一種格隆溴銨的藥物組合物及其醫(yī)藥用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種格隆溴銨的藥物組合物及其醫(yī)藥用途，本發(fā)明提供的格隆溴銨的藥物組合物中含有格隆溴銨和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)，格隆溴銨、化合物(Ⅰ)單獨作用時，對宮頸癌具有治療作用；格隆溴銨和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時，治療效果進一步提高，可以開發(fā)成治療宮頸癌的藥物，與現(xiàn)有技術(shù)比具有突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步。
【專利說明】
一種格隆溴銨的藥物組合物及其醫(yī)藥用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及格隆溴銨的新用途，具體涉及格隆溴銨的藥物組 合物及其在宮頸癌中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 格隆溴銨為季銨類抗膽堿藥，具有抑制胃液分泌及調(diào)節(jié)胃腸蠕動作用;本品還有 比阿托品更強的抗唾液分泌作用，但沒有中樞性抗膽堿活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種格隆溴銨的藥物組合物，該藥物組合物中含有格隆溴 銨和一種天然產(chǎn)物，格隆溴銨和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同治療宮頸癌。
[0004] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：
[0005] 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0007] -種格隆溴銨的藥物組合物，包括格隆溴銨、如權(quán)利要求1所述的化合物（I)和藥 學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0008] 進一步地，藥學(xué)上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
[0009] 進一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0010] 上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將伸筋草粉碎，用70~80%乙 醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃 取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇萃取物 用大孔樹脂除雜，先用15 %乙醇洗脫6個柱體積，再用70 %乙醇洗脫10個柱體積，收集70 % 洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠 分離，依次用體積比為80:1、30:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d) 步驟(c)中組分3用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為25:1、15:1和2:1的二氯甲烷-甲 醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體 積百分濃度為72 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得 到純的化合物(I)。
[0011] 進一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)用75%乙醇熱回流提取，合并提取 液。
[0012]進一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0013]進一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯進行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0014] 上述化合物(I)在制備治療宮頸癌的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 上述格隆溴銨的藥物組合物在制備治療宮頸癌的藥物中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0017] 本發(fā)明提供的格隆溴銨的藥物組合物中含有格隆溴銨和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn) 物，格隆溴銨和該天然產(chǎn)物單獨作用時，對宮頸癌具有治療作用；二者聯(lián)合作用時，對宮頸 癌的治療效果進一步提高，可以開發(fā)成治療宮頸癌的藥物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突 出的實質(zhì)性特點和顯著的進步。
【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對 本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。
[0019] 實施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0020] 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化 學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0021]分離方法：（a)將伸筋草(2kg)粉碎，用75%乙醇熱回流提取(20LX 3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（4L)，依次用石油醚(4L X 3次）、乙酸乙酯（4L X 3次）和水飽和的正丁醇 (4LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 正丁醇萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫6個柱體積，再用70%乙醇洗脫10 個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫 濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1 (8個柱體積）、30:1 (8個柱體積）、15:1 (8個柱 體積)和5:1(10個柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組分3用 正相硅膠進一步分離，依次用體積比為25:1 (8個柱體積）、15:1 (10個柱體積)和2:1 (5個柱 體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的 反相硅膠分離，用體積百分濃度為72%的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個柱體積洗脫 液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)(純度大于98% )。
[0022] 結(jié)構(gòu)確證:冊431-]\^顯示[]\?^]+為111/2 337.1816，結(jié)合核磁特征可得分子式為 C20H26〇3，不飽和度為8。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ppm，DMS〇-d 6，600MHz): H-1 (7 · 87，s)，H-4 (3.26，d，J=lO.5)，H-5(5.76，d，J=lO.5)，H-7a(2.49，m)，H-70(1.67，m)，H-8a(2.Ol，m)， H-80(1.63，m)，H-9(1.31，m)，H-ll(1.83，m)，H-12(7.91，d，J=11.7)，H-14(3.12，s)，H-16 (1.93，s)，H-17(1.55，s)，H-18(3.68，d，J=10.9)，H-18(3.62，d，J = 10.9)，H-19(1.22，s)， !1-20(1.73,8);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)5。（？?111，0150-(16，15010^) :157.1(〇1，1-〇，139.2((：，2-C)，199.3(C，3-C)，54.8(CH，4-C)，119.7(CH，5-C)，144.3(C，6-C)，36.8(CH2,7-C)，28.2 (CH2,8-C)，30.1(CH，9-C)，31.1(C，10-C)，26.2(CH，11-C)，149.6(CH，12-C)，132.2(C，13-C)，72.6(CH，14-C)，60.5(C，15-C)，12.1(CH 3，16-C)，20.2(CH3，17-C)，70.5(CH2，18-C)， 12.3(〇13，19-〇，10.5(〇13,20-〇。1!1-匪1?譜顯示四個甲基信號[3!11.93(3!1，8，]^-16)，1.55 (3!1，8，]\^-17)，1.22(3!1，8，]\^-19)和1.73(3!1，8，]\^-20)]，一個含氧亞甲基質(zhì)子信號[3 H3.68(lH，d，J= 10·9Ηζ，H-18)和3.62( lH，d，J= 10·9Ηζ，H-18)]，三個烯屬次甲基質(zhì)子信號 [SH7.87(lH，s，H-l)，5.76(lH，d，J=10.5Hz，H-5WP7.91(lH，d，J=11.7Hz，H-12)]，&&- 個含氧次甲基質(zhì)子信號[陽3.12(1!1， 8，!1-14)]。13(：-匪1?譜顯示了20個碳信號，包括四個甲 基，三個亞甲基（一個含氧碳），七個次甲基（一個含氧次甲基，三個烯屬次甲基），以及六個 季碳(一個酮羰基，三個烯烴季碳以及一個含氧季碳）。HMBC譜中，H-1與C-2、C-3、C-4、C-15 和C-16,以及Me-16與C-1、C_2和C-3的相關(guān)性表明A環(huán)含有α，β-不飽和羰基結(jié)構(gòu)。通過對核 磁數(shù)據(jù)的分析可知該化合物含有一個環(huán)丙烷結(jié)構(gòu)，且季碳C-10連有一個羥甲基。HMBC譜中 羥甲基質(zhì)子信號（SH3.68和3.62)與〇9、〇10、(：-11和(：-19的相關(guān)性驗證了上述推論。含氧 質(zhì)子信號0H3.12，s，H-14)及相應(yīng)碳信號（SC72.6，C-14和60.5，C-15)表明該化合物含有一 個環(huán)氧結(jié)構(gòu)。ROESY譜中，H 2-18與Η_9α和H-ΙΙα的相關(guān)性表明18-CH2OH為α構(gòu)型。此外，H-5與 Me-17以及Η-12與Me-20的相關(guān)性能表明C-5與C-6，C-12與C-13的雙鍵分別為Ζ和Ε構(gòu)型。綜 合氫譜、碳譜、HMBC譜和ROESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如 下所示，立體構(gòu)型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致。
[0023]該化合物化學(xué)式及碳原子編號如下：
[0025] 實施例2:藥理作用
[0026]本實施例使用人宮頸癌Hela細(xì)胞懸液制備宮頸癌大鼠模型，檢測二組大鼠宮頸癌 組織中5111^；^；[11、038口386-3和038口386-7表達(dá)水平。觀察藥物下調(diào)宮頸癌大鼠凋亡抑制因 子Survivin水平，改善凋亡因子Caspase-3和Caspase-7的表達(dá)等方面的抗宮頸癌作用。 [0027] 1、材料與方法
[0028] 1.1動物
[0029] 6周齡雌性Wistar大鼠，平均體重（153±14)g，購于中國科學(xué)院上海動物中心。
[0030] 1.2試劑與樣品
[0031 ]格隆溴銨購自中國藥品生物制品檢定所?；衔铮↖)自制，制備方法見實施例1。人 宮頸癌Hela細(xì)胞株購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所；兔抗人Survivin抗體、兔抗人 Caspase-3抗體、兔抗人Caspase-7抗體和DAB顯色劑購于Cell Signalling Technology公 司。格隆溴銨、化合物(I)及其組合物先用少量DMS0超聲溶解，再用純化水溶解稀釋灌胃。 [0032] 1.3大鼠分組及模型制備
[0033]無菌操作下，取人宮頸癌Hela細(xì)胞置于RPMI-1640培養(yǎng)液(成為分10%胎牛血清和 2%谷氨酰胺）中，在37°C體積分?jǐn)?shù)為5%的⑶2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h至生長對數(shù) 期，用0.25 %胰酶消化細(xì)胞，10 %體積分?jǐn)?shù)的小牛血清培養(yǎng)基終止消化，1200r/min離心 lOmin，洗滌，調(diào)整細(xì)胞計數(shù)為107/mL，抽取人宮頸癌Hela細(xì)胞懸液，向大鼠腋窩皮下注射 0.5mL，常規(guī)飼養(yǎng)大鼠7d后見明顯腫瘤結(jié)節(jié)生長，為造模成功，剔除沒有造模成功的大鼠。大 鼠隨機分為5組，分別為正常對照組、模型對照組、格隆溴銨組(80mg · kg^1)、化合物（I)組 (80mg · kgU各隆溴銨與化合物（I)組合物組【40mg · kg^1格隆溴銨+40mg · kg^1化合物 (I)】。正常對照組為未造模的大鼠，予以混合飼料和純凈水飼養(yǎng)，由大鼠自行飲食。模型對 照組予以混合飼料和純凈水飼養(yǎng);藥物組在飼養(yǎng)的基礎(chǔ)上，每天灌胃給藥。
[0034] 1 · 4檢測 Survivin、Caspase_3 和 Caspase-7 的蛋白表達(dá)
[0035]大鼠飼養(yǎng)3周后處死，無菌操作下，模型組和給藥組取腫瘤組織50mg，正常對照組 腋窩皮下組織50mg，將選取好的組織經(jīng)PBS緩沖液洗滌，將洗滌后的組織研磨、離心收集，用 冰冷roS洗滌細(xì)胞3次后，加入裂解緩沖液，搖勻，置于4°C水中冰浴30min，1200r/min離心 1 Omin，吸取上清液，即胞質(zhì)蛋白。采用BCA法對樣品蛋白質(zhì)進行蛋白定量。調(diào)整樣品蛋白量 為30~40yg后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PBST洗膜5min后， PBST溶解封閉PVDF膜2h。繼而加入兔抗人Survivin抗體、兔抗人Caspase-3抗體、兔抗人 Caspase-7抗體(按1:1000稀釋)或抗β-actind :2000稀釋），置于4°C環(huán)境中過夜。PBST洗滌 3次，每次lOmin，加入二抗，溫室孵育2h。再次用TOST洗滌3次，每次lOmin。將PVDF膜ECL顯 色，在暗室中將PVDF曝光于X光片中，用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。
[0036] 1.5統(tǒng)計學(xué)方法
[0037]實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X土s)表示，應(yīng)用SPSS18.0版統(tǒng)計軟件進行單因素方差 分析和t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0038] 2、實驗結(jié)果
[0039] 2.1對宮頸癌模型大鼠移植瘤體積的的影響
[0040] 實驗結(jié)束后，正常對照組未見腫瘤生長；與模型對照組比較，格隆溴銨與化合物 (I)組合物組腫瘤體積明顯縮小(P<〇.01);與模型對照組比較，格隆溴銨組、化合物（I)組 腫瘤體積縮小(P<〇.〇5)。
[0041] 試驗結(jié)果見表1，體積單位為mm3。
[0042] 2 · 2對宮頸癌模型大鼠移植瘤組織中Survivin、Caspase-3和Caspase-7蛋白表達(dá) 的影響
[0043] 與正常對照組比較，模型對照組組大鼠腫瘤組織中Survivin的表達(dá)明顯升高，而 其Caspase-3和Caspase-7蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型對照 組比較，格隆溴銨與化合物（I)組合物組大鼠腫瘤組織中Survivin的表達(dá)較明顯降低(P< 0 · 01)，Caspase-3和Caspase-7蛋白的表達(dá)均顯著升高(P<0 · 01);與模型對照組比較，格隆 溴銨組、化合物（I)組大鼠腫瘤組織中Survivin的表達(dá)降低（P<0.05)，Caspase-3和 Caspase-7蛋白的表達(dá)均升高(P<0.05)。試驗結(jié)果見表1。
[0044] 表1對移植瘤體積和移植瘤組織中Survivin、Caspase-3和Caspase-7蛋白表達(dá)的 影響

[0046] 宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，是最常見的婦科惡性腫瘤。本病是由 宮頸上皮內(nèi)瘤變形成后繼續(xù)發(fā)展，突破上皮下基膜侵潤間質(zhì)，形成宮頸侵潤癌。宮頸轉(zhuǎn)化區(qū) 上皮化生過度活躍，并在致癌因素作用下也可形成宮頸侵潤癌。常與性生活紊亂、分娩次數(shù) 多、高危型HPV感染、早婚等因素有關(guān)。本病發(fā)病初期可有接觸性出血、陰道異常分泌物等癥 狀，但多數(shù)患者早期常無明顯癥狀和體征，晚期可出現(xiàn)陰道出現(xiàn)不規(guī)則流血以及癌組織累 及其他組織器官出現(xiàn)的繼發(fā)性癥狀。據(jù)調(diào)查統(tǒng)計，我國宮頸癌患病率仍處于逐年上升趨勢。
[0047] 細(xì)胞凋亡促進因子和凋亡抑制因子共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程。Survivin是目前發(fā)現(xiàn) 凋亡抑制作用最強的因子，能夠抑制凋亡促進因子酶原轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚缘蛲龃龠M因子，抑制細(xì) 胞凋亡，在正常人組織中幾乎零表達(dá)，但在惡性腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展 中起到不可忽略的作用。有研究報道，正常人體組織中Survivin為低表達(dá)，宮頸CIN患者組 織中Survivin呈中等表達(dá)，而宮頸癌患者組織中Survivin呈現(xiàn)出高表達(dá)。根據(jù)Survivin這 一特點，可將Survivin做為判斷惡性腫瘤預(yù)后和輔助診斷的重要指標(biāo)，也可為惡性腫瘤靶 點治療提供依據(jù)。Caspase-3和Caspase-7是凋亡促進因子Caspase家族的重要成員，具有誘 導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。人體少數(shù)細(xì)胞非依賴凋亡促進因子，但大多數(shù)細(xì)胞凋亡依賴凋亡因子的 誘導(dǎo)，當(dāng)?shù)蛲龃龠M因子被抑制，活性受到抑制，細(xì)胞凋亡與增殖平衡失調(diào)，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。凋 亡抑制因子Survivin下調(diào)時，凋亡促進因子Caspase上調(diào)，促進細(xì)胞凋亡，Survivin可直接 或間接作用于Caspase來抑制細(xì)胞凋亡。
[0048] 上述結(jié)果表明，格隆溴銨、化合物（I)單獨作用時，對宮頸癌具有治療作用;格隆溴 銨和化合物(I)聯(lián)合作用時，治療效果進一步提高，可以開發(fā)成治療宮頸癌的藥物。
[0049] 上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. -種格隆溴銨的藥物組合物，其特征在于:包括格隆溴銨、如權(quán)利要求1所述的化合 物(I)和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的格隆溴銨的藥物組合物，其特征在于:藥學(xué)上可以接受的載體 包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體 或潤滑劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的格隆溴銨的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、膠 囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、 栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將伸 筋草粉碎，用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步驟(a)中正丁醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫6個柱體積，再用70%乙醇洗 脫10個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇 洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、30:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組分3用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為25:1、15:1 和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的 反相硅膠分離，用體積百分濃度為72%的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個柱體積洗脫 液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)用75%乙醇熱回 流提取，合并提取液。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為D101型 大孔吸附樹脂。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯進行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療宮頸癌的藥物中的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求2~4任一所述的格隆溴銨的藥物組合物在制備治療宮頸癌的藥物中的應(yīng) 用。
【文檔編號】C07D303/32GK106045943SQ201610372617
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月28日
【發(fā)明人】黃芳
【申請人】黃芳