，每生產(chǎn)Ig薯蕷皂素，水解液體積為35.4mL，消耗37%濃鹽酸的量為5.9mL。
[0020]實施例2:
(1)將固含量為30%的新鮮黃姜攪拌清洗去除泥沙，粉碎成黃姜漿料(I);
(2)黃姜漿料加水調成固含量為20%，加入耐高溫α-淀粉酶進行酶解糖化，糖化時用鹽酸調黃姜漿料至PH為6，在100 °C下攪拌糖化4 h，酶用量為按照黃姜干重每g加入耐高溫α-淀粉酶150單位，糖化完畢后，離心，取出固體物(2 )固體剩余35%;
(3)把固體物(2)配置成發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基各成分為固體物(2)80g/L、酵母粉6 g/L、硫酸銨3 g/L、七水硫酸鎂0.3 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L ο
[0021](4)滅菌后接種長孢被孢霉PFY，搖瓶培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)的條件為溫度34 °C、培養(yǎng)基初始PH值4、發(fā)酵時間7 d、接種量5%，將發(fā)酵液離心，取出固體物(3)，干燥，固體剩余57%; (5)提取油脂，得剩余固體物(4);
(6)將固體物(4)進行酸解，酸解所用酸為3mol/L稀鹽酸，酸用量為固液比1:6，在100°C下熱壓酸解，酸解時間為2 h。離心分離酸解固體剩余物，干燥后粉碎，得固體物(5);
(7)從固體剩余物(5)中提取薯蕷皂素，所用溶劑為沸程60-90°C石油醚、在100°C下提取 1h;
(8)油脂得率為黃姜原料干重的3.45%，薯蕷皂素得率為黃姜原料干重的2.85%，每生產(chǎn)Ig薯蕷皂素，水解液體積為28mL，消耗37%濃鹽酸的量為7.0mL0
[0022]實施例3:
(1)將固含量為20%的新鮮黃姜攪拌清洗去除泥沙，粉碎成黃姜漿料(I);
(2)加入耐高溫α-淀粉酶進行酶解糖化，糖化時用鹽酸調黃姜漿料至pH為6，在100°C下攪拌糖化2 h，酶用量為按照黃姜干重每g加入耐高溫α-淀粉酶80單位，糖化完畢后，離心，固體剩余36%，取出固體物(2 );
(3)把固體物(2)配置成發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基各成分為固體物(2)110g/L、酵母粉4 g/L、硫酸銨5 g/L、七水硫酸鎂0.6 g/L、磷酸二氫鉀0.2 g/L。
[0023](4)滅菌后接種長孢被孢霉PFY、接種量5%，培養(yǎng)基初始pH值6、于30 °C下發(fā)酵時間
10d、搖瓶轉速O r/min，將發(fā)酵液離心，取出固體物(3)，干燥，固體剩余60%;
(5)提取油脂，得剩余固體物(4);
(6)將固體物(4)進行酸解，酸解所用酸為Imol/L稀硫酸，酸用量為固液比1: 5，在100°C下熱壓酸解，酸解時間為6 h。離心分離酸解固體剩余物，干燥后粉碎，得固體物(5);
(7)從固體剩余物(5)中提取薯蕷皂素，所用溶劑為沸程60-90°C石油醚、在100°C下提取 1h;
(8)油脂得率為黃姜原料干重的1.56%，薯蕷皂素得率為黃姜原料干重的2.95%，每生產(chǎn)Ig薯蕷皂素，水解液體積55.SmL，消耗98%濃硫酸的量為3.1mL0
[0024]實施例4:
(1)將固含量為25%的新鮮黃姜攪拌清洗去除泥沙，粉碎成黃姜漿料(I);
(2)黃姜漿料加水調成固含量為15%，，加入耐高溫α-淀粉酶進行酶解糖化，糖化時用鹽酸調黃姜漿料至PH為6，在100 °C下攪拌糖化2 h，酶用量為按照黃姜干重每g加入耐高溫α-淀粉酶100單位，糖化完畢后，離心，固體剩余35%，取出固體物(2);
(3)把固體物(2)配置成發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基各成分為固體物(2)100g/L、酵母粉5 g/L、硫酸銨3 g/L、七水硫酸鎂0.5 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L。
[0025](4)滅菌后接種長孢被孢霉PFY、接種量10%，培養(yǎng)基初始pH值5、30 °C下發(fā)酵時間5d，將發(fā)酵液離心，取出固體物(3 )，干燥，固體剩余36%;
(5)提取油脂，得剩余固體物(4);
(6)將固體物(4)進行酸解，酸解所用酸為2mol/L稀鹽酸，酸用量為固液比1: 5，在110°C下熱壓酸解，酸解時間為4 h。離心分離酸解固體剩余物，干燥后粉碎，得固體物(5);
(7)從固體剩余物(5)中提取薯蕷皂素，所用溶劑為沸程60-90°C石油醚、在100°C下提取 1h;
(8)油脂得率為黃姜原料干重的3.02%，薯蕷皂素得率為黃姜原料干重的3.17%，每生產(chǎn)Ig薯蕷皂素，水解液體積為19.8mL，消耗37%濃鹽酸的量為3.3mL。
[0026] 參考例
預發(fā)酵一酸水解工藝:將同一批的鮮黃姜攪拌清洗去除泥沙，粉碎成黃姜漿料按照黃姜干重:水=1:5的量加水攪拌均勻，在40 °C下靜置發(fā)酵48 h，加入鹽酸調成2 mol/L的濃度，在120 °C下加壓酸解4 h。離心分離固體剩余物，干燥后研碎，用索氏提取器提取皂素，計算皂素得率。該法皂素得率為黃姜干重的2.57%，每生產(chǎn)Ig薯蕷皂素，水解液體積為194.4mL，消耗37%的濃鹽酸的量為32.4mL。
【主權項】
1.一種長孢被孢霉PFY發(fā)酵黃姜提取薯蕷皂素的新工藝，其特征在于，包括以下步驟: (I)將新鮮黃姜攪拌清洗去除泥沙，粉碎成黃姜漿料a; (2 )加入淀粉酶進行酶解糖化，將糖化液離心，取出固體物b; (3)把(2)中固體物b投入預混發(fā)酵培養(yǎng)基中，配置為成品發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌后接種長孢被孢霉PFY，培養(yǎng)，將發(fā)酵液離心，取出固體物c，干燥； (4)用沸程30-600C的石油醚從固體物c中提取油脂，在87-90 V下提取7.6_8h，提取后的剩余固體物記為d; (5 )將(4)中得到的固體物d進行酸解，然后離心分離，將分離后的固形物干燥、粉碎，記為e.’ C 6 )用沸程60-90 0C的石油醚從(5 )中得到的粉碎固形物e中提取薯蕷皂素，在98-100 V下提取9.S-1Oh，得薯蕷皂素粗提物，將薯蕷皂素粗提物重結晶得薯蕷皂素純品。2.根據(jù)權利要求1所述的一種長孢被孢霉PFY發(fā)酵黃姜提取薯蕷皂素的新工藝，其特征在于:所述步驟(2)中淀粉酶糖化前，黃姜漿料需加水調成固含量為15%-20%。3.根據(jù)權利要求1所述的一種長孢被孢霉PFY發(fā)酵黃姜提取薯蕷皂素的新工藝，其特征在于:所述的淀粉酶為耐高溫淀粉酶，糖化時用鹽酸調黃姜漿料至PH為6-7，在100 °(:下攪拌糖化2-6 h，酶用量為按照黃姜干重每g加入耐高溫α-淀粉酶50-200單位(U)。4.根據(jù)權利要求1所述的一種長孢被孢霉PFY發(fā)酵黃姜提取薯蕷皂素的新工藝，其特征在于:所用的長孢被孢霉PFY為J1riiereDa.elongate CGMCC N0.5070。5.根據(jù)權利要求1所述的一種長孢被孢霉PFY發(fā)酵黃姜提取薯蕷皂素的新工藝，其特征在于:所述步驟(3)中的預混發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為:酵母粉3-8 g/L、硫酸銨1-4 g/L、七水硫酸鎂0.3-0.7 g/L、磷酸二氫鉀0.2-0.8 g/L，固體物b在成品培養(yǎng)基發(fā)酵中的含量為10-150g/L。6.根據(jù)權利要求1所述的一種長孢被孢霉PFY發(fā)酵黃姜提取薯蕷皂素的新工藝，其特征在于:所述步驟(3)中培養(yǎng)的條件為溫度30-35 °C、培養(yǎng)基初始pH值4-7、發(fā)酵時間3-10 d、接種量1-10%。7.根據(jù)權利要求1所述的一種長孢被孢霉PFY發(fā)酵黃姜提取薯蕷皂素的新工藝，其特征在于:酸解所用酸為稀鹽酸，氫離子濃度為0.5-4 mo I/L，酸用量為固液比1: 3_1:8，酸解溫度100-1300C，常壓或加壓酸解，酸解時間為0.5-6 ho
【文檔編號】C11B1/00GK106046108SQ201610206212
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年4月1日 公開號201610206212.4, CN 106046108 A, CN 106046108A, CN 201610206212, CN-A-106046108, CN106046108 A, CN106046108A, CN201610206212, CN201610206212.4
【發(fā)明人】姚日生, 縱秋瑾, 鄧勝松, 王淮, 何紅波
【申請人】合肥工業(yè)大學