用于治療肺動脈高血壓的材料和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微小RNA 96及其前體和模擬物用于抑制血管細胞增殖和/或血管重塑，以及用于治療相關醫(yī)學病況，如肺動脈高血壓(PAH)的用途。
【專利說明】用于治療肺動脈高血壓的材料和方法 發(fā)明領域
[0001 ]本發(fā)明涉及微小RNA 96及其前體和模擬物用于抑制血管細胞增殖和/或血管重 塑，以及用于治療相關醫(yī)學病況，如肺動脈高血壓(PAH)的用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 肺動脈高血壓(PAH)是一種以重度肺動脈重塑和閉塞性肺血管損傷，從而導致右 心室衰竭為特征的破壞性疾病。最近的流行病學研究報告了疾病的發(fā)生在女性中較大;根 據疾病分類，女性與男性比率可以大到4:1、
[0004] PAH具有每年影響2-3/百萬的不良預后；PAH患者分別具有68%、48%和34%的1 年、3年和5年存活率。依靠目前的療法不能顯著增加存活，并且對新的治療方法有迫切的需 要。
[0005] 遺傳性PAH與BMPR2的基因中的突變有關，所述BMPR2經由smadl/ID途徑進行信號 傳導 2。5_羥色胺也通過促進PASMC增殖和收縮在PAH的形成中發(fā)揮關鍵作用。這可以藉由其 通過色氨酸羥化酶1 (TPH1)合成34，通過經由5-羥色胺轉運蛋白（SERT)進入細胞中和/或通 過活化5HT1B受體 3'6一13。
[0006] 我們已證明了，在僅雌性形成肺性高血壓(PH)的PH的三種動物模型（SERT+小鼠1Q、 mtsl過表達小鼠 14和經右芬氟拉明（dexfenf luramine)處理的小鼠15)中，PH的形成可以是 5-羥色胺依賴性的，并且依賴于內源雌激素和/或雌激素代謝15~。這提示了性別、雌激素和 5-羥色胺是PH中的相互作用風險因素。
[0007] 微小RNA(miR)是小的非編碼RNA，其經由阻抑翻譯（經由抑制翻譯或誘導mRNA降 解)而對細胞功能具有實質性影響。微小RNA源自由RNA pol II合成的初級RNA轉錄物(pri-miRNA)，其長度可以是幾千個核苷酸。單一 pri-miRNA轉錄物可以引起超過一種活性miRNA。
[0008] 在核中，酶III類RNA酶Drosha將pri-miRNA轉錄物加工成由莖-環(huán)或發(fā)夾結構組成 的前體miRNA(pre-miRNA)，長度通常為70至100個左右的核苷酸。然后，將pre-miRNA轉運到 胞質，在那里它被RNA酶Dicer進一步加工，除去環(huán)，并且產生成熟雙鏈miRNA分子，其具有與 完全或部分互補的"過客"鏈雜交的活性"引導"鏈(長度通常為15至25個核苷酸）。
[0009] 然后，成熟的雙鏈miRNA被摻入RNA誘導的沉默復合物中，在那里指導鏈與祀mRNA 中的結合位點雜交。
[0010] 指導鏈可以不與靶結合位點完全互補。然而，稱作"種子"序列的指導鏈的區(qū)域通 常與靶結合位點的相應序列完全互補。種子序列通常是2至8個核苷酸的長度，并且位于指 導鏈的5 '端處或附近(在5 '端的1或2個核苷酸內）。
[0011] 認為單一未配對的指導鏈也可以能夠被摻入RISC中。還認為阻礙過客鏈對RISC的 摻入的對過客鏈(例如對糖、堿基或主鏈結構）的修飾也可以提高通過雙鏈miRNA進行的靶 物抑制的效率。
[0012] 先前已經顯示了某些miR調節(jié)影響PAH的基因18-2Q。
[0013] 發(fā)明概述
[0014]在其最廣泛的形式中，本發(fā)明涉及微小RNA 96(miR-96)及其前體、模擬物和激動 劑用于抑制血管細胞增殖和/或血管重塑，以及用于治療相關醫(yī)學病況，如PAH的用途。 [0015] 不希望被理論束縛，認為在表達5-HT1B受體的細胞中提高miR-96表達或活性可以 是特別有效的。祀細胞包括血管細胞和與血管系統(tǒng)有關的細胞。
[0016] 本發(fā)明提供了用于抑制血管細胞增殖和/或血管重塑的方法，包括對靶細胞遞送， 或對受試者施用：
[0017] (a)miR-96、其模擬物、或任一者的前體;或
[0018] (b)編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸。
[0019] 本發(fā)明還提供了用于預防或治療肺性高血壓的方法，包括對靶細胞遞送，或對受 試者施用：
[0020] (a)miR-96、其模擬物、或任一者的前體;或
[0021 ] (b)編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸。
[0022] 本發(fā)明還提供了 miR-96、其模擬物、或任一者的前體，其用于抑制血管細胞增殖 和/或血管重塑的方法中。
[0023] 本發(fā)明還提供了 miR-96、其模擬物、或任一者的前體，其用于預防或治療肺性高血 壓，尤其是肺動脈高血壓的方法中。
[0024] 本發(fā)明還提供了 miR-96、其模擬物、或任一者的前體在制備用于抑制血管細胞增 殖和/或血管重塑的藥物中的用途。
[0025] 本發(fā)明還提供了 miR-96、其模擬物、或任一者的前體在制備用于預防或治療肺性 高血壓，尤其是肺動脈高血壓的藥物中的用途。
[0026] 本發(fā)明還提供了編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸，其用于抑制血管 細胞增殖和/或血管重塑的方法中。
[0027] 本發(fā)明還提供了編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸，其用于預防或治 療肺性高血壓，尤其是肺動脈高血壓的方法中。
[0028] 本發(fā)明還提供了編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸在制備用于抑制 血管細胞增殖和/或血管重塑的藥物中的用途。
[0029] 本發(fā)明還提供了編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸在制備用于預防 或治療肺性高血壓，尤其是肺動脈高血壓的藥物中的用途。
[0030] 在所有方面中，本發(fā)明本質上牽涉提高靶細胞中的miR-96活性。
[0031 ] 這可以通過對革E細胞直接遞送miR-96，通過遞送miR-96模擬物，或者通過遞送在 靶細胞內加工成活性miR-96或miR-96模擬物的前體分子而實現。
[0032]或者，它可通過對靶細胞遞送編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸，使 得在靶細胞內表達活性miR-96或miR-96模擬物、或任一者的前體而實現。
[0033] 靶細胞通常表達5-HT1B受體。靶細胞可以是血管細胞，如血管平滑肌細胞(VSMC) 或血管內皮細胞。具體地，它可以是肺動脈平滑肌細胞(PASMC)或肺動脈內皮細胞?；蛘撸?可以是與血管系統(tǒng)有關的細胞。與血管系統(tǒng)有關的細胞是位于血管內，或管壁中的細胞，包 括內皮、平滑肌或外膜。血管系統(tǒng)可以是肺血管系統(tǒng)。血管系統(tǒng)可以是動脈，如肺動脈。因 此，與血管系統(tǒng)有關的細胞包括外膜成纖維細胞和免疫細胞，例如淋巴細胞(尤其是T淋巴 細胞）、單核細胞、巨噬細胞和肥大細胞。
[0034]可以在體外、在體內或離體進行牽涉遞送到靶細胞的方法。
[0035] 可以與合適的載體分子，如藥學可接受脂質或聚合物結合(例如與所述合適的載 體分子復合或由合適的載體分子包囊)遞送miR-96、模擬物或前體。
[0036] 可以以裸核酸遞送編碼miR-96、模擬物或前體的核酸?；蛘?，它可以與合適的載體 分子，如藥學可接受脂質或聚合物結合(例如與所述合適的載體分子復合或由合適的載體 分子包囊)而遞送。在任一種情況中，核酸通常是DNA。
[0037] 載體分子可以進一步包含能夠結合于靶細胞表面的靶向劑。
[0038] 或者，可以經由病毒載體遞送編碼miR-96、模擬物或前體的核酸。
[0039] 可以采用任何合適類型的病毒載體，包括腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、逆轉錄病毒 (尤其是慢病毒)和皰疹病毒載體。腺病毒和慢病毒可以是特別優(yōu)選的，因為它們具有在不 活躍分裂的細胞中實現遞送的基因的表達的能力。
[0040] miR-96及其前體
[0041 ]術語"miR-96"在本說明書中用于指由以下序列組成的RNA寡核苷酸：
[0042] UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU〇
[0043] 這是大多數哺乳動物中的成熟miR-96的序列，包括人、大猩猩(gorilla)、黑猩猩 (chimpanzee)、猩猩（orang-utan)、獼猴(macaque)、狨猴(marmoset)、小鼠、大鼠、兔、牛、 豬、馬和犬。
[0044] 成熟序列的核苷酸2至7稱作"種子"區(qū)，其結合祀mRNA，并且具有序列：
[0045] UUGGCA。
[0046] 活性miR-96寡核苷酸(或"指導鏈"）可以是單鏈的，或者它可以與第二個RNA寡核 苷酸(稱為"過客鏈"）雜交。指導鏈和過客鏈在雜交的復合物中彼此反平行運行，所述雜交 的復合物可以稱為"雙鏈miR-96"。指導鏈在以分離形式存在時可以稱為"單鏈miR-96"。
[0047] 過客鏈和指導鏈可以含有許多錯配，因此并非一條或兩條鏈中的所有核苷酸與另 一條鏈中的互補核苷酸雜交。因此，雙鏈miR-96可以含有一個或多個凸起(凸起是僅一條鏈 中的未配對的核苷酸，或多個連續(xù)的未配對的核苷酸)或內部環(huán)(兩條鏈中的對向的未配對 的核苷酸）。末端的一個或多個核苷酸也可以是未配對的。
[0048]過客鏈可以與指導鏈的種子序列是100%互補的。
[0049] 雙鏈miR-96的一條鏈或兩條鏈可以包含3'突出端，例如1、2或3個核苷酸的3'突出 端。也就是說，在鏈的3'端的核苷酸延伸出互補鏈的最5'的核苷酸(包括未配對的末端核苷 酸），并且因此在互補鏈中沒有相應的核苷酸。例如，兩條鏈都包含1、2或3個核苷酸的3'突 出端?；蛘撸瑥秃衔镌谝粋€或兩個末端可以是平端的。在一些實施方案中，過客鏈與指導鏈 是相同的長度，或者長度上相差例如多達5個核苷酸或甚至更多，這取決于兩條鏈之間的錯 配程度和任何3'突出端的長度。
[0050] 成熟的天然miR-96過客鏈具有序列：
[0051 ] 5' -AAUCAUGUGCAGUGCCAAUAUG-3'，并且認為如下與指導鏈配對：
指導?：
[0052] 過客：
[0053]因此，過客鏈具有3'未配對的核苷酸和3個核苷酸的3'突出端。指導鏈具有3個核 苷酸的3'突出端。雜交的復合物具有以指導鏈中的一個凸起和內部環(huán)分開的三個互補性區(qū) 域(它們之一包含整個種子序列）。
[0054] miR-96的前體包括pre-mir-96和pri-mir-96，以及其可以被加工為成熟miR-96 (無論單鏈還是雙鏈)的片段和變體。
[0055] 術語"pre-mir-96"用于指由任何全長哺乳動物pre-mir-96序列組成的RNA寡核苷 酸，或其包含通過環(huán)序列與相應的過客序列連接的成熟miR-96指導序列的片段或變體，所 述過客序列與指導序列完全或部分互補，并且其中寡核苷酸能夠形成其中指導序列和過客 序列彼此雜交的莖-環(huán)結構(或"發(fā)夾"）。
[0056] pre-mir-96能夠充當雙鏈RNA特異性核糖核酸酶(RNA酶III型酶)Dicer的底物，由 此它被加工為成熟的雙鏈miR-96。
[0057] 全長哺乳動物pre-mir-96序列包含人序列(hsa-pre-mir-96):
[0061 ]在這兩種情況中，（指導鏈的)成熟序列加下劃線。
[0062] 與顯示的序列相比，pre-mir-96可以擁有成熟序列外部的一個或多個修飾。
[0063] 例如，成熟序列上游(5'）的序列可以與相應的人或鼠序列具有至少50%同一性、 至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至 少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92 %同一,性、至少 93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95%同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一,性、至少 98%同一性、或至少99%同一性。例如，上游序列在與5'人序列最佳比對時可以與其相差1、 2、3或4個核苷酸，或者在與5'鼠序列最佳比對時可以與其相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11 個核苷酸。
[0064] 例如，成熟序列下游(3'）的序列可以與相應的人或鼠序列具有至少50%同一性、 至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至 少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92 %同一,性、至少 93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95%同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一,性、至少 98%同一性、或至少99%同一性。例如，下游序列在與3'人序列最佳比對時可以與其相差多 達5、多達10、多達15或多達20個核苷酸，或者在與3'鼠序列最佳比對時可以與其相差多達 5、多達10、多達15、多達20、多達25或多達30個核苷酸。
[0065] 術語"pri-mir-96"用于指由任何長度的哺乳動物pri-mir-96序列組成的RNA寡核 苷酸，或者其包含pre-mir-96序列并且能夠被雙鏈RNA特異性核糖核酸酶(RNA酶III型酶） Drosha加工成pre-mir-96序列的片段或變體。
[0066] 全長哺乳動物pri-mir-96序列包括人序列(hsa-pri-mir-96):
[0070] 再一次，成熟序列加下劃線。
[0071] 與顯示的序列相比，pri-mir-96可以擁有成熟序列外部或天然pre-mir-96序列外 部的一個或多個修飾。
[0072] 例如，成熟序列上游(5'）的序列可以與相應的人或鼠序列具有至少50%同一性、 至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至 少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92 %同一,性、至少 93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95%同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一,性、至少 98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0073] 例如，pre-mir-96序列上游(5'）的序列可以與相應的人或鼠序列具有至少50%同 一*性、至少55 %同一,性、至少60%同一,性、至少65 %同一,性、至少70%同一,性、至少75 %同一 性、至少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92%同一 性、至少93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95 %同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一 性、至少98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0074] 例如，成熟序列下游(3'）的序列可以與相應的人或鼠序列具有至少50%同一性、 至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至 少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92 %同一,性、至少 93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95%同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一,性、至少 98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0075] 例如，天然pre-mir-96序列下游（3'）的序列可以與相應的人或鼠序列具有至少 50 %同一1性、至少55 %同一1性、至少60%同一1性、至少65 %同一1性、至少70 %同一1性、至少 75 %同一,性、至少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少 92 %同一,性、至少93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95 %同一,性、至少96 %同一,性、至少 97 %同一性、至少98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0076] miR-96前體可以是任何合適的長度，只要它可以被加工為成熟的miR-96(無論是 單鏈還是雙鏈）。因此，前體的長度是至少23個核苷酸，并且長度可以是至少25、至少30、至 少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至 少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少200、至少250、 至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少1000、至少1500或至少2000個核苷酸。
[0077] 或者，前體的長度可以是25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、 100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500、1000、1500、2000 或 2500個核 苷酸的最大值。
[0078] 應當注意到，術語"寡核苷酸"并不意圖暗示任何具體的長度，并且僅僅用于指連 接的核苷酸的任何單一連續(xù)鏈。
[0079] miR-96模擬物及其前體
[0080] miR-96模擬物是與天然存在的miR-96相比具有結構或序列中的一個或多個修飾， 但是保留與由miR-96調節(jié)的mRNA中的miR-96結合位點雜交，并且抑制5-HT1B受體表達的能 力的寡核苷酸。由miR-96調節(jié)的mRNA包括通過miR-96的結合抑制其翻譯或加速其降解的那 些mRNA(如5-HT1B mRNA)。
[0081 ] miR-96結合位點的一個例子是存在于Htrlb mRNA(即編碼5HT1B受體的基因）中的 序列 TGTGCTAGTGCCAAA。
[0082] miR-96模擬物寡核苷酸的長度通常是15-25個核苷酸，例如長度為18至25、20至 25，例如20至23、例如20、21、22或23個核苷酸。
[0083]與miR-96相比，miR-96模擬物可以在堿基序列、核苷酸結構、和/或主鏈連接上有 所不同。
[0084] miR-96模擬物通常包含與天然種子序列相同的種子序列:UUGGCA。
[0085] miR-96模擬物可以包含具有成熟天然序列的寡核苷酸或者由具有成熟天然序列 的寡核苷酸組成：
[0086] UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU [0087](其中種子序列加下劃線）。
[0088] miR-96模擬物可以與種子序列外部的成熟天然序列不同。例如，它可以在1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10個位置(它們都必須位于種子序列外部)處與成熟的天然序列不同。
[0089] miR-96模擬物可以與第二寡核苷酸雜交。與天然的miR-96-樣，活性寡核苷酸可 以稱為"指導鏈"，并且結合的寡核苷酸稱為"過客鏈"。雜交的復合物可以稱為雙鏈miR-96 模擬物。
[0090]模擬物過客鏈的序列可以與天然過客鏈的序列相同或者可以在一個或多個位置 處與天然過客鏈不同。例如，模擬物過客鏈的序列可以在不超過10個位置、不超過9個位置、 不超過8個位置、不超過7個位置、不超過6個位置、不超過5個位置、不超過4個位置、不超過3 個位置、不超過2個位置或不超過1個位置處與天然過客鏈的序列不同。優(yōu)選地，過客鏈與指 導鏈的種子序列是100%互補的，并且模擬物序列和天然序列之間的任何序列差異在與種 子序列互補的區(qū)域外部發(fā)生。
[0091 ]雙鏈miR-96模擬物的一條或兩條鏈可以含有3 '突出端，例如1、2或3個核苷酸的3 ' 突出端。例如，兩條鏈都可以包含3個核苷酸的3'突出端。或者，復合物可以在一個或兩個末 端是平端的。過客鏈和指導鏈可以含有一個或多個錯配。在一些實施方案中，過客鏈與指導 鏈是相同長度，或者在長度上相差多達5個核苷酸。
[0092] miR-96模擬物的前體是可以通常通過酶Dicer的作用或者通過酶Drosha和Dicer 的序貫作用在靶細胞內被加工成miR-96模擬物的任何分子。
[0093] 因此，前體可以具有模擬物序列上游(5'）和/或下游(3'）的額外寡核苷酸序列。
[0094] 前體可以含有通過環(huán)序列與同指導序列完全或部分互補的相應過客序列連接的 miR-96模擬物指導序列，并且其中寡核苷酸能夠形成莖-環(huán)結構(或"發(fā)夾"），其中指導序列 和過客序列彼此雜交。此類寡核苷酸可以被認為pre-mir-96模擬物，并且能夠充當用于雙 鏈RNA特異性核糖核酸酶(RNA酶III型酶)Dicer的底物，由此它被加工成包含分開的指導鏈 和過客鏈的雙鏈miR-96模擬物。
[0095] 例如，成熟序列上游(5'）的序列可以與相應的人或鼠序列具有至少50%同一性、 至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至 少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92 %同一,性、至少 93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95%同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一,性、至少 98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0096] 例如，成熟序列下游(3'）的序列可以與相應的人或鼠序列具有至少50%同一性、 至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至 少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92 %同一,性、至少 93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95%同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一,性、至少 98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0097]或者，前體可以是pri-mir-96模擬物（即，它具有pre-mir-96模擬物序列上游(5'） 和/或下游(3'）的額外的寡核苷酸序列），并且能夠被雙鏈RNA特異性核糖核酸酶(RNA酶III 型酶)Drosha加工成pre-mir-96模擬物序列。
[0098] 例如，成熟miR-96模擬物序列上游(5'）的序列可以與相應的天然的人或鼠序列具 有例如至少50 %同一,性、至少55 %同一,性、至少60 %同一,性、至少65 %同一,性、至少70 %同 一*性、至少75 %同一,性、至少80%同一,性、至少85 %同一,性、至少90%同一,性、至少91 %同一 性、至少92 %同一,性、至少93%同一,性、至少94%同一,性、至少95 %同一,性、至少96%同一 性、至少97 %同一1性、至少98 %同一1性、或至少99 %同一1性。
[0099] 例如，pre-mir-96模擬物序列上游(5'）的序列可以與相應的人或鼠序列具有至少 50 %同一1性、至少55 %同一1性、至少60%同一1性、至少65 %同一1性、至少70 %同一1性、至少 75 %同一,性、至少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少 92 %同一,性、至少93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95 %同一,性、至少96 %同一,性、至少 97 %同一性、至少98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0100] 例如，成熟miR-96模擬物序列下游(3'）的序列可以與相應的人或鼠序列具有至少 50 %同一1性、至少55 %同一1性、至少60%同一1性、至少65 %同一1性、至少70 %同一1性、至少 75 %同一,性、至少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少 92 %同一,性、至少93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95 %同一,性、至少96 %同一,性、至少 97 %同一性、至少98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0101] 例如，pre-mir-96模擬物序列下游(3'）的序列可以與相應的人或鼠序列具有至少 50 %同一1性、至少55 %同一1性、至少60%同一1性、至少65 %同一1性、至少70 %同一1性、至少 75 %同一,性、至少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少 92 %同一,性、至少93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95 %同一,性、至少96 %同一,性、至少 97 %同一性、至少98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0102] miR-96模擬物前體可以是任何合適的長度，只要它可以被加工為成熟的miR-96模 擬物(無論是單鏈還是雙鏈）。因此，前體的長度是至少23個核苷酸，并且長度可以是至少 25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少 80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少 200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少1000、至少1500或至少 2000個核苷酸。
[0103]或者，前體的長度可以是25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、 100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500、1000、1500、2000 或 2500個核 苷酸的最大值。
[0104] 結構修飾
[0105] 在上文討論的序列修飾外，或者作為上文討論的序列修飾的備選，與RNA寡核苷酸 相比，miR-96模擬物或其前體可以包含一個或多個結構修飾。
[0106] miR-96模擬物或前體可以包含一個或多個包含經修飾的糖殘基（即核糖殘基之外 的糖殘基)的核苷酸。
[0107] 經修飾的糖殘基包括碳環(huán)糖或無環(huán)糖、在其2'、3'或4'位置的一處或多處具有取 代基基團的糖和具有替換糖的一個或多個氫原子的取代基的糖。
[0108]合適的經修飾的糖可以擁有糖取代基基團，其選自：〇H;F;〇-、S-、或N-烷基;0-、 S-、或N-烯基;0-、S-或N-炔基;或0-烷基-0-烷基。烷基、烯基和炔基可以是經取代的或未取 代的C1至C10烷基或C 2至C10烯基和炔基。在一些實施方案中，這些基團可選自：0(CH2) x〇ch3、0 (( ch2 ) x0) yCH3、0 ( ch2 ) xNH2、0 ( ch2 ) xCH3、0 ( ch2 ) x〇nh2、和0 ( ch2 ) x〇n (( ch2 ) xCH3 ) 2，其中 X 和y是1至10。
[0109] 糖取代基基團可以包括&至&〇低級烷基、經取代的低級烷基、烯基、炔基、烷芳基、 芳烷基、0-烷芳基或 0-芳烷基、SH、SCH3、Cl、Br、CN、OCN、CF3、0CF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、N〇2、 N 3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基和經取代的甲硅烷基。
[0110] 其它取代基基團包括2'-甲氧基乙氧基和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基、烯丙基(_ CH2 _CH=CH2)、_0_稀丙基(_0_CH2 _CH=CH2)、甲氧基_0_CH3)、氛基丙氧基(-OCH2CH2CH2NH2)、 和氟(F)。
[0111] 2'位置(2'_)上的糖取代基基團可以在阿拉伯糖（上)位置或核糖（下）位置中。一 種2'-阿拉伯糖修飾是2'-F。也可以在寡聚體化合物上的其它位置處，特別是3'端核苷上的 糖的3'位置處或者在2'-5'連接的寡核苷酸和5'端核苷酸的5'位置中做出其它類似的修 飾。
[0112]經修飾的糖殘基的例子包括2'-0_甲基核糖、2'-0_甲氧基乙基核糖、2'-氟-核糖 和4-硫代-核糖。
[0113]也可以使用二環(huán)糖，并且它通常包含具有將環(huán)約束成C3'內向構型的2'，4'橋(例 如亞甲基橋)的呋喃糖基環(huán)。含有二環(huán)糖的核苷酸經常稱為鎖核酸（"LNA"）殘基。
[0114] miR-96模擬物或前體可以獨立含有任何或所有這些類型的經修飾的糖殘基的一 種或多種。
[0115] 另外/或者，miR-96模擬物或前體可以包含一個或多個主鏈修飾，例如經修飾的核 苷間連接。
[0116] 因此，可以經由備選的連接模塊替換磷酸酯模塊連接一個或多個相鄰的核苷酸。
[0117] 可以特別期望經修飾的核苷間連接存在于miR-96模擬物的一個或兩個末端，即在 5 '端核苷酸和相鄰的核苷酸之間，和/或在3 '端核苷酸和相鄰的核苷酸之間。
[0118] 適合于用作核苷間連接的模塊包括硫代磷酸酯、嗎啉代和膦酰羧酸酯 (phosphonocarboxylate )模塊，以及硅氧烷、硫化物、亞砜、砜、乙?；⒓柞Ｒ阴；?(formacetyl )、硫代甲酰乙?；╰hioformacetyl )、亞甲基甲酰乙酰基（methylene formacety 1)、硫代甲酰乙?；?、烯基、氨基磺酸酯（sulphamate )、亞甲基亞胺基 (11161：11716116；[111；[110)、亞甲基餅基（11161：11716116117(^&2；[110)、橫酸酯（811]^11011&七6)和橫胺 (sulphonamide)模塊。
[0119] 在硫代磷酸酯模塊中，非橋接氧原子被硫原子替換。硫代磷酸酯基團可以促進血 清蛋白質結合，并且因此可以改善模擬物的體外分布和生物利用度。這在模擬物要對接受 者系統(tǒng)性施用時可以是期望的。
[0120] 另外/或者，miR-96模擬物或前體可以包含一個或多個經修飾的堿基作為天然存 在的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶的備選。此類經修飾的堿基包括5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷 基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和 2_硫代胞嘧啶（2-thiocytosine)、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶和嘧 啶堿基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶）、4_硫 尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代(包括5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶）、7_甲基鳥嘌呤和7-甲基腺 嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮 腺嘌呤和3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。
[0121] 遞送miR-96、模擬物和前體
[0122] 可以提供組合物，其中miR-96、模擬物和前體與合適的載體結合(例如與合適的載 體復合或由合適的載體包囊，或共價附接于合適的載體）。
[0123] 合適的載體包括藥學可接受的脂質和聚合物及其組合。例如，組合物可以具有脂 質體、脂囊泡、脂質復合物或聚合物復合物的形式。
[0124] 例如，脂囊泡和脂質體是具有含有寡核苷酸負載(cargo)的水性核心的脂質雙層 顆粒。
[0125] 脂質復合物（或"脂復合物（lipoplexes)"）和聚合物復合物（"聚復合物 (polyplexes)"）通常含有帶正電荷的脂質或聚合物，其與帶負電荷的寡核苷酸相互作用以 形成復合物。
[0126] 陽離子聚合物或脂質也可以與靶細胞表面上的帶負電荷的分子相互作用。通過脂 質和端基(head group)的適當選擇，可以剪裁(tailor)復合物以促進與祀細胞的質膜或與 選定的內膜(如內體膜或核膜)融合以促進遞送寡核苷酸負載到合適的亞細胞區(qū)室。通過脂 復合物和聚復合物進行的基因遞送例如由Tros de Ilarduya等在Eur.J.Pharm.Sci.40 (2〇10)159_1 7〇 中綜述。
[0127] 也可使用中性脂質乳劑與具有納米級的直徑的miRNA形成顆粒復合物。
[0128] 根據應用、負載和靶細胞，技術人員可以選擇合適的脂質?？梢允褂脝我恢|或 者，更通常為，脂質的組合。
[0129] 合適的脂質記載于例如W02011/088309及其中引用的參考文獻，且包括：
[0130]-中性脂質和磷脂，如鞘磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰 肌醇、磷脂酸（phosphatidic acid)、棕櫚酰油酰基磷脂酰膽堿（palmitoyloleoy 1 phosphatdylchol ine)、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰 基磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二亞油酰磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿(PC)、1，2_二油酰 基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(D0PC)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺(PE)、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇 胺、鞘磷脂（sphinogomyelin, SM)、心磷脂、磷脂酸(phosphosphatidic acid)、1，2-二硬脂 酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)、1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1-棕櫚酰- 2- 油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(P0PC)、1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DLPC)、1，2-二豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DMPC)、1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、1，2-二豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、 二棕櫚油?；鵡^((11。31111；[1:0106071-?￡)、二植燒酰-?￡((11。115^311071-?￡)、03?￡、二反油酰 基-?￡((116131(1071-?￡)、二亞油酰-3]\1、和二亞油酰-?￡;
[0131] -固醇，例如膽固醇，
[0132] -聚合物修飾的脂質，例如聚乙二醇(PEG)修飾的脂質，包括PEG修飾的磷脂酰乙醇 胺和磷脂酸、PEG-神經酰胺綴合物、PEG-修飾的二烷基胺和PEG-修飾的1，2_二?；趸? 3- 0安（PEG-modif ied 1，2-diacyloxypropan-3_amines)。特別合適的是PEG修飾的二酰甘油 和二烷基甘油，例如PEG-二豆蔻酰甘油（PEG-didimyristoyl glycerol)(PEG-DMG)PEG-二 苯乙烯基甘油(PEG-DSG)和PEG-氨甲?；?1，2-二豆蔻酰氧基丙胺(PEG-cDMA);
[0133] -陽離子脂質，如N，N-二油酰基-N，N-二甲基氯化銨（"D0DAC"）； N-(2，3-二油酰基 氧基）丙基-N，N-N-三乙基氯化銨（"D0TMA"）；N，N-二硬脂酰-N，N-二甲基溴化銨（"DDAB"）； N-(2，3-二油酰基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化鈉（"D0TAP"）； 1，2-二油?；趸?3-三甲 基氨基丙烷氯化物鹽（"D0TAP.C1"）；3P-(N-(N'，N'_二甲基氨基乙烷)-氨甲?；?膽固醇 ("DC-Cho 1"），N-(1 -(2，3-二油?；趸?丙基)-N-2-(精胺甲酰胺基）乙基)-N，N-二甲基三 氣乙酸銨（"D0SPA"）、雙十八烷基酰氨基甘氨酰駿基精胺（"DOGS"）、1，2-二油酰基-sn_3_磷 酸乙醇胺（"DOPE"）、1，2-二油?；?3-二甲基銨丙烷（"D0DAP"）、N，N-二甲基-2，3-二油?；?氧基）丙胺（"D0DMA"）、N-(1，2_二肉豆蔻基氧基丙-3-基）-N，N-二甲基-N-羥乙基溴化銨 ("DMRIE"）、1，2_二亞油基氧基-3-二甲基氨基丙烷（1，2-(111111〇16 71(^7-3-dimethylaminopropane) (DLinDMA) 1，2-二亞油?；鵢3_二甲基氨基丙烷（DLinDAP)、1-亞油 ?；?2-亞油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1，2-二亞油基氨基甲?；趸?3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、l，2-二亞油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、和2， 2-二亞油基-4-10二甲基氨基甲基-[1，3]_二氧戊烷(DLin-K-DMA)。陽離子脂質的商業(yè)制劑 包括Lipofectin?(其包含D0TMA和DOPE，可獲自Gibco/BRL)，和Lipofectamine?(其包含 DOSPA和DOPE，可獲自 Gibco/BRL)。
[0134] -陰離子脂質，包括磷脂酰甘油、心磷脂、二?；字＝z氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺和賴氨酰磷脂酰 甘油（lysylphosphatidylglycerol) 〇
[0135] W0/0071096描述了不同的配制劑，如D0TAP:膽固醇或膽固醇衍生物配制劑，其可 以有效用于寡核苷酸遞送。
[0136] 能夠對肺實現良好的miRNA遞送的商業(yè)上可得到的組合物是中性脂質乳劑 MaxSuppressor in vivo RNALancerII(BI00 Scientific,Austin,TX)，其由1，2_二油酰 基-sn-甘油-3-磷酸膽堿、藍稀油、Polysorbate 20和抗氧化劑組成。在與合成miRNA的復合 中，它形成納米直徑范圍中的納米顆粒。
[0137] 合適的聚合物包括組蛋白和魚精蛋白（和其它DNA結合蛋白）、聚（乙烯亞胺） (PEI)、陽離子樹枝狀聚合物，如聚酰胺胺(polyamidoamine) (PAMAM)樹枝狀聚合物、2-二甲 基(氨基乙基）甲基丙烯酸酯(PDMAEM)、聚(L-賴氨酸）（PLL)、基于碳水化合物的聚合物，如 殼聚糖（。11；[1:08&11)等。關于綜述，參見1'1'08(16 11&1(1115^等于￡111'.]\?11&1'111.3。;[.40(2010) 159-17?？梢允褂玫鞍踪|和肽，如端膠原(atellocollagen)。端膠原是一種由蛋白酶處理產 生的水溶形式的膠原，特別是經胃蛋白酶處理的來自小牛真皮的I型膠原。
[0138] 環(huán)糊精也可以用于遞送。
[0139] 另外/或者，miR-96模擬物或前體可以包含膜轉運模塊，以促進運送穿過靶細胞的 質膜。此模塊可以是合適的脂質或其它脂肪模塊，包括但不限于膽固醇和硬脂酰模塊。其它 膜轉運模塊包括細胞穿透肽（"CPP"，如來自HIV-1的TAT和MPG、穿透蛋白（penetratin)、聚 精氨酸）和融合肽(fusogenic peptide)(例如流感融合肽(diINF-7)或HIV-1包膜(HGP)的 內域衍生物）。可將膜運送模塊與載體分子綴合，所述載體分子與miR-96模擬物或前體自身 非共價結合?；蛘?，可以將膜運送模塊與miR-96模擬物或前體自身綴合?？梢詫⒛K與指導 鏈或過客鏈綴合，盡管過客鏈是優(yōu)選的，從而不損害指導鏈功能。在5'或3'端的綴合可以是 優(yōu)選的，盡管與內部殘基的綴合也是可能的。
[0140] 為了避免疑義，當與膜運送模塊連接時可以認為miR-96分子(即，非以其它方式具 有與天然分子的任何結構或序列差異)是miR-96模擬物或前體。
[0141] 靶細胞
[0142] 要提高miR-96活性的祀細胞通常是血管細胞，或與血管系統(tǒng)有關的細胞。
[0143] 與血管系統(tǒng)有關的細胞是位于血管內，或者在血管壁，包括內皮、平滑肌或外膜 (adventitia)中的細胞。
[0144] 通常，血管系統(tǒng)是肺血管系統(tǒng)，尤其是肺動脈。
[0145] 因此，血管平滑肌細胞和血管內皮細胞是靶細胞，尤其是肺血管平滑肌細胞和肺 血管內皮細胞，特別是肺動脈平滑肌細胞和肺動脈內皮細胞。
[0146] 盡管可以在高血壓條件下，或者在有助于高血壓形成的條件下調控，例如提高表 達，但靶細胞通常組成性表達5-HT1B受體。
[0147] 5HT1B受體在許多在免疫應答和炎癥中發(fā)揮作用的細胞，包括T-淋巴細胞和單個 核細胞(monoclear cells)，如單核細胞和巨噬細胞上表達(22-24)。牽涉T淋巴細胞和炎性 細胞的功能障礙性免疫系統(tǒng)促成PAH發(fā)病機制（25,26)。另外，5-羥色胺經由5-111'18受體刺 激成纖維細胞中的DNA合成，并且這與PAH模型中的成纖維細胞的增殖有關(27，28)。
[0148] 因此，表達5-HT1B受體的外膜成纖維細胞和免疫細胞也代表靶細胞，包括T淋巴細 胞、單核細胞、巨噬細胞和肥大細胞。
[0149] 靶向劑
[0150] 載體分子也可攜帶能夠結合靶細胞表面的靶向劑。例如，靶向劑可為特異性結合 配偶體，其能夠特異性結合在靶細胞，例如血管平滑肌細胞(例如肺動脈平滑肌細胞）、血管 內皮細胞(例如肺動脈內皮細胞）、外膜成纖維細胞或免疫細胞(例如T淋巴細胞、單核細胞、 巨噬細胞或肥大細胞）的表面上表達的分子。合適的結合配偶體包括針對細胞表面分子的 抗體等，或者對于這些細胞類型上的此類細胞表面分子的配體或受體。細胞表面分子可為 相關細胞類型的特異性標志物。或者，靶向劑可具體為5-HT1B受體自身的結合配偶體。
[0151] 術語"特異性結合對"用于描述包含彼此具有特定的特異性并且在正常條件中優(yōu) 先于結合其它分子而彼此結合的特異性結合成員（sbm)和其結合配偶體(bp)的分子對。特 異性結合對的例子是抗體及其關聯(lián)表位/抗原、配體(如激素等)和受體、親合素/鏈霉親合 素和生物素、凝集素和碳水化合物、和互補的核苷酸序列。
[0152] 公知的是，全抗體的片段可以執(zhí)行結合抗原的功能。功能性結合片段的例子是（i) 由VL、VH、CL和CH1域組成的Fab片段；（ii)由VH和CH1域組成的Fd片段；（iii)由單一抗體的 VL和VH域組成的Fv片段；（iv)由VH域組成的dAb片段(Ward，E ? S ?等，Nature 341，544-546 (1989)); (v)分離的CDR區(qū)；（vi)F(ab'）2片段，一種包含兩個連接的Fab片段的二價片段， (vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中通過肽接頭連接VH域和VL域，所述肽接頭容許兩個域結合以 形成抗原結合位點（Bird等，Science，242，423-426，1988;Huston等，？嫩3 1^4,85,5879-5883，1988);(￥丨^)雙特異性單鏈?￥二聚體(？(^/1^92/09965)和（11)"雙抗體"，通過基因 融合構建的多價或多特異性片段(W094/13804;P. Ho 11 iger等Proc. Nat 1. Acad. Sci . USA 90 6444-6448,1993)〇
[0153] 由于可以以多種方式修飾抗體，因此術語"抗體"應當解釋為涵蓋具有有需要的特 異性的結合域的任何特異性結合物質。因此，此術語涵蓋上文描述的抗體片段，及抗體的衍 生物、功能等同物和同源物，包括包含免疫球蛋白結合域的任何多肽，無論是天然的還是合 成的。因此，包括嵌合分子，該嵌合分子包含與另一種多肽融合的免疫球蛋白結合域或等同 物。嵌合抗體的克隆和表達描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023。
[0154] 抗體的備選是越來越可用的。可為了針對特定靶物的親和力而常規(guī)剪裁所謂的 "親和性蛋白"或"工程化蛋白質支架"。它們通常基于具有構象上穩(wěn)定或剛性核心的非免疫 球蛋白支架蛋白，其已經被修飾而對靶物具有親和力。修飾可包括在支架蛋白的表面替換 一個或多個表面殘基，和/或插入一個或多個殘基。例如，可將對靶物具有親和力的肽插入 支架蛋白的表面環(huán)中或可替換支架蛋白的部分或整個表面環(huán)。合適的支架及其工程化等同 物包括：
[0155] -BPTI、LAC-DI、ITI-D2(Kunitz 域支架）；
[0156] -ETI-IKAGRP(Knottin)；
[0157] -硫氧還蛋白（肽適體）；
[0158] -Fn3(AdNectin)；
[0159] -脂籠蛋白（BBP)(Anticalin);
[0160] -錨蛋白重復(DARPin);
[0161] -蛋白A的Z域(Affibody);
[0162] - 晶體蛋白/泛素(Affilin);
[0163] -LDLR-A-域（Avimer)。
[0164] 參見例如Gebauer，M和Skerra，A，Current Op ? Chem. Biol ? 2009，13 : 245-255及 Friedman,M和Stahl，S，Biotechnol .Appl .Biochem. (2009)53:1-29及其中引用的參考文 獻。
[0165] 編碼miR-96、模擬物和前體的核酸
[0166] 作為將miR-96寡核苷酸、模擬物和前體直接遞送到靶細胞的備選，有可能將編碼 miR-96寡核苷酸、其模擬物、或任一者的前體的核酸遞送到靶細胞，使得在靶細胞內表達 miR-96寡核苷酸、模擬物或前體。此類方法可視為"基因療法"。
[0167] 對于技術人員會容易顯而易見的是，可以僅使用核酸以編碼由RNA構成（即，由RNA 的4種天然存在的核苷酸組分構成，而沒有經修飾的堿基、糖或核苷間連接)的miR-96、其模 擬物和前體。
[0168] 核酸通常包含表達構建體，其包含與適當的調節(jié)序列可操作連接以促進表達的編 碼miR-96寡核苷酸、模擬物或前體的核酸序列。調節(jié)序列可以根據靶細胞選擇，但是通常會 包含合適的啟動子和任選的指導通過RNA聚合物II的轉錄的增強子，以及轉錄終止子(通常 包含多聚腺苷酸化信號）。
[0169] 啟動子可以是組織特異性啟動子，其與其它細胞或組織類型相比優(yōu)先或專門驅動 在靶細胞或組織中轉錄。
[0170] 例如，啟動子可以是優(yōu)先或專門驅動在血管細胞中或在如本說明書中的別處定義 的與血管系統(tǒng)有關的細胞中轉錄的啟動子。因此，啟動子可以優(yōu)先或專門在肺血管細胞中， 例如在血管平滑肌細胞中和/或在血管上皮細胞(包括肺動脈平滑肌細胞和上皮細胞）、外 膜成纖維細胞、或免疫細胞，如T淋巴細胞、肥大細胞、單核細胞和巨噬細胞中有活性。
[0171] 將核酸遞送到靶細胞
[0172]可以通過任何方便的路徑遞送編碼miR-96、模擬物和前體的核酸。
[0173]用于在體外將核酸遞送到細胞的方法包括磷酸鈣沉淀、DEAE-右旋糖酐、電穿孔、 顯微注射、加載有DNA的脂質體、超聲處理和使用經核酸涂覆的微粒(例如金或鎢微珠)的轟 擊。已經成功使這些技術中的多種適于在體內或離體使用。
[0174]因此，核酸可以以裸露形式施用，與合適的載體如聚合物或脂質（如本說明書中別 處描述)結合(例如與合適的載體復合或由合適的載體包囊)施用，或涂覆到顆粒表面上施 用。在此類實施方案中，核酸通常是DNA。也可以適當地使這些方法之任一種適于遞送 miR96、前體和模擬物自身。
[0175]核酸通常采取表達載體的形式。技術人員會能夠設計適合于治療用途(及本說明 書中描述的其它用途)的核酸表達載體。載體通常會含有表達構建體，所述表達構建體包含 與合適的調節(jié)序列(包括啟動子序列和轉錄終止序列)可操作連接，根據具體的應用任選地 與增強子序列、標志物基因和其它序列組合的編碼miR-96、模擬物或前體的核酸序列。載體 可意圖整合入宿主細胞染色體，或者可獨立于宿主染色體作為附加體(例如質粒)存在并復 制。
[0176] 或者，可以使用病毒載體遞送核酸。
[0177] 可以采用任何合適的病毒載體類型作為基因遞送媒介物。這些包括腺病毒、腺伴 隨病毒(AAV)、逆轉錄病毒(尤其是慢病毒)和皰疹病毒載體。腺病毒和慢病毒可以是特別優(yōu) 選的，因為它們具有實現在不活躍分裂的細胞中遞送的基因的表達的能力。
[0178] 病毒載體通常包含病毒結構蛋白和核酸有效負載，其包含對于在靶細胞或組織中 表達基因功能性的形式的期望的表達構建體。因此，基因通常與啟動子和其它合適的轉錄 調節(jié)信號可操作連接。
[0179]在腺病毒載體中，核酸有效負載通常是雙鏈DNA(dsDNA)分子。在逆轉錄病毒載體 中，它通常是單鏈RNA。
[0180] 核酸有效負載通常含有對于它被包裝到基因遞送媒介物中并且在靶細胞或組織 中適當加工需要的其它元件。
[0181] 對于腺病毒載體，這些可以包括腺病毒反向末端重復（ITR)序列和合適的包裝信 號。
[0182] 對于逆轉錄病毒載體，這些包括特征性末端序列(所謂的"R-U5"和"U3-R"序列)和 包裝信號。末端序列使得能夠在源自逆轉錄的原病毒的任一端產生直接重復序列（"長末端 重復"或"LTR"），其然后促進原病毒整合到宿主細胞基因組中并且指導隨后的表達。
[0183] 核酸有效負載也可以含有選擇標志物，即編碼容許經轉導的細胞的迅速檢測的產 物的基因。例子包括熒光蛋白（例如GFP)、產生可見反應產物的酶(例如半乳糖苷酶，螢光 素酶)的基因和抗生素抗性基因。
[0184] 病毒載體通常沒有復制能力。也就是說，核酸有效負載不含病毒復制必需的所有 病毒基因（和其它遺傳元件）。不過，病毒載體會含有對于將有效負載導入宿主細胞中及對 于適當加工有效負載，使得可以表達編碼的miR-96、模擬物或前體需要的所有結構蛋白和 酶活性。在這些不由核酸有效負載編碼的情況下，它們通常會由包裝細胞系供應。技術人員 會完全知道可以用于產生合適的病毒遞送媒介物的合適的細胞系。
[0185] 因此，對于腺病毒載體，核酸有效負載通常缺乏一個或多個來自El、E2、E3或E4區(qū) 的功能性腺病毒基因?？梢詫⑦@些基因缺失或以其它方式失活，例如通過插入包含異源基 因或選擇標志物的轉錄單元進行。
[0186] 在一些實施方案中，核酸不含功能性病毒基因。因此，對于腺病毒載體，存在的唯 一病毒組分可以是ITR和包裝信號。
[0187] 沒有功能性病毒基因的核酸可以是優(yōu)選的，因為它們降低由于病毒蛋白合成針對 經轉導的靶細胞或組織產生的宿主免疫應答的風險。
[0_ 治療的受試者
[0189] 本發(fā)明的方法可以用于治療或預防肺動脈高血壓(PAH)。預防性使用不必暗示完 全預防疾病，但是涵蓋延遲疾病的發(fā)作和/或降低癥狀的嚴重性，無論在發(fā)作時還是后來。 因此，受試者可以患有PAH，或可處于產生PAH風險。
[0190] 肺動脈高血壓牽涉血管到肺的血管收縮和肺內的血管的血管收縮。它以重度肺動 脈重塑和閉塞性肺血管損傷，導致右心室衰竭為特征。它是患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的患 者中的死亡率的重大原因。因此，本發(fā)明涵蓋在SLE患者中以及在不受SLE影響的患者中預 防或治療PAH的方法。
[0191] PAH包括特發(fā)性PAH和遺傳性PAH(又稱為家族性PAH)。因此，受試者可以具有使他 們有形成PAH的素因的突變。例如，這可以是BMPR2基因（用于骨形態(tài)發(fā)生蛋白途徑的II型受 體）中的突變。此類突變包括引入提前終止密碼子的R899X和N903S。其它素因性突變包括 KCNK3基因（鉀通道亞家族K，成員3)中的功能喪失突變。
[0192] 先前可以已經對受試者測試了 PAH的遺傳素因。本發(fā)明還提供了預防或治療PAH的 方法，其包括測定受試者的基因組中PAH的遺傳素因的存在或缺乏，并且若鑒定出此類素 因，則對受試者規(guī)定或施用：
[0193] (a)miR_96、其模擬物、或任一者的前體;或
[0194] (b)編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸。
[0195] 受試者可以患有或有風險形成特發(fā)性PAH。已知的風險因素包括女性性別，和厭食 藥物，如芬氟拉明（fenfluramine)/芬特明（phentermine)( "fen-phen"）的服用史。
[0196] 本發(fā)明可以特別適用于治療女性受試者，但是治療男性受試者也可以是有益的， 并且是本發(fā)明的范圍內涵蓋的。
[0197] 雖然用于治療的最常見的受試者會是人，但是本發(fā)明的方法可以延伸到任何其它 哺乳動物，包括其它靈長類（尤其是大型猿（great apes)，如大猩猩（gorilla)、黑猩猩 (chimpanzee)和猩猩(orang utan)，而且還有舊世界和新世界猴）以及嗤齒類(包括小鼠和 大鼠），和其它常見的實驗室、家養(yǎng)和農業(yè)動物(包括但不限于兔、犬、貓、馬、牛、綿羊、山羊 等)。
[0198] 藥物組合物和治療方法
[0199] 可以將本文中描述的分子配制為藥物組合物。除了上述物質之一外，這些組合物 可以包含藥學可接受賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或本領域技術人員公知的其它材料。此 類材料應當是無毒的，并且不應干擾活性成分的效力。載體或其它材料的精確性質可以取 決于施用路徑，例如口服、靜脈內、皮膚或皮下、鼻、肌肉內和腹膜內路徑。Esseku和Adeyeye (2011)及Van den Mooter G. (2006)中提供了合適的組合物和施用方法的例子。
[0200] 用于口服施用的藥物組合物可以為片劑、膠囊、粉末或液體形式。片劑可以包含固 體載體，如明膠或佐劑。液體藥物組合物一般包含液體載體，如水、石油、動物油或植物油、 礦物油或合成油。可以包括生理鹽水溶液、右旋糖或其它糖溶液或二醇（glycols)，如乙二 醇、丙二醇或聚乙二醇。
[0201] 對于靜脈內、皮膚或皮下注射，或痛苦部位處的注射，活性成分可以為胃腸外可接 受的水溶液形式，其是無熱原的，并且具有合適的PH、等張性和穩(wěn)定性。本領域相關技術人 員完全能夠使用例如等張媒介物，如氯化鈉注射液、林格(Ringer)氏注射液、乳酸林格氏注 射液制備合適的溶液。根據需要可以包括防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其它添加 劑。
[0202] 無論要對個體給予的活性劑(例如根據本發(fā)明的細胞、多肽、核酸分子、其它藥學 有用的藥劑）的性質如何，優(yōu)選以"預防有效量"或"治療有效量"（根據具體情況而定，盡管 可以認為預防是療法)施用，這足以顯示對個體的益處。施用的實際量，和施用的速率和時 間過程會取決于所治療(情況）的性質和嚴重性。治療的處方，例如對劑量的決定等在一般 從業(yè)者和其他醫(yī)學醫(yī)生的職責內，并且通常考慮要治療的病癥、個體患者的狀況、遞送的部 位、施用方法和從業(yè)者已知的其它因素。上文提及的技術和方案的例子可以參見 Remington's Pharmaceutical Sciences,^2〇Hix,2000,pub.Lippincott,ffil 1 iams& Wilkins。
[0203] 現在將參考附圖和實施例，通過實例而非限制更為詳細地描述本發(fā)明。
[0204] 附圖簡述
[0205] 圖1 :PASMC中的性別間的微小RNA的差異表達
[0206] 在雌性和雄性WT和BMPR2R899X+aPASMC中通過定量PCR對微小RNA表達的分析顯示性 別可以影響表達概貌。結果標準化至U6,并且表示為雌性WT值的倍數變化。數據表示為均值 土 5已]?。？〈0.05*，口〈0.01**(雌性對雄性）和口〈0.05+印〈0.01++，口〈0.001 +++(耵對810^2[?8995( +/-)。
[0207] 圖2:miR-96的表達在肺中最高
[0208] 在小鼠組織中通過定量-PCR對miR-96表達的全局分析顯示了水平在肺中顯著較 高。（RV，右心室）。結果標準化至U6,并且表示為肺數值的倍數變化。數據表示為均值土SEM。 卩〈0.01**和卩〈0.001***。
[0209] 圖3:5-HT1B受體作為miR-96靶物的確認
[0210] (A)和(B)25nM濃度的Pre-miR-96降低螢光素酶活性，但是對假(mock)對照載體沒 有影響。（C)與對照和混雜miR相比，Pre-miR-96轉染提高成熟的miR-96水平。結果標準化至 U6，并且表示為對照數值的倍數變化。數據表示為均值土 SEMK0.05*和P〈0.01**。
[0211]圖 4:雌性 BMPR2R899X+/-PASMC 中增加的靶 5-HT1B 表達
[0212 ] 來自WT和BMPR2R899X+/-小鼠的雌性和雄性PASMC中的5-HT1B (A)蛋白和(B )mRNA表達 的分析。與雌性WT相比，雌性BMPR2R899X+/TASMC展現出增加的5-HT1B蛋白和mRNA表達。小鼠 PASMC中的5-HT1B蛋白表達的代表性免疫印跡（C)。將結果分別標準化至a-微管蛋白和 GATOH，并且表示為倍數變化。數據表示為均值土 SEMK0.05*，p〈0.01**(雌性對雄性)和口〈 0.05+，p〈0.〇r+，p〈0.0〇r ++(FD^+/-)。
[0213] 圖5: BMP4刺激挽救缺陷雌性BMPR2R899X+/-PASMC中的miR-96表達
[0214] 來自雌性BMPR2R899X+/1、鼠的小鼠PASMC在用InM BMP4刺激時展現出miR-96水平的 試驗性升高。結果標準化至U6，并且表示為倍數變化。數據表示為均值± SEM。
[0215] 圖6:SMAD1的缺陷展現出與BMPR2R899X+/-類似的miR-96表達概貌。
[0216] 來自具有受損的SMAD1表達(+/-)的雌性小鼠的小鼠PASMC顯示了與雌性WT相比 miR-96表達的降低(A)。在整個肺組織中，相對于雌性WT在雌性SMAD1+/-小鼠中有miR-96水 平下降的趨勢，而雄性之間沒有變化(B)。結果標準化至U6,并且表示為倍數變化。數據表示 為均值土SEMKO.Ol**。
[0217] 圖7:人PAH對miR-96和5-HT1B表達的影響
[0218] 與非PAH對照相比，女性患者PASMC具有mir-96表達的降低(A)。與非PAH對照相比， 5-HT1B受體表達在女性患者PASMC中增加(B)，在具有BMPR2突變的HPAH患者內發(fā)現miR-96 的低表達和5-HT1B的高表達。結果標準化至RNU48,并且表示為女性對照值的倍數變化。數 據表示為均值。R899X，N903S: BMPR2突變。HPAH:遺傳性PAH。IPAH:特發(fā)性PAH。
[0219] 圖8:雌激素的耗盡(depletion)僅在雌性小鼠中提高miR-96表達并且減少靶物5-HT1B。
[0220] 與媒介物對照相比，用芳香酶抑制劑阿那曲挫(anas traz〇 1 e)處理的雌性小鼠具 有增加的miR-96表達(A)和減少的5-HT1B表達(B)，而雄性小鼠在miR-96(C)或5_HT1B(D)的 表達上沒有展現出變化。結果標準化至U6,并且表示為對照值的倍數變化。數據表示為均值 土 SEMKO ? 05*和 P〈0 ? 01**。
[0221] 圖9:雌激素在調節(jié)miR-96中的作用
[0222] 用InM雌激素(E2)刺激72小時的人PASMC顯示miR-96表達的降低(p = 0.0512)(A) 和5-HT1B受體表達增加的相應趨勢(B)。結果標準化至RNU48,并且表示為對照值的倍數變 化。數據表示為均值土SEM。
[0223] 圖10:mir-96模擬物預防小鼠中的缺氧誘導的肺性高血壓(PH)。一周一次靜脈注 射（i . v.)施用1.5mg/kg的mir-96模擬物達2周，在此期間將小鼠暴露于缺氧(hypoxia)。 miR-96模擬物防止右心室收縮壓的上升(A)、右心室肥大(B)和肺血管重塑(〇。*?〈0.05，** ?〈0.01，*樸〈0.001，*#樸〈0.0001 ;1-因素厶從^厶，接著是圖基(1\11?^)事后檢驗。
[0224] 圖ll:mir-96模擬物反轉具有BMPR2突變(BMPR2R899X+/-)的小鼠中的肺性高血壓 (PH)。一周一次靜脈注射施用1.5mg/kg的mir-96模擬物達兩周，此后對小鼠評估PH的形成。 miR-96模擬物防止右心室收縮壓的上升（A)、右心室肥大（B)和肺血管重塑（〇。撲〈 0 ? 05，*#P〈0 ? 001，##P〈0 ? 0001; 1-因素AN0VA，接著是圖基事后檢驗。
[0225] 發(fā)明詳述
[0226] 研究提示了微小RNA(miR)在肺動脈高血壓(PAH)的病理生物學中發(fā)揮至關重要的 作用。
[0227] 遺傳性PAH(hPAH)與骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2(BMPR2)的基因中的突變有關。發(fā)明人 已經研究了攜帶也在PAH患者中找到的突變的PAH的BMPR2小鼠模型，BMPR2 R899X+/1、鼠。
[0228] 在此模型中，性別作為肺動脈平滑肌細胞(PASMC)內的miR的基礎表達的關鍵根本 調節(jié)因素出現。與雌性野生型(WT)相比，MiR-96在來自雌性BMPR2 R899X+A小鼠的PASMC中下 調，而雄性轉基因物與其WT對照之間的表達不變。全局表達分析顯示了肺內的最高miR-96 表達。在mRNA和蛋白質水平兩者上，5-HT1B受體的靶基因與雌性BMPR2 R899X+/TASMC內的miR-96表達反相關。通過螢光素酶報告蛋白測定法確認5HT1B基因為miR-96的靶物。
[0229] 發(fā)明人還確認來自具有BMPR2突變的女性PAH患者的PASMC展現出低miR-96和高 5HT1B表達。
[0230] 這些結果提示了性激素如雌激素可在調節(jié)miR-96中發(fā)揮作用。與這一致，我們已 經顯示了抑制內源雌激素的體內合成僅在雌性小鼠內增加肺miR-96并且降低5-HT1B表達。 在人PASMC中用雌激素的直接刺激引起miR-96的減少和5-HT1B表達的增加。
[0231] 總之，miR-96的減少與增加的5HT1B表達有關。這提示了 miR-96模擬物/pre-miR-96策略可以是一種對于PAH的新的治療方法。支持此假設，臨床前研究確認mir-96模擬物有 效預防或反轉肺性高血壓的小鼠模型中的肺性高血壓。 實施例
[0232] 材料和方法
[0233] 細胞培養(yǎng)
[0234] 鼠肺動脈平滑肌細胞
[0235] 源自BMPR2+AR899X小鼠和相應的野生型對照小鼠的雌性和雄性肺動脈平滑肌細胞 (PASMC)由N. W. Morre 11教授(劍橋大學，劍橋，UK)提供。BMPR2v-R899X小鼠具有BMPR2基因的 雜合的敲入突變。小鼠類似于由West等（Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 295: L744-L755,2008)描述的那些小鼠。簡言之，在存在生長因子(上皮生長因子，堿性成纖維細 胞生長因子和胰島素）和抗生素（青霉素鏈霉素）的情況下在20 %FBS(胎牛血清）DMEM (Dulbecco氏改良的Eagle培養(yǎng)基）中培養(yǎng)PAMSC。利用傳代4-8的PASMC，并且細胞活力基于 獨特的平滑肌細胞形態(tài)學。
[0236] 人肺動脈平滑肌細胞
[0237] 男性人PASMC由N ? W ? Morre 11教授(劍橋大學，劍橋，UK)提供。簡言之，從來自三名 PAH患者(兩名具有HPAH和一名具有IPAH)的肺血管組織的小遠端肺動脈外植人PASMC。利用 源自非PAH受試者的PASMC作為對照。在存在抗生素抗真菌溶液(其含有青霉素、鏈霉素和兩 性霉素）的情況下在10 %FBS DMEM中培養(yǎng)人PASMC，并且在傳代4-8使用。經由平滑肌細胞形 態(tài)學確認PASMC表型。
[0238] RNA和蛋白質分析
[0239] miRNA 和 mRNA 的 Taqman 定量 PCR 分析
[0240] 使用miRNeasy試劑盒(Qiagen)根據制造商的說明提取總RNA，并且使用NanoDrop- 1000分光光度計量化RNA純度。通過Taqman定量-PCR評估m(xù)iR和mRNA的表達，如先前描述 [17 ]。為了獲得倍數變化，將miR表達數據標準化至U6 (對于小鼠）和RNU48 (對于人）。將mRNA 表達數據標準化至GAPDH。所有PASMC miRNA和mRNA表達數據是n = 6，一式三份。
[0241 ] 蛋白質的We stern印跡分析
[0242]使用RIPA裂解方法提取蛋白質。給RIPA緩沖液補充蛋白酶抑制劑PMSF、大豆胰蛋 白酶抑制劑和過芐脒(benzamidine)。簡言之，將補充的RIPA緩沖液添加到PASMC，然后在冰 上攪拌10分鐘。經由刮擦收集細胞裂解物。將蛋白質表達數據標準化至a-微管蛋白，并且使 用密度測定(dens i tometry)量化。所有蛋白質表達數據是n = 4，一式兩份。
[0243]微小RNA-96模擬物的體內有效性
[0244] 為了評估m(xù)iR-96是否參與肺性高血壓的病理學，使用MaxSuppressor?體內RNA- LANCEr II遞送方法一周一次經由尾靜脈靜脈內施用微小RNA-96模擬物（Applied Biosystems，撕 C10422,具有堿基序列UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU，與成熟小鼠和人 miR-96 相同）達2周。按照制造說明以每次注射1.5mg/kg的劑量，即每次注射每只小鼠約30ug在遞 送試劑中制備模擬物。使用經陰性微小RNA模擬物(Applied Biosystems)和PBS給藥的動物 作為對照。
[0245] 慢性缺氧
[0246] 將2個月齡的雌性野生型(WT)C57/B1 (Charles River)小鼠暴露于14天低壓缺氧 (10%02,55011^〇，如先前描述（18)。研究在含氧量正常條件(21%0 2，100011^〇中維持的 小鼠作為對照。
[0247] PH的體內評估
[0248] 進行右心室收縮壓（RVSP)、右心室肥大（RVH)和肺血管重塑的測量，如先前描述 (3,4,10)〇
[0249] 靶物確認
[0250] 螢光素酶報告物測定法
[0251] 利用psi-CHECK-2雙重螢光素酶報告物載體(Promega)進行報告物測定法。簡言 之，通過聚合酶鏈式反應(PCR)從基因組小鼠 DNA產生5-HT1B報告物基因的3'UTR(非翻譯 區(qū)）的片段，并且經由in-fusion克隆方法克隆入psi-CHECK-2載體的多克隆位點于Xhol和 Notl限制性位點處。然后，測序psi-CHECK-2 5-HT1B載體以確認5-HT1B的3'UTR區(qū)內沒有不 想要的突變。使用Lipofectamine 2000( Invitrogen)和0ptimem( Invitrogen)將lug psi-CHECK-2對照載體或psi-CHECK-2 5HT1B載體以及pre-miR-96(Ambion)或混雜miR(Ambion) 共轉染到HeLa細胞中，總共6小時，之后用10%FBS DMEM替換。將HeLa細胞保持48小時，并且 使用Dual-Glo螢光素酶測定系統(tǒng)(Promega)測量螢光素酶活性，并且通過發(fā)光計檢測。將花 蟲(renilla)螢光素酶活性標準化至內部螢火蟲螢光素酶活性，并且數據表示為內部對照 的百分比。
[0252] 數據的分析
[0253] 數值表示為均值土均值的標準差。在適當的情況下，進行t-檢驗或2-因素AN0VA及 接著是Bonferroni事后檢驗以評估所有組間的統(tǒng)計學顯著性。p〈0.05的概率水平定義為統(tǒng) 計學顯著的。
[0254] 莖里
[0255] 圖1證明了許多miR受性別差別影響，并且miR-96相對于野生型對照在雌性 BMPR2 R899X+/-小鼠而非雄性中嚴重下調；相對于雄性BMPR2R899X+/-小鼠，miR-96水平在雌性 BMPR2 R899X+/1、鼠中更低。
[0256] 與其它組織水平相比，miR-96的肺表達極高，這會促進肺的選擇性靶向（圖2)。我 們確認了 5HT1B受體是使用螢光素酶報告物測定法的miR96的靶物（圖3)。
[0257] 降低的miR96表達與雌性BMPR2R899X+A小鼠中的5HT1B受體的靶基因的升高有關（圖 4)。通過BMP4刺激挽救降低的miR96表達(圖5)。在來自Smadl +/-小鼠的PASMC中觀察到相同 的表型（圖6)。
[0258] 已經在人PASMC中確認了結果（圖7)。特別感興趣的是在具有R899X突變的女性患 者中，5HT1B水平高，并且miR96表達極低（圖7)。
[0259] 我們還檢查了用芳香酶抑制劑阿那曲唑的雌激素耗盡對miR96和5HT1B受體兩者 的表達的影響。先前，我們已經顯示了阿那曲唑反轉雌性小鼠和大鼠中、但非雄性中的PAH (未發(fā)表）。這里，我們顯示了用阿那曲唑在體內耗盡雌激素在雌性小鼠肺而非雄性中提高 miR96表達，并且降低5HT1B表達(圖8)。
[0260] 與這一致，miR-96基因具有雌激素響應區(qū)，并且雌激素自身降低miR-96的表達并 且提高5HT1B受體的表達(圖9)。
[0261] 圖10和11確認miR-96模擬物可以在體內在小鼠模型中既防止又反轉的實驗性PH。 [0262] 討論
[0263] 我們的結果提示了增加的雌激素和BMPR2單倍劑量不足(haploinsufficiency)與 降低的miR-96表達有關。
[0264] miR-96通常阻抑5HT1B的基因的翻譯，并且因此miR-96的減少誘導5HT1B表達的增 加。這促進通過5-羥色胺的PASMC增殖和肺血管重塑，并且有助于PAH的形成。
[0265] 雖然已結合上文描述的例示性實施方案描述了本發(fā)明，但是當給予本公開時，許 多等同修飾和變型對于本領域技術人員會是顯而易見的。因而，認為列出的本發(fā)明的例示 性實施方案是例示性的而非限制性的?？梢詫γ枋龅膶嵤┓桨缸龀龆喾N改變而不背離本發(fā) 明的精神和范圍。本申請中引用的所有文件通過提述明確并入。
[0266] 參考文獻
[0267] (l)Shapiro S,Traiger GL,Turner M,Mcgoon MD,ffason P,Barst RJ.Sex differences in the diagnosis,treatment,and outcome of patients with pulmonary arterial hypertension enrolled in the registry to evaluate early and longterm pulmonary arterial hypertension disease management.Chest 2012February； 141(2):363-73.
[0268] (2)Lane KB，Machado RD，Pauciulo MW等Heterozygous germline mutations in BMPR2，encoding a TGF-beta receptor,cause familial primary pulmonary hypertension.Nature Genetics 2000September；26(1):81-4.
[0269] (3)Dempsie Y，Morecroft I，Welsh DJ等Converging evidence in support of the serotonin hypothesis of dexfenfluramine-induced pulmonary hypertension with novel transgenic mice.Circulation 2008June 3;117(22):2928-37?
[0270] (4)Morecroft I，Dempsie Y，Bader M等Effect of Tryptophan Hydroxylase IDeficiency on the Development of Hypoxia-Induced Pulmonary Hypertension.Hypertension 2007January 1;49(1):232-6.
[0271] (5)Morecroft I，White K，Caruso P等Gene Therapy by Targeted Adenovirus-mediated Knockdown of Pulmonary Endothelial TphlAttenuates Hypoxia-induced Pulmonary Hypertension.Mol Ther 2012August；20(8):1516-28.
[0272] (6)Lawrie A，Spiekerkoetter E，Martinez EC等Interdependent serotonin transporter and receptor pathways regulate S100A4/Mtsl，a gene associated with pulmonary vascular disease.Circ Res 2005August 5；97(3):227-35.
[0273] (7)MacIntyre PD，Bhargava B，Hogg KJ，Gemmill JD，Hillis WS.Effect of Subcutaneous Sumatriptan，A Selective 5HtlAgonist，on the Systemic,Pulmonary, and Coronary Circulation.Circulation 1993February;87(2):401-5.
[0274] (8)MacLean MR,Clayton RA,Templeton AGB,Morecroft I.Evidence for 5-HTl-like receptor-mediated vasoconstriction in human pulmonary artery.British Journal of Pharmacology 1996September；119(2):277-82.
[0275] (9)MacLean MR，Morecroft I.Increased contractile response to 5-hydroxytryptamine(1)-receptor stimulation in pulmonary arteries from chronic hypoxic rats:role of pharmacological synergy.British Journal of Pharmacology 20010ctober；134(3):614-20.
[0276] (lO)MacLean MR，Deuchar GA，Hicks MN等Overexpression of the 5_ hydroxytryptamine transporter gene-Effect on pulmonary hemodynamics and hypoxia-induced pulmonary hypertension.Circulation 2004May 4;109(17):2150-5?
[0277] (11)Morecrof t I，Hee 1 ey RP，Pren t i ce HM，Kirk A，MacLean MR ? 5_ hydroxytryptamine receptors mediating contraction in human small muscular pulmonary arteries:importance of the 5-HT1B receptor.British Journal of Pharmacology 19990ctober；128(3):730-4.
[0278] (12)Morecroft I，Loughlin L，Nilsen M等Functional interactions between 5-hydroxytryptamine receptors and the serotonin transporter in pulmonary arteries.J Pharmacol Exp Ther 2005May；313(2):539-48.
[0279] (13)Morecroft I，Pang L，Baranowska M等In vivo effects of a combined 5_ HT( 1 B ) receptor/SERT antagonist in experimental pulmonary hypertension.Cardiovasc Res 2010February 1；85(3):593-603.
[0280] (14)Dempsie Y，Nilsen M，White K等Development of pulmonary arterial hypertension in mice over-expressing S10 0A4/Mt s1i s specific to females.Respiratory Research 2011；12(1):159.
[0281] (15)Dempsie Y，MacRitchie NA，White K等Dexfenfluramine and the oestrogen-metabolizing enzyme CYPIBlin the development of pulmonary arterial hypertension.Cardiovasc Res 2013July 1；99(1):24~34.
[0282] (16)ffhite K,Dempsie Y,Nilsen M,ffright AF,Loughlin L,MacLean MR.The serotonin transporter，gender，and 17beta oestradiol in the development of pulmonary arterial hypertension.Cardiovasc Res 201IMay；90(2):373-82.
[0283] (17)ffhite K，Loughlin L，Maqbool Z等Serotonin transporter，sex，and hypoxia:microarray analysis in the pulmonary arteries of mice identifies genes with relevance to human PAH.Physiological Genomics 2011April；43(8):417-37.
[0284] (18)Caruso P，MacLean MR，Khanin R等Dynamic Changes in Lung MicroRNA Profiles During the Development of Pulmonary Hypertension due to Chronic Hypoxia and Monocrotaline.Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology 2010April；30(4):716-U182.
[0285] (19)Caruso P，Dempsie Y，Stevens HC等A Role for miR_145in Pulmonary Arterial Hypertension/Novelty and Significance.Circ Res 2012July 20； 111(3): 290-300.
[0286] (20)Grant J,ffhite K,MacLean M,Baker A.MicroRNAs in pulmonary arterial remodeling.Cell Mol Life Sci 2013；1-16.
[0287] (21)Bouchie A.First microRNA mimic enters clinic.Nat Biotechnol 2013July 9；31(7):577.
[0288] (22)Stefulj J，Jernej B，Cicin_Sain L，Rinner I，Schauenstein K.mRNA expression of serotonin receptors in cells of the immune tissues of the rat.Brain Behav Immun 2000September；14(3):219-24.
[0289] (23)Yang GB,Qiu CL,Zhao H,Liu Q,Shao Y.Expression of mRNA for multiple serotonin(5-HT)receptor types/subtypes by the peripheral blood mononuclear cells of rhesus macaques.J Neuroimmunol 2006September；178(1-2): 24-9.
[0290] (24)Yin J,Albert RH,Tretiakova AP,Jameson BA.5-HT1B receptors play a prominent role in the proliferation of T-lymphocytes.Journal of Neuroimmunology 2006December；181(1-2):68-81.
[0291] (25)Austin ED，Rock MT，Mosse CA等T lymphocyte subset abnormalities in the blood and lung in pulmonary arterial hypertension.Respir Med 2010March； 104(3):454-62.
[0292] (26)Savai R，Pullamsetti SS，Kolbe J等Immune and inflammatory cell involvement in the pathology of idiopathic pulmonary arterial hypertension.Am J Respir Crit Care Med 2012November 1；186(9):897-908.
[0293] (27)Mair KM，MacLean MR，Morecroft I，Dempsie Y，Palmer TM?Nove1 interactions between the 5-HT transporter,5-HT(IB)receptors and Rho kinase in vivo and in pulmonary fibroblasts.British Journal of Pharmacology 20080ctober;155(4):606_16.
[0294] (28)Seuwen K,Magnaldo I,Pouyssegur J.Serotonin stimulates DNA synthesis in fibroblasts acting through 5-HT1B receptors coupled to a Gi_ protein.Nature 1988September 15；335(6187):254~6.
【主權項】
1. 一種用于預防或治療肺性高血壓的方法，其包括對靶細胞遞送，或對受試者施用： (a) miR-96、其模擬物、或任一者的前體;或 (b) 編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸。2. -種用于抑制血管細胞增殖和/或血管重塑的方法，其包括對靶細胞遞送，或對受試 者施用： (a) miR-96、其模擬物、或任一者的前體;或 (b) 編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸。3. 根據權利要求1的方法，其中所述肺性高血壓是肺動脈高血壓。4. 根據權利要求1至3中任一項的方法，其中所述靶細胞表達5-HT1B受體。5. 根據權利要求1至4中任一項的方法，其中所述靶細胞是血管細胞。6. 根據權利要求5的方法，其中所述血管細胞是血管平滑肌細胞(VSMC)或血管內皮細 胞。7. 根據權利要求6的方法，其中所述血管細胞是肺動脈平滑肌細胞(PASMC)或肺動脈內 皮細胞。8. 根據權利要求1至4中任一項的方法，其中所述靶細胞是與血管系統(tǒng)有關的細胞。9. 根據權利要求8的方法，其中所述靶細胞是外膜成纖維細胞或免疫細胞。10. 根據權利要求9的方法，其中所述免疫細胞是T淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞或肥 大細胞。11. 根據前述權利要求中任一項的方法，其中miR-96的所述前體是pre-mir96。12. 根據權利要求11的方法，其中所述pre-mir96具有序列： UGGCCGAUUUUGGCACUAGCACAUUUUUGCUUGU⑶CUCUCCGCUCUGAGCAAUCAUGUGCAGUGCCAAUAUG GGAAA(hsa-pre-mir-96)或 CCAGUACCAUCUGCUUGGCCGAUUUUGGCACUAGCACAUUUUUGCUUGU⑶CUCUCCGCUGUGAGCAAUCAUG UGUAGUGCCAAUAUGGGAAAAGCGGGCUGCUGC(mmu-pre-mir-96), 其中成熟的miR-96序列是加下劃線的。13. 根據權利要求1至10中任一項的方法，其中所述mi R-96的前體是pr i -mi R96。14. 根據權利要求1至10中任一項的方法，其中所述miR-96模擬物包含指導鏈，所述指 導鏈具有序列： UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU (其中種子序列是加下劃線的） 或者所述指導鏈在所述種子序列外部的一個或多個位置處與所述序列不同。15. 根據權利要求1至10或14中任一項的方法，其中所述miR-96模擬物包含一個或多個 經修飾的糖殘基。16. 根據權利要求1至10、14或15中任一項的方法，其中所述miR-96模擬物包含一個或 多個經修飾的核苷間連接。17. 根據權利要求1至10或14至16中任一項的方法，其中所述miR-96模擬物包含一個或 多個經修飾的堿基。18. 根據權利要求1至10或14至17中任一項的方法，其中所述miR-96、其模擬物或前體 與載體相結合。19. 根據權利要求18的方法，其中所述載體是藥學可接受脂質或聚合物、或其組合。20. 根據權利要求1至10中任一項的方法，其中以裸的DNA或與載體結合遞送所述核酸。21. 根據權利要求1至10中任一項的方法，其中經由病毒載體遞送所述核酸。22. 根據權利要求21的方法，其中所述病毒載體是腺病毒或逆轉錄病毒載體。23. 根據權利要求22的方法，其中所述逆轉錄病毒載體是慢病毒載體。 24. miR-96、其模擬物、或任一者的前體，其用于抑制血管細胞增殖和/或血管重塑的方 法。 25. miR-96、其模擬物、或任一者的前體，其用于預防或治療肺性高血壓的方法。26. 根據權利要求25使用的miR-96、其模擬物、或任一者的前體，其中所述肺性高血壓 是肺動脈高血壓。27. 根據權利要求24至26中任一項使用的miR-96的前體，其中所述miR-96的前體是 pre_mir96〇28. 根據權利要求27使用的miR-96的前體，其中所述pre-mir96具有序列： UGGCCGAUUUUGGCACUAGCACAUUUUUGCUUGU⑶CUCUCCGCUCUGAGCAAUCAUGUGCAGUGCCAAUAUG GGAAA(hsa-pre-mir-96)或 CCAGUACCAUCUGCUUGGCCGAUUUUGGCACUAGCACAUUUUUGCUUGU⑶CUCUCCGCUGUGAGCAAUCAUG UGUAGUGCCAAUAUGGGAAAAGCGGGCUGCUGC(mmu-pre-mir-96), 其中成熟的miR-96序列是加下劃線的。29. 根據權利要求24至26中任一項使用的miR-96的前體，其中所述miR-96的前體是 pri-miR96〇30. 根據權利要求24至26中任一項使用的miR-96模擬物或其前體，其中所述miR-96模 擬物包含指導鏈，所述指導鏈具有序列： UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU 其中種子序列是加下劃線的， 或者所述指導鏈在所述種子序列外部的一個或多個位置處與所述序列不同。31. 根據權利要求24至26或權利要求30中任一項使用的miR-96模擬物或其前體，其中 所述miR-96模擬物包含一個或多個經修飾的糖殘基。32. 根據權利要求24至26、權利要求30或權利要求31中任一項使用的miR-96模擬物或 其前體，其中所述miR-96模擬物包含一個或多個經修飾的核苷間連接。33. 根據權利要求24至26或30至32中任一項使用的miR-96模擬物或其前體，其中所述 miR-96模擬物包含一個或多個經修飾的堿基。34. 根據權利要求24至33中任一項使用的miR-96、其模擬物、或任一者的前體，其中所 述miR-96、其模擬物或前體與載體相結合。35. 根據權利要求34使用的miR-96、其模擬物、或任一者的前體，其中所述載體是藥學 可接受脂質或聚合物、或其組合。36. 編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸，其用于抑制血管細胞增殖和/或血 管重塑的方法。37. 編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸，其用于預防或治療肺性高血壓的 方法。38. 根據權利要求37使用的核酸，其中所述肺性高血壓是肺動脈高血壓。39. 根據權利要求36至38中任一項使用的核酸，其中將所述核酸經配制用于以裸的DNA 或與載體結合遞送。40. 根據權利要求36至39中任一項使用的核酸，其中以病毒載體的一部分提供所述核 酸。41. 根據權利要求40使用的核酸，其中所述病毒載體是腺病毒或逆轉錄病毒載體。42. 根據權利要求41使用的核酸，其中所述逆轉錄病毒載體是慢病毒載體。
【文檔編號】A61K31/713GK106029887SQ201480073780
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2014年12月1日
【發(fā)明人】M·R·麥克萊恩, E·華萊士, A·H·貝克
【申請人】格拉斯哥大學理事會