專利名稱：依帕司他在制備防治高血壓腎病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及依帕司他的新用途，具體提供了其在制備治療高血壓腎病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腎臟是血壓調(diào)節(jié)的重要器官，也是高血壓最常累及的靶器官。血壓上升是高血壓腎損害最重要的獨立危險因素。高血壓腎損傷最終可發(fā)展為終末期腎病(End stage renaldiease, ESRD )。據(jù)報道，2009年在美國ESRD患者中約有28%為高血壓腎損害所致，因此而支出的醫(yī)療費用高達56億美元。在我國13%的ESRD患者由高血壓發(fā)展而來。高血壓腎病已嚴重威脅人類的健康。因此，深入研究高血壓引起腎損害的機制及探討有效防治措施具有重要意義。腎小球硬化是高血壓腎功能衰竭的主要病理基礎(chǔ)，其中心環(huán)節(jié)為腎小球系膜細胞異常增殖和細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM )沉積。腎小球系膜細胞在腎小球固有細胞中功能最為活躍，是腎小球ECM產(chǎn)生與降解的主要場所。正常腎小球內(nèi)，系膜細胞增殖緩慢，ECM產(chǎn)生與降解處于動態(tài)平衡狀態(tài)。但在高血壓等病理因素刺激下，系膜細胞異常增殖，分泌大量細胞因子和生長因子，ECM成分合成增加、降解減少，發(fā)生ECM沉積，最終導致腎小球硬化。在高血壓腎小球硬化中，血管緊張素II ( Angiotensin II，Ang II )發(fā)揮著重要作用。高血壓病理條件下，Ang II通過多種途徑參與高血壓腎損害過程:
① Ang II 誘導表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR )表達，通過 PI3K/Akt、MAPK 通路使激活蛋白 I ( Activator protein I, AP-1 )活化，促進轉(zhuǎn)化生長因子 β1( ·Transforming growth factor - β I, TGF - β I)轉(zhuǎn)錄及表達[14-22]。TGF - β I通過下游Smads通路和結(jié)締組織生長因子(Connective tissuegrowth factor, CTGF )刺激系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)成分表達。②Ang II活化NAD ( P ) H氧化酶、抑制誘導型一氧化氮合酶(Inducible nitricoxide synthase, iNOS)和氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD),生成過量活性氧族(Reactive oxygen species, ROS ),形成氧化應(yīng)激,改變酪氨酸激酶活性及磷酸化,激活細胞內(nèi)信號通路，活化核轉(zhuǎn)錄因子κΒ ( Nuclear factor κ B, NF - κΒ )和AP - 1，促進相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，致使系膜細胞增殖及細胞外基質(zhì)成分合成過量。③Ang II 促使血小板源性生長因子(Plateletderived growth factor, F1DGF)、單核細胞趨化蛋白_1 (Monocyte chemotactic protein I, MCP -1 )和腫瘤壞死因子_a (Tumor necrosis factor - α , TNF - α )等炎性因子產(chǎn)生，激活NF - κ B,引起炎癥促進膠原產(chǎn)生形成纖維化。依帕司他為醛糖還原酶抑制劑，主要用于預防、改善和治療糖尿病并發(fā)的末梢神經(jīng)障礙(麻木感、疼痛)等，也有研究報道其可用于糖尿病腎病的治療。但目前國內(nèi)外均未發(fā)現(xiàn)有在高血壓腎病方面的研究報道。糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)主要微血管病變之一，常見于病史超過10年的患者，是糖尿病致死的主要原因之一。糖尿病腎病與自由基介導的氧化損傷有關(guān)。糖尿病患者機體中氧化自由基產(chǎn)生增加或抗氧化劑和抗氧化酶活力下降，可導致自由基的生成與機體抗氧化能力間失衡，腎組織發(fā)生氧化應(yīng)激引起腎損傷，導致DN。高血壓腎病是一種完全不同于糖尿病腎病，機理上完全不同，高血壓腎病是原發(fā)性高血壓引起的良性小動脈腎硬化(又稱高血壓腎小動脈硬化)和惡性小動脈腎硬化，并伴有相應(yīng)臨床表現(xiàn)的疾病。目前臨床治療上需要采取綜合治療措施，給患者健康帶來了較大的影響，同時給患者也帶來了較大的心里負擔和經(jīng)濟負擔。因此，開發(fā)有效的防治高血壓腎病的藥物具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種依帕司他的新用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了依帕司他在制備防治高血壓腎病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了依帕司他的組合物在制備防治高血壓腎病藥物中的應(yīng)用。所述依帕司他的組合物是以依帕司他為原料，與其它任何能增強依帕司他療效或利于依帕司他發(fā)揮作用的物質(zhì)制備而成的物質(zhì)。本發(fā)明還提供了依帕司他經(jīng)過加工制備的適合服用的任何單位劑量形式的藥物制劑，這些藥物制劑選自以下劑型:片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑，需要時可以制成緩釋制劑、腸溶制劑。下面對本發(fā)明做進一步解釋和說明:
依帕司他在制備成藥物制劑時可加入藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體選自:抗氧劑、鰲合劑、表面活性劑、填充劑、崩解劑、潤濕劑、分散劑、潤滑劑溶劑、緩釋材料、腸溶材料、PH調(diào)節(jié)劑、矯味劑、色素等，常用的載體如:甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、氯化鈉、硅衍生物、纖維素及纖維素衍生物、亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、聚乙二醇、環(huán)糊精、β -環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。醒糖還原酶(Aldose reductase, AR )屬于醒酮還原酶超家族中重要的一員，是糖代謝途徑中多元醇通路的限速酶。我們研究發(fā)現(xiàn)，在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)腎臟組織中醛糖還原酶(AR)表達升高，而AR抑制劑依帕司他能夠降低SHR的N-乙酰-β -D-氨基葡萄糖苷酶(N N-acetyl-β -D-glucosaminidase, NAG)活性，白蛋白與肌酐比值(Albumin/Urine creatinine, ALB/UCR)，改善高血壓所致的基底膜損傷及抑制腎皮質(zhì)微血管外ColIII的表達。這為將依帕司他開發(fā)成為一種具有防治高血壓腎病的新型降壓藥物提供了實驗依據(jù)。
具體實施例方式實施例1
1.1目的:研究依帕司他對血管緊張素II ( Ang II )誘導大鼠腎小球系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)合成的 影響，闡明依帕司他保護高血壓腎損害的具體機制。1.2方法:采用大鼠腎小球系膜(HBZY-1 )細胞，實驗分為3組:對照組、Ang II誘導組(10-8 mol/L Ang II)、依帕司他組(10-8 mol/L Ang II + 20 ymol/L依帕司他)。各組細胞在含1%新生牛血清培養(yǎng)基中孵育48 h，采用MTT —步法檢測A490值來評估細胞數(shù)；采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT - qPCR )法和蛋白質(zhì)印跡(Western blot )法檢測細胞外基質(zhì)I型膠原蛋白(Col I )、III型膠原蛋白(Col III )、IV膠原蛋白(Col IV )、纖連蛋白(FN )以及醛糖還原酶(AR )的mRNA和蛋白表達水平。1.3 結(jié)果:
①與對照組相比，10-8 mol/L Ang II組細胞數(shù)增加，差異具有統(tǒng)計學意義(1.76 土
0.06 vs 1.67 土 0.05，P〈 0.05 )。與 Ang II 組比較，依帕司他組(1.65 土 0.04 vs
1.76 土 0.06，P < 0.01 )細胞數(shù)減少，差異具有統(tǒng)計學意義。②與對照組相比，10-8 mol/L Ang II能夠顯著增加Col IV ( 2.33 土 0.13vs 1.00 土 0.31，P < 0.01)、FN ( 1.17 土 0.04 vs 1.00 土 0.08，P < 0.01 ), ColI (1.36 土 0.05 vs 1.00 土 0.05，P < 0.01 )、Col III ( 1.31 土 0.03 vs 1.00 土
0.04, P〈 0.01 )和 AR ( 1.35 土 0.04 vs 1.00 土 0.11，P < 0.01 ) mRNA 水平。與Ang II 組相比，依帕司他組 FN ( 0.76 土 0.03 vs 1.17 土 0.04，P〈 0.01),Col I ( 1.25 土 0.05 vs 1.36 土 0.05，P < 0.05 )和Col III ( 0.68 土 0.02 vs
1.31 土 0.03，P < 0.01 ) mRNA水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義；AR ( 3.78 土 0.13vs 1.35 土 0.04，P < 0.01 )，差異具有統(tǒng)計學意義；Col IV ( 2.54 土 0.14 vs 2.33土 0.13，P = 0.275 ) mRNA水平上升，但差異不具有統(tǒng)計學意義。

③與對照組相比，10-8 mol/L Ang II能夠顯著增加Col IV ( 2.18 ± 0.26 vs1.00 土 0.02，P〈 0.01 )、FN ( 2.43 土 0.03 vs 1.00 土 0.07，P〈 0.01 )、Col I(1.29 土 0.05 vs 1.00 土 0.04，P < 0.01 )、Col III ( 5.08 土 0.21 vs 1.00 土0.43, P〈 0.01 )和 AR ( 2.02 土 0.08 vs 1.00 土 0.08，P < 0.01 )蛋白水平。與Ang II 組相比，依帕司他組 FN ( 2.07 土 0.06 vs 2.43 土 0.03，P〈 0.01),Col I ( 1.07 土 0.02 vs 1.29 土 0.05，P < 0.01 )和Col III ( 1.12 土 0.46 vs5.08 土 0.21，P < 0.01 )蛋白水平下降，差異具有統(tǒng)計學意義；Col IV ( 2.71 土 0.42vs 2.18 土 0.26，P〈 0.01 )和 AR ( 3.13 土 0.24 vs 2.02 土 0.08，P〈 0.01 )蛋白水平上升，差異具有統(tǒng)計學意義。1.4結(jié)論:Ang II促進HBZY-1中Col III和AR表達，依帕司他能夠抑制Ang II誘導的HBZY-1增殖和細胞外基質(zhì)成分(FN、Col I和Col III )表達。實施例2
2.1目的:研究依帕司他對血管緊張素II誘導的大鼠腎小球系膜細胞增殖的影響及其機制。2.2方法:采用大鼠腎小球系膜細胞(HBZY-1)作為實驗材料，實驗共分為3組，每組重復5次(η = 5):空白對照組、Ang II誘導模型組(10_8 mol/L Ang II)、醒糖還原酶抑制劑依帕司他組(10-8 mol/L Ang II + 20 μ mol/L依帕司他)。各組細胞在含10 %胎牛血清培養(yǎng)基中孵育24、36、48 h，采用MTT—步法檢測0D490值來評估細胞數(shù)目；采用流式細胞儀檢測各組細胞周期和細胞凋亡情況；采用用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-qPCR)法和蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑_P21、P27、細胞凋亡相關(guān)基因-Bax、Bcl-2和醛糖還原酶(Aldose Reductase, AR)的mRNA和蛋白表達水平；采用紫外測定法檢測細胞內(nèi)AR的活性。2.3 結(jié)果:
(I)與對照組相比，10-8 mol/L Ang II模型組在含10 %胎牛血清培養(yǎng)基中孵育48 h后，細胞數(shù)目顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(1.91 土 0.06 vs 1.49 土 0.08，P < 0.01，48 h);與 Ang II 模型組比較，依帕司他組(1.60 土 0.04 vs 1.91 土 0.06 ;P < 0.01,48h)細胞數(shù)目減少，差異具有統(tǒng)計學意義。(2)與對照組相比，10-8 mol/L Ang II模型組Gl期細胞比例明顯減少(69.17土 0.25 vs 73.90 土 0.58，P < 0.05)，S 期細胞明顯增多(22.41 土 1.06 vs 12.64 土0.23，P < 0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義；與Ang II模型組相比，依帕司他組可抑制細胞進入 S 期，S 期細胞比例明顯下降(11.09 土 0.38,13.95 土 0.57，10.08 土 0.20，7.05 土0.69 vs 22.41 土 1.06 ;P < 0.05，P < 0.05，P < 0.05，P < 0.01)。(3)與對照組相比，10-8 mol/L Ang II模型組P21、P27 mRNA水平顯著降低(P21:0.0020 土 0.000098 vs 0.0063 土 0.00017，P < 0.01 ；P27:0.0013 土 0.00011 vs0.0041 土 0.00007，P < 0.01 )，差異具有統(tǒng)計學意義；與Ang II模型組相比，依帕司他組P21、P27 mRNA 水平均顯著高于 Ang II 模型組(P21:0.0087 土 0.00047 vs 0.0020 土
0.000098,P < 0.01 ；P27:0.0060 土 0.00020 vs 0.0013 土 0.00011，Ρ < 0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義。(4)與對照組相比，10-8 mol/L Ang II模型組P21、P27蛋白水平顯著降低(P21:0.51 土 0.03 vs 1.00 土 0.00，P < 0.05 ；P27:0.72 土 0.02 vs 1.00 土 0.00，P <
0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義；與Ang II模型組相比，依帕司他組和不同濃度杜仲木脂素組Ρ21、Ρ27 蛋白水平均顯著高于 Ang II 模型組(Ρ21:3.21 土 0.12 vs 0.51 土 0.03，P <0.01 ；P27:2.36 土 0.04 vs 0.`72 土 0.02，P < 0.01 )，差異具有統(tǒng)計學意義。(5)與對照組相比，10-8 mol/L Ang II模型組細胞的凋亡率顯著高于對照組(10.47 土 0.27 vs 8.68 土 0.31，P < 0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義；與Ang II模型組相t匕，依帕司他組凋亡率顯著增強(17.89 土 0.62 vs 10.47 土(λ 27 ;P < (λ 01)，差異具有統(tǒng)計學意義。(6)與對照組相比，10-8 mol/L Ang II模型組Bax、Bcl_2 mRNA水平顯著增高(Bax:0.0054 土 0.00006 vs 0.0032 土 0.00026，P〈 0.01 ;Bcl_2:0.0055 土 0.00025vs 0.0041 土 0.00014，P < 0.01 )，差異具有統(tǒng)計學意義；與Ang II組相比，依帕司他組Bax mRNA 水平均顯著高于 Ang II 模型組(0.0071 土 0.00005 vs 0.0054 土 0.00006 ;P< 0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義；而依帕司他組的Bcl-2 mRNA水平與Ang II模型組無統(tǒng)計學差異(0.0059 土 0.00010 vs 0.0055 土 0.00025 ;P > 0.05)。(7)與對照組相比，10-8 mol/L Ang II模型組Bax、Bcl_2蛋白水平顯著增高(Bax:1.81 土 0.04 vs 1.00 土 0.00，P < 0.01 ;Bcl_2:2.24 土 0.10 vs 1.00 土 0.00，P < 0.05)差異具有統(tǒng)計學意義；與Ang II組相比，依帕司他組的Bax蛋白水平均顯著高于Ang II模型組(2.29 土 0.05 vs 1.81 土(λ 04 ;P < (λ 01 )，差異具有統(tǒng)計學意義；而依帕司他組和不同濃度杜仲木脂素組的Bcl-2蛋白水平與Ang II模型組無統(tǒng)計學差異(2.21土 0.09 vs 2.24 土 0.10 ;P > 0.05)。(8)與對照組相比，10-8 mol/L Ang II模型組細胞內(nèi)AR活性相對于對照組明顯增強(0.19 土 0.03 vs 0.14 土 0.01，P < 0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義；與Ang II模型組相比，依帕司他組細胞內(nèi)AR活性顯著下降(0.11 土 0.01 vs 0.19 土(λ 03 ;P < 0.01)。(9)與對照組相比，10-8 mol/L Ang II模型組能夠顯著增加AR (1.35 ±0.04 vs1.00 土 0.00，P < 0.01) mRNA水平，差異具有統(tǒng)計學意義；與Ang II模型組相比，依帕司他組的AR mRNA水平較Ang II模型組增加，差異具有統(tǒng)計學意義(3.78 土 0.13 vs 1.35± 0.04，P < 0.01)o(10)與對照組相比，10-8 mol/L Ang II模型組AR蛋白水平顯著升高(2.02 土
0.08 vs 1.00 土 0.00，P < 0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義；與Ang II模型組相比，依帕司他組的AR蛋白水平較Ang II模型組顯著增加(3.13 土 0.24 vs 2.02 土 0.08，P < 0.01)。2.4結(jié)論:依帕司他能明顯抑制Ang II誘導的系膜細胞增殖；其機制可能與其影響細胞周期調(diào)節(jié)基因P21和P27及細胞凋亡調(diào)節(jié)基因Bax和Bcl_2的表達有關(guān)；AR可能在此過程中發(fā)揮了 重要作用。
權(quán)利要求
1.依帕司他在制備防治高血壓腎病藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征是，所述防治高血壓腎病藥物的劑型包括片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、貼劑，緩釋制劑和腸溶制 劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及依帕司他的新用途，具體提供了其在制備治療高血壓腎病的藥物中的應(yīng)用。經(jīng)實驗研究，依帕司他能夠抑制AngII誘導的HBZY-1增殖和細胞外基質(zhì)成分(FN、ColI和ColIII)表達，且能明顯抑制AngII誘導的系膜細胞增殖，可以用于制備治療高血壓腎病的藥物。
文檔編號A61P9/12GK103239443SQ201310183759
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月17日
發(fā)明者鄧曉蘭, 景賢, 嚴謹, 郭成賢, 李振宇, 歐陽冬生 申請人:歐陽冬生