一種dna編碼微球及其合成方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種DNA編碼微球及其合成方法，編碼微球由微球、通用引物、細胞編碼、分子編碼和捕獲探針五部分組成，其合成包括如下步驟：(1)通用引物與微球的偶聯(lián)；(2)將偶聯(lián)有通用引物的微球與PCR反應(yīng)溶液混合均勻，將單個微球包裹在油包水液滴中，繼而將細胞編碼DNA擴增到微球上；(3)分選出帶有熒光的微球，去除不帶熒光的微球，所得到的微球用變性試劑處理將微球上的雙鏈DNA產(chǎn)物變成單鏈DNA；(4)將擴增有細胞編碼DNA的微球與混合有分子編碼DNA文庫的反應(yīng)溶液混合進行混合，將分子編碼DNA反應(yīng)到微球上；(5)經(jīng)過PBS洗滌的微球，用變性試劑處理將雙鏈DNA產(chǎn)物變成單鏈DNA完成DNA編碼微球的合成。該方法具有設(shè)計簡單、價格低廉、操作方便等優(yōu)點。
【專利說明】
-種DNA編碼微球及其合成方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及一種DNA編碼微球的合成方法，屬于單細胞分析方法技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 細胞是生命體的組成W及生命活動的最基本單位。傳統(tǒng)方法對大量細胞平均信號 的分析處理使得信號的平均化模糊人們對大腦、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)，及其組成運些系統(tǒng)的 細胞之間異質(zhì)性化eterogeneity)的認識。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，單細胞測序技術(shù)已 經(jīng)成為單細胞分析的最重要的手段，它極大的提高了單細胞分析的效率和準(zhǔn)確性。對單細 胞基因水平的分析可W掲示細胞(特別是癌細胞)基因組中發(fā)生的突變W及結(jié)構(gòu)變異，了解 細胞之間對于藥物的響應(yīng)的差異性，需找到與運些病變細胞相關(guān)的特異性分子，運對現(xiàn)代 的個性化治療提供了一個重要的手段，可W更好的指導(dǎo)醫(yī)學(xué)工作者對疾病的診斷和治療， 實現(xiàn)真正的疾病個性化治療。
[0003] 單細胞分析包括單細胞分離、單細胞裂解、基因組擴增W及測序和數(shù)據(jù)分析四個 步驟。其中單細胞分離、基因組或轉(zhuǎn)錄組擴增，W及數(shù)據(jù)解讀存在著各種各樣的挑戰(zhàn)。而傳 統(tǒng)的單細胞分離手段主要由有限稀釋法、細胞流式分選W及顯微操作=種方法，運些方法 都不能保證能夠非常準(zhǔn)確的從血液、組織等實際樣品中分離得到目的細胞。分離得到的單 細胞中的極少量的基因組或者轉(zhuǎn)錄組（lpg-3pg)無法直接應(yīng)用于檢測分析，必須經(jīng)過信號 放大或者擴增，但是運種擴增通常都會因為起始原料太少產(chǎn)生明顯的偏差性而不能代表單 細胞中原始的信號。
[0004] 傳統(tǒng)的方法一次只能分析幾個或者十幾個細胞樣品，當(dāng)細胞數(shù)量增加到幾十甚至 成百上千個細胞時，傳統(tǒng)的手段需要消耗相當(dāng)多的時間W及人力物力，無法實現(xiàn)細胞的高 通量快速分析，運需要相當(dāng)大的財力W及自動化設(shè)備的投入。為了實現(xiàn)高通量單細胞基因 組或者轉(zhuǎn)錄組分析，必須對單個細胞中的轉(zhuǎn)錄組進行標(biāo)記，早期的方法是采用混合裂分法 進行DNA合成編碼微球(Brenner et al.(2000)Proc.Acad.Set USA 97:1665)，運種方法的 缺陷在于在DNA編碼的化學(xué)合成的效率不夠高，每一輪堿基的合成都會有I %的序列沒有偶 聯(lián)成功，W50-60個堿基長度的核酸序列為例，運種問題會導(dǎo)致微球上只有不到40%的序列 是正確的全長序列。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有DNA編碼微球合成復(fù)雜、昂貴等問題，提出一種簡單、便宜、高效的 DNA編碼微球合成方法。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0007] -種DNA編碼微球，其特征在于:所述的編碼微球包括微球、通用引物、細胞編碼、 分子編碼和捕獲探針五部分，其中通用引物用于PCR擴增測序使用，其一端和微球連接，另 一端和細胞編碼連接;細胞編碼在單個微球是唯一的，不同微球上的細胞編碼不同，細胞編 碼一端和通用引物連接，另一端和分子編碼連接;分子編碼在單個微球上是不同的，其一端 和細胞編碼連接，另一端和捕獲探針連接;捕獲探針用于捕獲目標(biāo)核酸分子。
[000引在本發(fā)明中，所使用的微球優(yōu)選為N-徑基班巧酷亞胺(N服)微球、簇基微球，T型或 十字交叉型微流控忍片生成的瓊脂糖微球、聚丙締酷胺微球、聚乙二醇微球中的一種。
[0009] 在本發(fā)明中，所述的通用引物為人工合成的一段寡核巧酸序列，其與一條DNA模板 鏈的一端互補，其長度范圍為18-30個堿基，由脫氧核糖核巧酸組成，通過酷胺鍵與微球連 接。所述的DNA模板為任意。
[0010] 在本發(fā)明中，所述的細胞編碼為對細胞進行編碼的隨機DNA序列，在單個微球是唯 一的，不同微球上的細胞編碼不同，長度從6到16個堿基，其與通用引物通過亞憐酷胺鍵連 接。
[0011] 在本發(fā)明中，所述的分子編碼為對單個細胞中的HiRNA分子進行標(biāo)記的隨機DNA序 列，在單個微球上的序列均不相同，長度從6到12個堿基，其與細胞編碼序列通過亞憐酷胺 鍵連接。
[0012] 在本發(fā)明中，所述的捕獲探針為一段重復(fù)的T堿基序列，用于捕獲帶有重復(fù)A堿基 序列的mRNA，產(chǎn)度從18到30個堿基，與分子編碼通過亞憐酷胺鍵連接。
[0013] -種DNA編碼微球及其合成方法，包括如下步驟：
[0014] (1)通用引物與微球的偶聯(lián)；
[0015] (2)將偶聯(lián)有通用引物的微球與PCR反應(yīng)溶液混合均勻，采用震蕩或者微流控忍片 的方法將單個微球包裹在油包水液滴中，繼而進行數(shù)字PC時尋細胞編碼DNA擴增到微球上；
[0016] (3)萃取和洗涂除去油相，用流式細胞儀分選出帶有巧光的微球，去除不帶巧光的 微球，所得到的微球用8M尿素處理將微球上的雙鏈DNA產(chǎn)物變成單鏈DNA;
[0017] (4)將擴增有細胞編碼DNA的微球與混合有分子編碼DNA文庫的反應(yīng)溶液混合進行 混合，將分子編碼DNA反應(yīng)到微球上；
[0018] (5)經(jīng)過PBS洗涂的微球，用8M尿素處理將雙鏈DNA產(chǎn)物變成單鏈DNA完成DNA編碼 微球的合成。
[0019] 在本發(fā)明的較佳實施例中，步驟（1)中，所用的引物偶聯(lián)方法可W為化學(xué)偶聯(lián)、聚 合等方式。
[0020] 在本發(fā)明的較佳實施例中，步驟(2)中，所用的PCR反應(yīng)液包括緩沖溶液、dNTP、DNA 聚合酶、引物W及細胞編碼DNA模板，單個油包水液滴中細胞編碼DNA模板不超過一個。
[0021] 在本發(fā)明的較佳實施例中，步驟(3)中，所用的萃取洗涂方式為加入環(huán)己燒和PBS 緩沖液混勻后離屯、去掉上清，=次重復(fù)后得到所需微球。
[0022] 在本發(fā)明的較佳實施例中，步驟(3)中，細胞編碼微球采用流失細胞分選的方法篩 選，去除不含有巧光的微球。
[0023] 在本發(fā)明的較佳實施例中，步驟（3)中，所用DNA單鏈化方式為加入8M尿素解育 15min，然后用超純水洗涂多次去掉尿素。
[0024] 在本發(fā)明的較佳實施例中，步驟(4)中，將分子編碼DNA文庫反應(yīng)到微球上的方法 可W為連接酶反應(yīng)、PCR反應(yīng)等。
[0025] 在本發(fā)明的較佳實施例中，步驟（5)中，所用DNA單鏈化方式為加入8M尿素解育 15min，然后用超純水洗涂多次去掉尿素，=次重復(fù)后得到所需微球。
[0026] 在本發(fā)明的較佳實施例中，一種DNA編碼微球的合成方法，引物偶聯(lián)的方式可W采 用氨基DM與瓊脂糖的希夫堿反應(yīng)，其具體步驟如下：（I)將瓊脂糖溶于超純水中，加入高艦 酸鋼活化Imin; (2)加入氨基修飾的DNA與活化的瓊脂糖室溫反應(yīng)化后，將瓊脂糖置于4°C冷 凍化；（3)將冷凝成固態(tài)的瓊脂糖置于電泳槽中，IOOV電泳化去除自由未反應(yīng)的引物，然后 對DNA進行定量完成DNA的偶聯(lián)固定。
[0027]在本發(fā)明的較佳實施例中，引物偶聯(lián)連接的方式可W采用acrydite-DNA與丙締酷 胺的共聚反應(yīng)，其具體步驟如下：（1)將丙締酷胺、acryidte-DNA、過硫酸錠混合后，抽真空 除氧氣5min; (2)再加入引發(fā)劑四甲基乙二胺，混勻后，抽真空聚合30min即可。
[002引在本發(fā)明的較佳實施例中，可W采用N-徑基班巧酷亞胺微球與氨基DNA的偶聯(lián)方 式，步驟(1)中，將IO-SOOiiM氨基DNA與N服瓊脂糖微球在碳酸氨鋼緩沖溶液(pH 7-9)中反應(yīng) 過夜即可。
[0029] 在本發(fā)明的較佳實施例中，可W采用簇基微球與氨基DNA的偶聯(lián)方式，步驟(1)中， 將IO-SOOiiM氨基DNA、0.5M EDC與簇基微球在0.1 M MES緩沖溶液(pH 4.7-6)中反應(yīng)過夜即 可。
[0030] 在本發(fā)明的較佳實施例中，使用的微流控忍片可W為T型、十字交叉型微流控忍 片。
[0031] 在本發(fā)明的較佳實施例中，步驟（1)中，所用的微球的材料可W為丙締酷胺、乙二 醇雙丙締酸醋、瓊脂糖等。
[0032] 在本發(fā)明的較佳實施例中，采用低烙點的瓊脂糖作為水凝膠微球制備原料，包括 如下步驟：（1)將瓊脂糖與共價連接在聚合物上的正向引物混勻作為水相溶液；（2)將道康 寧硅油5225C、道康寧硅油749、硅油Ar2〇W4:3:3的比例混勻作為油相；（3)利用十字形玻璃 忍片生成均勻的油包瓊脂糖液滴；（4)生成的油包瓊脂糖液滴放入4°C解育化，然后取出后 加入五倍體積的環(huán)己燒和=倍體積的超純水洗涂=次，即可得到偶聯(lián)有引物的瓊脂糖微 球。
[0033] 在本發(fā)明的較佳實施例中，采用丙締酷胺、乙二醇雙丙締酸醋作為水凝膠微球制 備原料，包括如下步驟：（1)將丙締酷胺或者乙二醇雙丙締酸醋、過硫酸錠W及acydite-修 飾的引物混勻作為水相溶液；（2)將道康寧硅油5225C、道康寧硅油749、硅油Ar20 W4:3:3的 比例混勻作為油相；（3)利用十字形玻璃忍片生成均勻的油包丙締酷胺液滴，生成的液滴通 入含有10%四甲基乙二胺的油相中引發(fā)丙締酷胺聚合形成微球；（4)在生成的油包聚丙締 酷胺微球加入五倍體積的環(huán)己燒和=倍體積的超純水洗涂=次，即可得到偶聯(lián)有引物的丙 締酷胺微球。
[0034] 在本發(fā)明的較佳實施例中，步驟(4)中，連接酶反應(yīng)的混合溶液包括T4連接反應(yīng)緩 沖溶液、T4DNA連接酶、互補CDNA W及分子編碼DNA文庫，反應(yīng)條件可W為室溫2h、16 °C化。
[0035] 在本發(fā)明的較佳實施例中，步驟(4)中，PCR反應(yīng)的混合溶液包括緩沖溶液、dNTP、 DNA聚合酶W及分子編碼DNA模板，反應(yīng)條件為56 °C化。
[0036] 優(yōu)選方法如下：
[0037] (1)合成丙締酸亞憐酷胺單體
[0038] (2)甲基丙締基團修飾的核酸分子的合成與純化
[0039] W普通CPG作為固相載體，卵NA單體堿基為原料，在DNA合成儀上由y端向5/端合 成鏈A、鏈B及l(fā)inker核酸適體，最后在兩條鏈A和B的5/端修飾上前節(jié)中合成的丙締酸亞憐 酷胺單體。具體合成的序列見表1;合成結(jié)束后，將上述CPG轉(zhuǎn)移至2mL潔凈滅菌的化pendorf 管中，加入0.5mL甲胺:氨水=1:1的溶液，在65 °C下氨解30min，使DNA從CPG上切割下來。氨 解完畢后提取上清，并用少量超純水清洗CPG，合并上清；向體系中加入2.5倍體積的冰凍無 水乙醇和0.1倍體積的3mol/L化Cl，于-20°C冰箱進行酒精沉淀30min;酒精沉淀完畢后，在 14，00化pm的轉(zhuǎn)速下離屯、IOmin，棄上清;將得到的粗產(chǎn)物純化;定量后真空濃縮；
[0040] (3)微球上引物的偶聯(lián)
[0041] 將一定濃度的丙締酷胺、甲叉丙締酷胺、acrydite修飾的通用引物W及過硫酸錠 混勻組成水相，將四甲基乙二胺與道康寧硅油混合液混合組成油相，通過十字形的微流控 忍片生成均勻粒徑的油包水液滴，液滴中的各種單體聚合形成聚合物，通用引物共價偶聯(lián) 在聚合物上。
[0042] (4)液滴數(shù)字PCR
[0043] 將修飾有通用引物的水凝膠微球與PCR反應(yīng)溶液混合均勻，采用震蕩或者微流控 忍片的方法將單個微球包裹在油包水液滴中進行數(shù)字PC時尋細胞編碼DNA擴增到微球上。
[0044] (5)DNA 單鏈化
[0045] 在上一步得到的微球溶液中加入S倍體積的環(huán)己燒和PBS，混勻后離屯、去除上清， 如此循環(huán)S次后，加入S倍體積的8M尿素溶液處理15分鐘，將雙鏈DNA產(chǎn)物變成單鏈DNA，最 后用PBS緩沖溶液洗去8M尿素溶液。
[0046] (6)微球上分子編碼的連接
[0047] 將擴增有細胞編碼DNA的微球與T4連接反應(yīng)緩沖溶液、T4DNA連接酶、互補CDNA W 及分子編碼DNA的連接反應(yīng)溶液混合進行連接反應(yīng)，將分子編碼DNA連接到微球上
[004引 （7)DNA單鏈化
[0049] 在上一步得到的微球溶液中加入S倍體積的8M尿素溶液處理15分鐘，將雙鏈DNA 變成單鏈DNA，最后用PBS緩沖溶液洗去8M尿素溶液。
[0050] 本發(fā)明的優(yōu)點在于:首先，該方法在設(shè)計上簡單可靠;其次，使用的核酸序列數(shù)目 少，大大減少了制備編碼微球的成本;最后，所使用的基質(zhì)材料范圍廣泛，并且非常便宜。
[0051] 本發(fā)明方法成本低廉，設(shè)計簡單。
【附圖說明】
[0052] 圖1為編碼微球的組成過程示意圖，編碼微球由通用引物(universal primer)、細 胞編碼（cell label)、分子編碼(UMI)、捕獲探針（capUire probe)四部分組成。
[0053] 圖2為實施例2生成共聚引物到聚丙締酷胺微球所使用的玻璃微流控忍片及其形 貌實物圖(A:全貌;B:十字交叉部分）。，微通道尺寸如下:十字交叉處220皿X 140皿(水相X 油相），垂直通道(油相)270WI1，水平通道(水相)360WI1，通道深度70WI1。
[0054] 圖3為編碼微球合成的流程圖
[0055] 圖4為實施例3合成的單分散聚丙締酷胺微球的尺寸表征，可W看到微球尺寸均 一，都在60WI1左右。（左圖為合成的單分散聚丙締酷胺微球顯微鏡圖像，右圖為統(tǒng)計的單分 散聚丙締酷胺微球的粒徑分布圖）
[0056] 圖5為實施例4液滴數(shù)字PCR擴增細胞編碼。圓圈所代表的為含有單個細胞編碼模 板擴增后的微球，其他微球則由于處于無細胞編碼模板的液滴中，沒有進行細胞編碼的擴 增。（左上為細胞編碼濃度為IfM時液滴數(shù)字PCR擴增的顯微圖像明場圖，左下為該濃度下的 巧光圖像;右上為細胞編碼濃度為IOfM時液滴數(shù)字PCR擴增的顯微圖像明場圖，左下為該濃 度下的巧光圖像）。
[0057]圖6為實施例6微球上分子編碼的連接。用巧光標(biāo)記的DNA(A21)與微球雜交，偶聯(lián) 有分子編碼的微球發(fā)出巧光，其他微球則沒有巧光。（左上和右上圖均為顯微鏡的明場圖 像，左下和右下為顯微鏡的巧光圖像）。
【具體實施方式】
[0化引材料；
[0059] 表1試劑和材料
[0060]
[0061] 在W下實施例中，所用的通用引物序列、細胞編碼、分子編碼、捕獲探針W及其他 DNA序列如表2所示：
[0062] 表2實施例1中所用DNA序列
[0063]
[0064] 其中，財日J分別代表堿基ATCG中的任意一種。
[0065] 實施例1核酸分子的合成與純化
[0066] W普通可控微孔玻璃珠(CPG)作為固相載體，WDNA單體堿基為原料，在DNA合成儀 上由3/端向5/端合成表1所示的DNA序列。合成結(jié)束后，將上述CPG轉(zhuǎn)移至2mL潔凈滅菌的 Eppendorf管中，加入0.5mL甲胺:氨水=1:1的溶液，在65°C下氨解30min，使DNA從CPG上切 割下來。氨解完畢后提取上清，并用少量超純水清洗CPG，合并上清。向體系中加入2.5倍體 積的冰凍無水乙醇和0.1倍體積的3mol/L化Cl，于-20°C冰箱進行酒精沉淀30min。酒精沉 淀完畢后，在14,000rpm的轉(zhuǎn)速下離屯、lOmin，棄上清。將得到的粗產(chǎn)物溶解在O.lmol/L的醋 酸S乙胺(TEAA)中，使用反相高效液相色譜儀進行純化。將通過反相-HPLC純化后的產(chǎn)品進 行真空干燥，溶于超純水后使用凝膠過濾柱進行脫鹽處理。使用紫外-可見分光光度計測定 26化m處核酸的吸光度，根據(jù)DNA的消光系數(shù)計算出其相應(yīng)的物質(zhì)的量和濃度值。定量后真 空濃縮。
[0067] 實施例2十字形玻璃微流控忍片的制作
[0068] 使用AutoCAD軟件畫出忍片的二維結(jié)構(gòu)，并制作掩膜版。利用軟光刻技術(shù)將圖形轉(zhuǎn) 移到銘板玻璃上，顯影堅膜去銘層后，將忍片置于腐蝕液化F:HW)3:出0=1:2:17)中腐蝕 lOOmin，即可獲得忍片結(jié)構(gòu)，并去除剩余的光刻膠和銘層。采用打孔機用1.8mm的鉆頭進行 打孔。之后將忍片放入食人魚洗液(濃硫酸/也化，v:v = 3:l)中加熱40minW保證忍片的潔 凈。用超純水、丙酬、超純水、硫酸、超純水依次超聲清洗，保證忍片的清潔。將刻蝕有結(jié)構(gòu)的 玻璃忍片與同樣材料的平面玻璃用鐵夾子固定在一起，放入馬弗爐中程序控溫將兩塊玻璃 鍵合在一起。控溫程序如下：WlOtVmin從室溫升到100°C，保持化；WlO/min從100°C升到 600°C，保持化；W1 (TC/min從100°C降到室溫，結(jié)束。在制作好的玻璃忍片的通道中依次通 入超純水、丙酬、超純水、硫酸、超純水清洗，用氮氣吹干后通入1%十八烷基=氯硅烷的甲 苯溶液對通道進行疏水化處理，再用甲苯清洗通道后氮氣吹干待用。
[0069] 圖2為生成共聚引物到聚丙締酷胺微球所使用的玻璃微流控忍片及其形貌圖，微 通道尺寸如下：十字交叉處220WI1X 140皿(水相X油相），垂直通道（油相）270WI1，水平通道 (水相)360皿，通道深度70皿。
[0070] 實施例3聚丙締酷胺微球的生成
[0071 ]事先配制好油相和分散相，其中油相中各成分的配比為:40 % (w/w)道康寧5225C， 30%(w/w)道康寧749,30%(w/w)硅油Ar20，分散相為20%(w/v)丙締酷胺，0.1%N,N'-甲叉 丙締酷胺，0.14 % (w/v)過硫酸錠，16]iM aerydi te修飾的引物水溶液。實施例2制備的十字 流聚焦忍片上生成大小均勻的丙締酷胺液滴的過程:利用哈佛超高壓精密注射累分別將注 射器中作為分散相的丙締酷胺溶液和作為連續(xù)相的混合硅油分別從忍片的水平通道和兩 側(cè)垂直通道注入。油相的流速為ImLA，水相的流速為O. ImLA，生成的丙締酷胺液滴收集到 含有10%四甲基乙二胺的油相溶液中進行聚合反應(yīng)，得到聚丙締酷胺微球。在該體系中加 入3倍體積的環(huán)己燒，洗涂離屯、后去除有機相上清，重復(fù)2次后加入3倍體積的PBS緩沖溶液 和3倍體積的環(huán)己燒，此時微球會分散在水相溶液中，離屯、去除上清后，重復(fù)該操作2次。最 后用PBS清洗3次，放置于4 °C保存。
[0072] 實施例4微球數(shù)字PCR
[0073] 按照表3所示配方配制各組的PCR反應(yīng)液，Blank，A，B，C各組反應(yīng)液中細胞編碼DNA 的最終濃度分別為每液滴含0，〇. 15，1，1.5個拷貝。將PCR反應(yīng)液混合均勻后分別與I(K)化油 相震蕩產(chǎn)生油包水液滴，在熱循環(huán)擴增儀上按照如下步驟擴增：（l)94°C，3min;(2)94°C-56 。(:-72°C，各30sec，循環(huán)40次；（3)72°C，5min; (4)4°C，3min。
[0074] 表3. PCR反應(yīng)溶液配方(微升）
[0075]
[0076] 實施例5單鏈化
[0077] 在經(jīng)過數(shù)字PCR的微球溶液中加入S倍體積的環(huán)己燒和PBS，混勻后離屯、去除上 清，如此循環(huán)S次后，加入S倍體積的8M尿素溶液處理15分鐘，將雙鏈DNA產(chǎn)物變成單鏈 DNA，最后用PBS緩沖溶液洗去8M尿素溶液。
[007引實施例6分子編碼的連接反應(yīng)
[0079] 將擴增有細胞編碼DNA的微球與T4連接反應(yīng)緩沖溶液、T4DNA連接酶、連接CDNA W 及分子編碼DNA的連接反應(yīng)溶液混合進行連接反應(yīng)，將分子編碼DNA連接到微球上。
[0080] 實施例7單鏈化
[0081 ]在上一步得到的微球溶液中加入S倍體積的8M尿素溶液處理15分鐘，將雙鏈DNA 變成單鏈DNA，最后用PBS緩沖溶液洗去8M尿素溶液。
【主權(quán)項】
1. 一種DNA編碼微球，其特征在于:所述的編碼微球包括微球、通用引物、細胞編碼、分 子編碼和捕獲探針五部分，其中通用引物用于PCR擴增測序使用，其一端和微球連接，另一 端和細胞編碼連接;細胞編碼在單個微球是唯一的，不同微球上的細胞編碼不同，細胞編碼 一端和通用引物連接，另一端和分子編碼連接;分子編碼在單個微球上是不同的，其一端和 細胞編碼連接，另一端和捕獲探針連接;捕獲探針用于捕獲目標(biāo)核酸分子。2. -種DNA編碼微球的合成方法，包括如下步驟： (1) 通用引物與微球偶聯(lián)； (2) 將偶聯(lián)有通用引物的微球與PCR反應(yīng)溶液混合均勻，將單個微球包裹在油包水液滴 中，繼而進行數(shù)字PCR將細胞編碼DNA擴增到微球上； (3) 萃取和洗滌除去油相，分選出帶有熒光的微球，去除不帶熒光的微球，所得到的微 球用變性試劑處理將微球上的雙鏈DNA產(chǎn)物變成單鏈DNA; (4) 將擴增有細胞編碼DNA的微球與混合有分子編碼DNA文庫的反應(yīng)溶液混合進行混 合，將分子編碼DNA反應(yīng)到微球上； (5) 經(jīng)過PBS洗滌的微球，用變性試劑處理將雙鏈DNA產(chǎn)物變成單鏈DNA完成DNA編碼微 球的合成。3. 如權(quán)利要求2所述的一種DNA編碼微球的合成方法，其特征在于:步驟（1)中使用的微 球為N-羥基琥珀酰亞胺微球、羧基微球，T型或十字交叉型微流控芯片生成的瓊脂糖微球、 聚丙烯酰胺微球，聚乙二醇微球中的至少一種。4. 如權(quán)利要求2所述的一種DNA編碼微球的合成方法，其特征在于:步驟（1)中，具體步 驟如下：1)將瓊脂糖溶于超純水中，加入高碘酸鈉活化Imin; 2)加入氨基修飾的通用引物與 活化的瓊脂糖室溫反應(yīng)2h后，將瓊脂糖置于4°C冷凍lh;3)將冷凝成固態(tài)的瓊脂糖置于電泳 槽中，IOOV電泳Ih去除自由未反應(yīng)的引物，然后對DNA進行定量完成DNA的偶聯(lián)固定;或 步驟（1)采用步驟如下：1)將丙稀酰胺、acryidte修飾的通用引物、過硫酸銨混合后，抽 真空除氧氣5min;2)再加入引發(fā)劑四甲基乙二胺，混勻后，抽真空聚合30min即可。5. 如權(quán)利要求2所述的一種DNA編碼微球的合成方法，其特征在于:步驟(2)中，所用的 PCR反應(yīng)液包括緩沖溶液、dNTP、DNA聚合酶、引物以及細胞編碼DNA模板，單個油包水液滴中 細胞編碼DNA模板不超過一個。6. 如權(quán)利要求2所述的一種DNA編碼微球的合成方法，其特征在于:步驟(3)中，細胞編 碼微球的篩選方法為流失細胞分選和磁珠篩選，去除不含有熒光的微球;所用DNA單鏈化方 式為加入8M尿素或者0.1 M氫氧化鈉溶液孵育15min，然后用超純水洗滌多次去掉變性試劑。7. 如權(quán)利要求2所述的一種DNA編碼微球的合成方法，其特征在于:步驟(4)中，將分子 編碼DNA文庫反應(yīng)到微球上的方法為連接酶反應(yīng)或PCR反應(yīng)。8. 如權(quán)利要求7所述的一種DNA編碼微球的合成方法，其特征在于:低熔點的瓊脂糖水 凝膠微球的制備步驟如下：（1)將瓊脂糖與共價連接在聚合物上的通用引物混勻作為水相 溶液；（2)將道康寧硅油5225C、道康寧硅油749、硅油Ar20以4:3:3的比例混勻作為油相；（3) 利用十字形玻璃芯片生成均勻的油包瓊脂糖液滴；（4)生成的油包瓊脂糖液滴放入4°C孵育 lh，然后取出后加入五倍體積的環(huán)己烷和三倍體積的超純水洗滌三次，即可得到偶聯(lián)有引 物的瓊脂糖微球。9. 如權(quán)利要求2所述的一種DNA編碼微球的合成方法，其特征在于：聚丙烯酰胺水凝膠 微球、聚乙二醇水凝膠微球的制備步驟如下：（1)將丙烯酰胺或者乙二醇雙丙烯酸酯、過硫 酸銨以及acydite-修飾的引物混勻作為水相溶液；（2)將道康寧硅油5225C、道康寧硅油 749、硅油Ar20以4:3:3的比例混勻作為油相；（3)利用十字形玻璃芯片生成均勻的油包丙烯 酰胺液滴，生成的液滴通入含有10%四甲基乙二胺的油相中引發(fā)丙烯酰胺聚合形成微球； (4)在生成的油包聚丙烯酰胺微球加入五倍體積的環(huán)己烷和三倍體積的超純水洗滌三次， 即可得到偶聯(lián)有引物的丙烯酰胺微球。10.如權(quán)利要求2所述的一種DNA編碼微球的合成方法，其特征在于:步驟(4)中，連接酶 反應(yīng)的混合溶液包括T4連接反應(yīng)緩沖溶液、T4DNA連接酶、互補cDNA以及分子編碼DNA文庫， 反應(yīng)條件為室溫2h、16 °C、8h; PCR反應(yīng)的混合溶液包括緩沖溶液、dNTP、DNA聚合酶以及分子 編碼DNA模板，反應(yīng)條件為56 °C，2h。
【文檔編號】C12N15/11GK105925572SQ201610399668
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月7日
【發(fā)明人】楊朝勇, 鄒遠, 許醒, 宋彥齡, 張明霞, 朱志
【申請人】廈門大學(xué)