一種黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物的制備方法和用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物的制備方法和用途，所述黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物為HTEMY，HTEMY化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)所示。本發(fā)明在保證黃酮醇類天然產(chǎn)物基本骨架不變的前提下，引入含氮水溶性基團，通過單分子醚化作用，對黃酮醇類天然產(chǎn)物楊梅素分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，不僅有助于提高其水溶性和穩(wěn)定性，而且在一定程度上提高了其抗植物病原菌活性和抗細(xì)菌活性。
【專利說明】
一種黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物的制備方法和用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物，特別涉及一種黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生 物的制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著人們對健康認(rèn)知度的提高，對食品藥品的健康要求也越來越高。不僅如此，隨 著人們環(huán)境保護意識的不斷加強，研究開發(fā)利用綠色環(huán)保的天然產(chǎn)物防治植物病原菌或細(xì) 菌已逐漸發(fā)展成為眾多科學(xué)工作者的重要研究課題之一。
[0003]據(jù)報道，楊梅素 (Myr icetin，縮寫MY)作為一種天然黃酮醇類天然產(chǎn)物，安全有效， 并無毒副作用，對各種植物病原菌和細(xì)菌均有一定的抗菌活性（參考文獻(xiàn)industrial Crops and Products(2014) ,59,210-215)。但是楊梅素的水溶性、穩(wěn)定性和生物利用度均 較差，極大地限制了楊梅素的應(yīng)用范圍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種新型黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物，具有較好地穩(wěn)定性和 水溶性，且具有較好的抗細(xì)菌活性和抗植物病原菌活性。
[0005] 本發(fā)明還提供了新型黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物的制備方法，在保證黃酮醇類天然 產(chǎn)物基本骨架不變的前提下，引入含氮水溶性基團，通過單分子醚化作用，對黃酮醇類天然 產(chǎn)物楊梅素分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，不僅提高了其水溶性，而且進(jìn)一步提高了其抗植物病原菌 活性和抗細(xì)菌活性。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：
[0007] -種新型黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物，所述新型黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物為HTEMY， HTEMY化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式（I)所示：
[0009] -種新型黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物的制備方法，將楊梅素溶于DMF中，加入催化劑 K2C0 3,升溫至110°C，然后緩慢加入溶有N，N_雙[2_(對甲苯磺酰氧基）乙基]-對甲苯磺酰胺 的DMF溶液，恒溫反應(yīng)3-5h;反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入乙酸乙酯中，抽濾，減壓濃縮后得到 粗產(chǎn)品，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠色譜柱或半制備HPLC法純化，干燥，得新型黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物 產(chǎn)品。一種新型黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物的用途，HTEMY應(yīng)用于制備新型植物源農(nóng)藥。
[0010] 作為優(yōu)選，HTEMY應(yīng)用于制備抑制茄子病害、西瓜病害、辣椒病害、香蕉病害或小麥 病害的新型植物源農(nóng)藥。
[0011] 作為優(yōu)選，所述茄子病害為茄子菌核病菌引發(fā)的病害，所述西瓜病害為西瓜枯萎 病菌引發(fā)的病害，所述辣椒病害為辣椒立枯絲核病菌引發(fā)的病害，所述香蕉病害為香蕉枯 萎病菌引發(fā)的病害，所述小麥病害為小麥長蠕孢引發(fā)的病害。
[0012] 一種新型黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物的用途，HTEMY應(yīng)用于制備抗菌產(chǎn)品。作為優(yōu) 選，所述抗菌產(chǎn)品為抗菌藥物、天然食品防腐劑、殺菌洗發(fā)露、殺菌香皂、殺菌沐浴露、殺菌 洗衣液、殺菌洗手液、殺菌潔廁靈、殺菌洗面奶中的一種。
[0013] 作為優(yōu)選，所述抗細(xì)菌產(chǎn)品的殺菌譜包括蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽 孢桿菌、白菜軟腐病菌和大腸埃希氏菌。
[0014] 作為優(yōu)選，HTEMY應(yīng)用于制備抗細(xì)菌產(chǎn)品時，HTEMY的濃度控制在彡31.25yg/mL。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：
[0016] 1、具有較好地水溶性，且具有較好的抗細(xì)菌活性和抗植物病原菌活性。
[0017] 2、在保證黃酮醇類天然產(chǎn)物基本骨架不變的前提下，引入含氮水溶性基團，通過 單分子醚化作用，對黃酮醇類天然產(chǎn)物楊梅素分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，不僅提高了其水溶性和 穩(wěn)定性，而且進(jìn)一步提高了其抗植物病原菌活性和抗細(xì)菌活性。
[0018] 3、本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)HTEMY對細(xì)菌的抑制作用，故而將其應(yīng)用于制備抗菌產(chǎn)品。此舉既 拓寬了楊梅素及其衍生物的應(yīng)用范圍，又為抗菌產(chǎn)品的開發(fā)提供了新的途徑。
[0019] 4、本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)HTEMY對真菌的抑制作用，故而將其應(yīng)用于制備新型植物源農(nóng)藥。 此舉既拓寬了楊梅素及其衍生物的應(yīng)用范圍，又為新型植物源農(nóng)藥的開發(fā)提供了新的途 徑。
【具體實施方式】
[0020] 下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
[0021] 本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。 下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0022] 本發(fā)明所采用的原料楊梅素（含量多98%)由本課題組從天然植物顯齒蛇葡萄 (Ampelopsis grossedentata)中提取分離得到（參見文獻(xiàn):利用高速逆流色譜法同時純化 藤茶中的二氫楊梅素和楊梅素.現(xiàn)代化工(2008)，3，44-46); N，N-雙[2-(對甲苯磺酰氧基） 乙基]-對甲苯磺酰胺，CAS 16695-22-0,由二乙醇胺與對甲苯磺酰氯反應(yīng)生成（參見文獻(xiàn)： Organic&Biomolecular Chemistry(2007)，5，3651-3656)〇
[0023] 實施例：
[0024] HTEMY合成過程如下：
[0026] 其中，Ts代表對甲苯磺?；?。
[0027]在 50ml 三口瓶中依次加入楊梅素（509mg，1.6mmol)、DMF(15mL)、K2TO3(276mg， 2. Ommo 1)，升溫至110 °C，然后緩慢滴入溶有N，N-雙[2-(對甲苯磺酰氧基）乙基]-對甲苯磺 酰胺(454mg，0 ? 8mmo 1)的DMF溶液（15mL)，恒溫110°C反應(yīng)3-5h(TLC跟蹤反應(yīng)，展開劑為石油 醚(PE):乙酸乙酯（EA):甲酸（H⑶0H) = 10:10:1，v/v)，將反應(yīng)液倒入乙酸乙酯（30-60mL) 中，抽濾，減壓濃縮后得到粗產(chǎn)品，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠色譜柱或半制備HPLC法純化，干燥，得到化 合物HTEMY(402mg)。本發(fā)明的制備方法具有合成步驟簡單，成本低，條件溫和等優(yōu)點。
[0028]產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)鑒定:淡黃色粉末。HPLC測得新型黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物HTEMY的出 峰時間為 28.710min，純度為98.32%(峰面積△%)，群(]^01〇\?(1(^￡):363.9(2.56)11111。選 用的HPLC檢測條件:色譜柱:Waters XBridge?柱(4 ? 6 X 150mm，5_);柱溫:35°C ;流動相：乙 腈:0.05 %磷酸水溶液=0.4:0.6;流速1. OmL/min，檢測波長:254nm;紫外檢測器的波長掃 描范圍為200-400nm〇
[0029] 質(zhì)譜 ESI-MS 111/2[]\1-112〇+11] +:542.54，高分辨質(zhì)譜冊￡51]\^(?〇8^1￥6)111/2 542.1113[M-H20+H] + (caled.for C26H24NO1QS 542.1115)，結(jié)合 13C-NMR譜可確定該化合物的 分子式為C26H25N0nS，不飽和度為15Q。紅外IR的v max值及其歸屬如下JSgTJcnfHOH)， 1656.8cm_1(C = 0) ai60.1,1146.5cm_1(C-0-C)a384.6,1320.7,1202.4,1084.3cm _1(S = 0) ,1599.7,1497.5,952.2,806.7,715.6,546.4cm_1(Ar) 〇
[0030] HTEMY 的核磁數(shù)據(jù)見下表表 1。其中，111-匪1?(4001抱，0150,5111?口111，1111抱），13(：-NMR(100MHz,DMS0)〇
[0031] HTEMY的1H-NMR譜中顯示有12個峰，SH 12.42為5-OH的質(zhì)子信號，因其與羰基形成 氫鍵而出現(xiàn)在低場，SH 9.68也屬于羥基的特征信號;在芳香質(zhì)子區(qū)，出現(xiàn)4個單峰(s)和2個 雙峰(d)，已知黃酮醇類化合物的B環(huán)質(zhì)子一般在較低場，A環(huán)質(zhì)子在較高場，故可知SH 7.47 和7.31分別對應(yīng)的是H-2 '和H-6 '的質(zhì)子信號，又由于H-8受到C環(huán)去屏蔽作用的影響，移向 低場，故SH 6.43和6.20分別對應(yīng)的是H-8和H-2的質(zhì)子信號，因7"和9"是對稱的，化學(xué)位移 相同，故由峰面積和耦合常數(shù)可判定S H 7.38(211，(1，1 = 8.0抱）顯示的是7〃，9〃的質(zhì)子信號， 同理知7.63(211，(1，1 = 8.0抱）是6〃，10〃的核磁信號;此外，氫譜中知4.41，4.23和3.44的8 個H代表的是4個亞甲基，而SH 2.36中的3個H代表的是1個甲基信號。
[0032] 13C-NMR譜中顯示有24個碳信號，其中Sc 129.86和126.88的峰高是其他峰的2倍， 對應(yīng)的應(yīng)是具有對稱結(jié)構(gòu)的7"，9"和6"，10"的碳信號，除去黃酮醇類化合物楊梅素的13C-NMR譜的15個碳信號（參考文獻(xiàn):Food Chemistry(2013)，136(2)，969-974)，還有7個碳信 號，4個亞甲基、1個甲基和2個5〃，8〃位的碳信號。
[0033]表1新型黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物HTEMY的核磁數(shù)據(jù)
[0036] 通過以上1^(：、1^、111^3頂3、11?、111-匪1?和13(：-匪1?等分析鑒定手段，最終確定新型 黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物HTEMY化學(xué)如式(I)所示。
[0038]新型黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物HTEMY較楊梅素母體少了一個酚羥基，而多了一個 水溶性更好的醇羥基和含氮水溶性結(jié)構(gòu)片段，有助于增加其水溶性。
[0039] 楊梅素穩(wěn)定性較差的原因是楊梅素分子4'位羥基很容易氧化而變質(zhì)，主要表現(xiàn)為 黃色的楊梅素晶體置于空氣中極易氧化變綠。將4'位羥基用含氮水溶性結(jié)構(gòu)取代之后得到 的新型黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物HTEMY同樣長時間置于空氣中仍然能保持原樣，由此可以 看出新型楊梅素衍生物的穩(wěn)定性較楊梅素母體有大幅度地提升。
[0040] 新型黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物HTEMY的抗植物病原菌活性測定
[0041 ] 1 ?供試菌種:香蕉枯萎病菌(F.oxysporum f .sp.cubense race 4);辣椒立枯絲核 病菌（R. solani (pepper strain)kuhn Schl);前子菌核病菌（S ? sclerotiorum(egg plant strain) (Lib)De Bary);小麥長懦抱(H.sporium tritici-vulgaris Nishik);西瓜枯萎病 菌(F.oxysporum f. sp.Niveum)。以上菌種由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。
[0042] 2 ?試驗方法：
[0043] (1)培養(yǎng)基的配制及滅菌
[0044]馬鈴薯洗凈去皮后，切成塊，稱取約100g，加入500ml蒸餾水，煮開后再煮沸30min， 將煮液用紗布過濾于燒杯中，用蒸餾水將濾汁補至500ml后重新倒入鍋中，加入20g蔗糖，煮 沸待蔗糖分布均勻后將濾汁倒入燒杯中；取20個100mL的錐形瓶，各加入0.4g瓊脂，再加入 20mL的上述濾汁，塞緊塞子，搖勻；121°C高壓滅菌15min備用。
[0045] (2)樣品測試：
[0046] 6mg的新型黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物HTEMY用300yL的DMS0溶解，150yL的二倍稀釋 法，一般稀釋5個濃度。配好濃度后再向20mL培養(yǎng)基中加入lOOiiL配好的藥液，如此5個濃度 分別為100，50，25，12.5，6.25μg/ml。每瓶培養(yǎng)基趁熱平行倒入3個60mm的培養(yǎng)皿中，用打孔 器傳菌，帶菌絲面朝培養(yǎng)基，然后倒扣培養(yǎng)皿，以防進(jìn)水。將菌種放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度 調(diào)至27 °C，培養(yǎng)3-5天。
[0047]用十字交叉法測量菌落直徑并校正，計算抑菌百分率，并轉(zhuǎn)換為幾率值。以藥劑濃 度的對數(shù)為橫坐標(biāo)X，抑制的機率值為縱坐標(biāo)Y，經(jīng)GraphPad軟件計算EC50。
[0048] 菌落生長直徑(mm)=兩次直徑平均值-4.0 (菌餅直徑）
[0050] 3.試驗結(jié)果:新型黃酮醇類天然產(chǎn)物HTEMY對辣椒立枯絲核病菌、香蕉枯萎病菌、 茄子菌核病菌、小麥長蠕孢、西瓜枯萎病菌的抑制中濃度EC5Q的測試結(jié)果見表2,陽性對照為 甲基托布津(Methyl thiophanate)。
[00511 表2新型黃酮醇類天然產(chǎn)物HTEMY的抗植物病原菌活性
[0053] 結(jié)果表明，新型黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物HTEMY對辣椒立枯絲核病菌（R. solani (pepper strain)kuhn Schl)、香蕉枯萎病菌（F. oxysporum f ? sp ? cubense race 4)、前子 菌核病菌（S.sclerotiorum(egg plant strain) (Lib)De Bary)、小麥長懦抱（H.sporium tritici-vulgaris Nishik)、西瓜枯萎病菌（F. oxysporum f ? sp .Niveum)均有不同程度的 抑制作用，其中對茄子菌核病菌和西瓜枯萎病菌的抑菌活性甚至優(yōu)于原料楊梅素(MY)和陽 性對照甲基托布津(Methyl thiophanate)?？怪参锊≡鷮嶒灡砻?，新型黃酮醇類天然產(chǎn) 物衍生物HTEMY可以用于開發(fā)新型植物源農(nóng)藥。
[0054] 新型黃酮醇類天然產(chǎn)物衍生物HTEMY的抗細(xì)菌活性測定
[0055] 1.供試菌種：蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus)、金黃色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtili)、白菜軟腐病菌(Erwinia carotovora)、大腸埃希氏菌(Escherichia coli)。以上菌種均由西北農(nóng)林科技大學(xué)提供。 [0056] 2 ?試驗方法：
[0057] (1)培養(yǎng)基的配制及滅菌
[0058] 硬牛肉膏培養(yǎng)基:量取1000mL去離子水，先往鍋里加入500mL去離子水，5g NaCl， 3.0g牛肉膏(冷水溶解后加入開水中），10g蛋白胨(分次撒入）。攪拌待混合均勻后加入剩余 500mL水，煮沸加入20g瓊脂粉，攪拌并調(diào)節(jié)PH至7.2，最后將培養(yǎng)基定容至1000mL。以每個錐 形瓶75mL分裝，塞緊塞子，搖勻，121°C高壓蒸汽滅菌15min后備用。
[0059] LB培養(yǎng)基:量取1000mL去離子水，先往鍋里加入500mL，5g酵母粉，10g蛋白胨(分次 撒入）。攪拌待混合均勻后加入剩余500mL水煮沸，攪拌并調(diào)節(jié)PH至7.2，最后將培養(yǎng)基定容 至1000mL。以每個錐形瓶75mL分裝，塞緊塞子，搖勻，121°C高壓蒸汽滅菌15min后備用。 [0060] (2)樣品測試：
[0061 ]取少量菌懸液于660nm下測定吸光度，以不加細(xì)菌的培養(yǎng)液為空白對照，待菌懸液 的紫外吸光度〇D66〇為l.OAbs時，進(jìn)行下一步操作。
[0062]取 5yL 濃度分別為 250，125,62.5,31.25，15.63,7.81，3.91，1.95,0.98,0.49yg/mL 的樣品溶液，并取1〇此0D66Q = 1.0的菌懸液和85yL液體培養(yǎng)基(大腸桿菌為LB培養(yǎng)基)均加 入96孔板(每個96孔板3個平行）中，混合震蕩均勻后置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8-12h，觀測記 錄MIC值。其中，樣品孔A: 5yL樣品+85yL液體培養(yǎng)基(大腸桿菌為LB培養(yǎng)基)+10yL菌懸液;空 白孔A〇: 5yL樣品溶劑DMS0+95yL液體培養(yǎng)基；陽性對照組P: 5yL氨芐青霉素+85yL液體培養(yǎng) 基(大腸桿菌為LB培養(yǎng)基)+10yL菌懸液；陰性對照組N: 5yLDMS0+85yL液體培養(yǎng)基(大腸桿菌 為LB培養(yǎng)基)+10yL菌懸液，同一樣品同時進(jìn)行三次平行試驗。
[0063] 3.試驗結(jié)果:新型黃酮醇類天然產(chǎn)物HTEMY對蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、枯 草芽孢桿菌、白菜軟腐病菌、大腸埃希氏菌的最低抑菌濃度MIC測試結(jié)果見表3,陽性對照為 氨節(jié)青霉素(Ampicillin)。
[0064] 表3新型黃酮醇類天然產(chǎn)物HTEMY的抗細(xì)菌活性
[0066]由表3可知，新型黃酮醇類天然產(chǎn)物HTEMY對蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草 芽孢桿菌、白菜軟腐病菌和大腸桿菌具有強抑制活性。從MIC值不難看出，新化合物HTEMY具 有廣譜的抑菌活性，其MIC范圍為1.95-31.25yg/mL。比較發(fā)現(xiàn)，新化合物HTEMY抗菌活性優(yōu) 于母體楊梅素(MY)，甚至是陽性對照氨芐青霉素(Ampicillin)?？辜?xì)菌試驗表明，新型黃酮 醇類天然產(chǎn)物HTEMY能用于制備抗菌產(chǎn)品。
[0067]以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的 限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。
【主權(quán)項】
1. 一種黃酬醇類天然產(chǎn)物衍生物的制備方法，其特征在于:將楊梅素溶于DMF中，加入 催化劑K2C03,升溫至11(TC，然后緩慢加入溶有N，N-雙[2-(對甲苯橫酷氧基）乙基]-對甲苯 橫酷胺的DMF溶液，恒溫反應(yīng)3-化;反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液倒入乙酸乙醋中，抽濾，減壓濃縮 后得到粗產(chǎn)品，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠色譜柱或半制備HPLC法純化，干燥，得黃酬醇類天然產(chǎn)物衍生 物產(chǎn)品。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述黃酬醇類天然產(chǎn)物衍生物為 HTEMY，HTEMY化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(I)所示：3. -種黃酬醇類天然產(chǎn)物衍生物的用途，其特征在于:所述黃酬醇類天然產(chǎn)物衍生物 為HTEMY，HTEMY應(yīng)用于制備抗菌產(chǎn)品，HTEMY化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(I)所示：4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于:所述抗菌產(chǎn)品為抗菌藥物、天然食品防腐 劑、殺菌洗發(fā)露、殺菌香皂、殺菌沐浴露、殺菌洗衣液、殺菌洗手液、殺菌潔廁靈、殺菌洗面奶 中的一種。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于:所述抗細(xì)菌產(chǎn)品的殺菌譜包括蠟狀芽抱桿 菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、白菜軟腐病菌和大腸埃希氏菌。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于:HTEMY應(yīng)用于制備抗細(xì)菌產(chǎn)品時，HTEMY的 濃度控制在>31.2化g/mL。
【文檔編號】C07D311/30GK105968078SQ201610355951
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2015年3月20日
【發(fā)明人】高坤, 吳月嬋, 陳佳
【申請人】浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院