用于鑒別野牡丹屬種的issr專用引物和方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒別野牡丹屬種的ISSR專用引物和方法，分子標記包括如下兩條引物：1)UBC857，其序列為ACA CAC ACA CAC ACA CYG；2)UBC811，其序列為GAG AGA GAG AGA GAG AC。方法為先建立野牡丹ISSR指紋圖譜，再將擴增產(chǎn)物凝膠電泳和指紋圖譜進行比較。它具有如下優(yōu)點：利用引物UBC811可以鑒別出38份野牡丹屬種質(zhì)資源，利用引物UBC851可以鑒別出42份野牡丹屬種質(zhì)資源，而采用引物UBC811和UBC857組合可以鑒別出供試的44份野牡丹種質(zhì)資源。
【專利說明】
用于鑒別野壯丹屬種的ISSR專用引物和方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及用于鑒別野牡丹屬種的ISSR專用引物和方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 野牡丹科（Melastomaceae)植物全世界約240個屬，共3000余個種。野牡丹屬 (Melastoma)屬于野牡丹科，大約有100個種，分布中屯、處于東南亞一帶，我國有9個種和1個 變種，主要分布帶處于長江W南各個省區(qū)。野牡丹屬植物花色有白色系、粉色系、紫色系，花 期長、花量大，株型從地被、灌木到小喬木均有分布，具備良好的觀賞性狀;此外，該屬植物 的藥用價值近來也有陸續(xù)的深入研究，發(fā)展前景廣泛。目前，絕大多數(shù)的野牡丹屬植物仍未 被人工開發(fā)利用，已在野牡丹屬種質(zhì)資源的收集及評價、栽培技術(shù)、脫毒育苗、傳粉特性W 及種子發(fā)育等方面進行研究。
[0003] 目前，針對野牡丹屬的分類研究主要集中于宏觀形態(tài)學、細胞遺傳學、抱粉學、細 胞學、表型多樣性等方面，利用分子標記對野牡丹種質(zhì)資源的遺傳性進行研究還比較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種用于鑒別野牡丹屬種的ISSR專用引物和方法。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題的所采用的技術(shù)方案是：
[0006] 一種用于鑒別野牡丹屬種的ISSRQnter-simple sequence repeat)專用引物，其 特征在于:它包括兩條引物：
[0007] 1)UBC857,其序列為ACA CAC ACA CAC ACA CYG
[000引 2)UBC811，其序列為GAG AGA GAG AGA GAG AC
[0009] -種用于鑒別野牡丹屬種的方法，包括如下步驟：
[0010] 1)根據(jù)前述的UBC857和UBC811引物，建立野牡丹ISSR指紋圖譜
[00川 2)提取野牡丹基因組DNA;
[001 ^ 3)提供所述的UBC857和UBC811引物，進行PCR擴增；
[001引4)擴增產(chǎn)物凝膠電泳，分析條帶，并與野牡丹ISSR指紋圖譜比對，確定野牡丹屬 種。
[0014] 優(yōu)選地，步驟3)在如下反應(yīng)條件下進行：
[0015] 30ng/uLDNA模板0.7uL，10Xbuffer化L，10mMdNTP0.6uL，10uM引物0.8uL，抓/ uL Taq酶0. luL，d地2〇定容至20uL，反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5min; 94°C變性Imin; 53°C退火 40sec;72°C 延伸 2min。
[0016] 步驟2)所述的基因組DM優(yōu)選來自葉片，也可W來自其它部位。
[0017] 本技術(shù)方案與【背景技術(shù)】相比，它具有如下優(yōu)點：
[001引利用引物UBC811可W鑒別出38份野牡丹屬種質(zhì)資源，利用引物UBC851可W鑒別出 42份野牡丹屬種質(zhì)資源，而采用引物UBC811和UBC857組合可W鑒別出待測的所有44份野牡 丹種質(zhì)資源。
【附圖說明】
[0019] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0020] 圖1 UBC857引物對44份供試樣品的ISSR圖譜。M:分子量標記；1-44見表1。（后Ξ泳 道非供試樣）。
[00別]圖2基于引物UBC811和UBC857擴增結(jié)果的44份野牡丹屬種質(zhì)資源基因組DNA的 ISSR指紋圖譜。
【具體實施方式】
[0022] 實施例1
[0023] 參見表1，本研究供試材料為野牡丹屬野生種質(zhì)資源共44份，來源于福建、廣東、廣 西、海南、云南五個省份。采集新鮮葉片凍于液氮，保存在-80°C。
[0024] 表1野牡丹屬44份供試種質(zhì)資源
[00巧]Table 1 44individuals of Melastoma
[0026]
[0027]
[0028] 實施例2
[0029] DNA 提取
[0030] 采用前期試驗確定的改良CTAB法提取野牡丹基因組DM,主要步驟為：
[0031] (1)取約Ig新鮮嫩葉，放入預(yù)冷的研鉢中，在液氮中迅速研磨成粉末，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的 lOmL離屯、管中，加入4mL預(yù)熱至65°C的CTAB抽提液，同時加入80化β-琉基乙醇，緩慢上下顛 倒混勻，65°C水浴60min(期間每lOmin顛倒混勻1次）。
[0032] (2)取出離屯、管冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，混勻，放在水平搖 床上緩慢搖晃30min，靜置后于4°C、7 500g離屯、5min，回收上(水)相。
[0033] (3)在回收的上層相中加入1/10體積的CTAB/NaCl溶液(65°C)，顛倒混勻。重復步 驟2。若上清混濁，將上清液轉(zhuǎn)入另一只lOmL離屯、管中，再加等體積的氯仿/異戊醇(24:1)， 混勻，放在水平搖床上緩慢搖晃30min，靜置后于4°C、7 500g離屯、5min。
[0034] (4)加入1倍體積的CTAB沉淀液，顛倒混勻。如果看不到沉淀，于65°C溫育30min。然 后于4°C、9 OOOg離屯、5min。用0.5mL高鹽TE緩沖液重懸沉淀，如果沉淀難重懸，于65°C溫育 30min，重復，直至所有的或大部分沉淀溶解。
[0035] (5)加入0.6體積預(yù)冷異丙醇，混勻，靜置后于4°C、7500g離屯、15min，棄上清得到白 色DNA，加入ImL 80%乙醇漂洗2次，再加入11^無水乙醇漂洗1次，風干0魁沉淀，加入0.11111 TE緩沖液，待DNA沉淀溶解后，于4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0036] 通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用分光光度法定量后，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0037] PCR 反應(yīng)
[003引 ISSR反應(yīng)體系：DNA模板（30ng/uL)0.7uL，10 X buf f er2uL，dNTP(1 OmM)0.6uL，引物 (1 OuM)0.8uL，Taq酶（5U/uL)0. luL，d地20定容20uL，
[0039]反應(yīng)程序：94°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 lmin;53°C 退火 40sec;72°C 延伸 2min。
[0040] 引物篩選：從116條ISSR隨機引物中篩選出11條多態(tài)性好、條帶清晰的引物： UBC857、UBC848、UBC842、UBC841、UBC821、UBC820、UBC811、CW32506、CW32488、CW32451、 CW32447〇
[0041] 指紋圖譜建立
[0042] 根據(jù)ISSR專用引物方法通過PCR反應(yīng)擴增出的條帶圖片，對同一引物所擴增出遷 移率相同的條帶計為一個位點，有條帶的位置計為"Γ，無條帶位置計為"0"，所得數(shù)據(jù)輸入 Excel2003工作表建成原始"0/Γ數(shù)據(jù)矩陣，利用NTSl^聚類分析軟件進行聚類分析。針對所 有供試品種，對11條ISSR引物擴增出的條帶進行比對，選出鑒別能力較強的引物，然后對由 運些引物經(jīng)PCR反應(yīng)跑出的電泳條帶進行形象化處理，同一位點上記為"Γ的電泳條帶用黑 色方塊表示，記為"0"的條帶用白色方塊表示，據(jù)此構(gòu)建出供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資源的 DNA指紋圖譜。見圖2。
[0043] 本實施例W前期試驗篩選出的11條ISSR隨機引物對供試的44份野牡丹屬種質(zhì)資 源進行DNA多態(tài)性檢測，總共擴增出91條清晰度好，重復性高的譜帶，其中多態(tài)性譜帶有90 條，多態(tài)性條帶比例為98.9% (見表2)。擴增結(jié)果表明，擴增位點最多的引物為UBC857、 UBC811和CW32506,位點數(shù)均為12個。其中引物UBC857對44份野牡丹屬種質(zhì)DNA的擴增圖譜 見圖1。
[0044] 由于ISSR引物的多態(tài)性，同一引物擴增出的44份野牡丹屬種質(zhì)資源的條帶有明顯 差異。比對結(jié)果表明：利用引物UBC811可W鑒別出38份野牡丹屬種質(zhì)資源，利用引物UBC851 可W鑒別出42份野牡丹屬種質(zhì)資源，而采用引物UBC811和UBC857組合可W鑒別出供試的44 份野牡丹種質(zhì)資源。
[0045] 引物UBC811 和UBC857序列分別為GAG AGA GAG AGA GAG AC和ACA CAC ACA CAC ACA CTG。
【主權(quán)項】
1. 一種用于鑒別野牡丹屬種的ISSR專用引物，其特征在于:它包括兩條引物： 1. UBC857,其序列為ACA CAC ACA CAC ACA CYG; 2. UBC811，其序列為GAG AGA GAG AGA GAG AC。2. -種用于鑒別野牡丹屬種的方法，包括如下步驟： 1) 根據(jù)權(quán)利要求1所述的UBC857和UBC811引物，建立野牡丹ISSR指紋圖譜； 2) 提取野牡丹基因組DNA; 3) 提供權(quán)利要求1所述的UBC857和UBC811引物，進行PCR擴增； 4) 擴增產(chǎn)物凝膠電泳，分析條帶，并與野牡丹ISSR指紋圖譜比對，確定野牡丹屬種。3. 如權(quán)利要求2所述的一種用于鑒別野牡丹屬種的方法，其特征在于，步驟2)的基因組 DNA來自葉片。4. 如權(quán)利要求2所述的一種用于鑒別野牡丹屬種的方法，其特征在于，步驟3)在如下反 應(yīng)條件下進行： 30叫/乩0財模板0.7此，10\1311打6121^，10111]\1(1町？0.61^，10碰引物0.81^，51]/1^ Taq酶0 . luL，ddH20定容至20uL，反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5min ; 94°C變性lmin ; 53 °C退火 40sec; 72°C 延伸 2min。5. -種野牡丹ISSR指紋圖譜，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求1所述的UBC857和UBC811引物 建立。
【文檔編號】C12Q1/68GK106011225SQ201610230069
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年4月14日
【發(fā)明人】鄭濤, 陳振東, 何雪嬌, 林秀香, 林藝華
【申請人】福建省熱帶作物科學研究所