一種控制分子量制備細(xì)菌纖維素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種控制分子量制備細(xì)菌纖維素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌纖維素(BC)是一種W木醋桿菌(Acetobacter Xylinum, A.X)為代表的微生 物合成的胞外多糖，是D-化喃葡萄糖單體We-I，4糖巧鍵聚合而成的直鏈高分子化合物，其 聚合度(DPw)在1050-16800不等，直鏈間彼此平行且無分支結(jié)構(gòu)，相鄰糖鏈通過分子內(nèi)和分 子間氨鍵作用形成=維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。BC具有植物纖維素?zé)o法比擬的一些優(yōu)良性能，如純度高、 結(jié)晶度高、極佳的形狀維持能力和抗撕力等，更重要的是BC在其合成時(shí)性能可調(diào)控，故而被 認(rèn)為是目前世界上最好的纖維素。但BC的溶解非常困難，如果采用BC作為模型化合物去深 入研究纖維素，尤其需要可溶解且窄的甚至均一的分子量分布的BC。
[0003] 但目前運(yùn)樣的報(bào)道及研究較少，2012年馮玉紅等通過半乳糖醒酸合成了低相對(duì)分子 質(zhì)量的細(xì)菌纖維素；另外，Kun化iko Waanabe等通過在合成體系中添加一些不能使分子鏈 端再增長(zhǎng)的封端單體，如甘油(glycerol)來達(dá)到生物合成控制分子量的目的。所W，非常有 必要尋求控制分子量的行之有效切實(shí)和工業(yè)化的方法，來制備可溶解的不同分子量的BC。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，在細(xì)菌纖維素制備過程中通過優(yōu)化培養(yǎng) 體系，并添加甘油醒或甘露糖直接作為封端碳源合成入產(chǎn)物分子中，使產(chǎn)物不再具備使纖 維素分子鏈再增長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)；由此達(dá)到控制分子鏈增長(zhǎng)的目的，實(shí)現(xiàn)了分子量的控制，制備可 溶解的不同分子量的BC。
[0005] 本發(fā)明技術(shù)方案為： 一種控制分子量制備細(xì)菌纖維素的方法，包括W下步驟： 1) 菌種的活化:將木醋桿菌菌種經(jīng)固體斜面培養(yǎng)基3(TC恒溫靜置活化3~5天，再接種 于種子培養(yǎng)基中，于25 °C恒溫靜置培養(yǎng)2天，得液體活化種子液； 2) BC膜的制備:將液體活化種子液W體積分?jǐn)?shù)為4.0~8.0%的接種量，接入發(fā)酵培養(yǎng)基 中，在發(fā)酵培養(yǎng)基里面添加濃度為5~20g/L的甘油醒或甘露糖作為封端碳源，28~32°C超 聲至完全溶解，超濾，濾液30°C恒溫震蕩化，加碳酸氨鋼的飽和水溶液調(diào)pH值至7.0，30°C靜 置培養(yǎng)2~3天，得到透明BC膜； 3) BC膜的純化 將透明BC膜用超純水沖洗2地，然后用質(zhì)量濃度1~2%的氨氧化鋼水溶液于90°C煮地， 再用乙酸中和PH值至7.0,最后用去離子水沖洗后，于28~32°C真空干燥至恒重，得到干態(tài) 的細(xì)菌纖維素。
[0006] 步驟1)中，所述的斜面培養(yǎng)基為每升含有硫酸錠3~5 g，硫酸儀0.2~1 g，瓊脂15 ~20 g，余量為新鮮挪子水，pH 3.5~5.0; 步驟1)中，所述的種子培養(yǎng)基為每升含有薦糖0~50g，硫酸錠3~5g，硫酸儀0.2~Ig, 憐酸二氨鐘0.5~2g，余量為發(fā)酵挪子水，pH 3.50~5. OO; 步驟2)中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為每升含有薦糖0~20g，硫酸錠3~5g，硫酸儀0.2~Ig, 憐酸二氨鐘0.5~2g，余量為發(fā)酵挪子水，pH 3.50~5.00; 上述發(fā)酵挪子水優(yōu)選新鮮挪子水自然發(fā)酵3~5天； 進(jìn)一步地，所述的發(fā)酵挪子水更優(yōu)選新鮮挪子水添加2~5wt%鮮棒紫馨汁后自然發(fā)酵3 ~5天。
[0007] 本發(fā)明控制分子量制備細(xì)菌纖維素的方法，其有益效果為：W挪子水為主要培養(yǎng) 體系，通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分及在BC膜制備的發(fā)酵過程中添加不同比例的封端碳源甘露糖或 者甘油醒，大大降低了BC的分子量，同時(shí)產(chǎn)物的微觀結(jié)構(gòu)、產(chǎn)率、持水率、結(jié)晶指數(shù)、熱穩(wěn)定 性及重現(xiàn)性都較好，操作簡(jiǎn)便，便于工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0008] 圖1為細(xì)菌纖維素的紅外譜圖，圖中巧只加薦糖，2為只加甘油醒，3為只加甘露 糖； 圖2為分別W純的薦糖、甘露糖和甘油醒合成細(xì)菌纖維素的掃描電鏡圖，a薦糖，b甘露 糖，C甘油醒； 圖3為不同碳源合成細(xì)菌纖維素的X-射線衍射譜圖，1薦糖，2甘露糖，3甘油醒； 圖4為不同碳源合成細(xì)菌纖維素的熱失重曲線圖，1薦糖，2甘露糖，3甘油醒。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 下面將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，運(yùn)些描述并不是對(duì)本
【發(fā)明內(nèi)容】
作進(jìn) 一步的限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，對(duì)本
【發(fā)明內(nèi)容】
所作的等同替換，或相應(yīng)的改進(jìn)，仍 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0010] 本發(fā)明實(shí)施例主要原料、試劑和儀器 菌種：木醋桿菌Y〇5(Acetobacter xylinum Y05)，購自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、， CCTCC M207163。
[0011] 試劑:新鮮挪子水;新鮮挪子水自然發(fā)酵3~5天的發(fā)酵挪子水;新鮮挪子水添加2 ~5wt%鮮棒紫馨汁后自然發(fā)酵3~5天的發(fā)酵挪子水;甘露糖、甘油醒及其他試劑均為分析 純。
[001 ^ 儀器:傅里葉變換紅夕憂譜儀(TENS0R27型）：德國(guó)化址er公司；多晶X射線衍射儀 (D8 Advance):德國(guó)化址er公司；凝膠色譜分析儀(Watersl515 HPLC累，Waters2414示差檢 測(cè)器）：美國(guó)Waters公司；掃描電鏡（S-3000N):日本Hitachi公司；熱失重分析儀（SDT-Q600):美國(guó)TA公司。
[0013]實(shí)施例1(發(fā)酵培養(yǎng)基中薦糖:甘油醒質(zhì)量比為10:10) 一種控制分子量制備細(xì)菌纖維素的方法，包括W下步驟： 1)菌種的活化:將木醋桿菌菌種經(jīng)固體斜面培養(yǎng)基3(TC恒溫靜置活化4天，再接種于種 子培養(yǎng)基中，于25 °C恒溫靜置培養(yǎng)2天，得液體活化種子液;斜面培養(yǎng)基為每升含有硫酸錠 4邑，硫酸儀0.5 g，瓊脂18 g，余量為新鮮挪子水，pH 4.0;種子培養(yǎng)基為每升含有薦糖25邑， 硫酸錠4g，硫酸儀0.5g，憐酸二氨鐘1.5g，余量為發(fā)酵挪子水，pH 4.5; 2) BC膜的制備:將液體活化種子液W體積分?jǐn)?shù)為6.0%的接種量，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在 發(fā)酵培養(yǎng)基里面添加濃度為lOg/L的甘油醒，28°C超聲至完全溶解，超濾，濾液30°C恒溫震 蕩化，加碳酸氨鋼的飽和水溶液調(diào)pH值至7.0，30°C靜置培養(yǎng)2天，得到透明BC膜;發(fā)酵培養(yǎng) 基為每升含有薦糖IOg，硫酸錠4g，硫酸儀0.6g，憐酸二氨鐘1.5g，余量為自然發(fā)酵挪子水， 抑 4.5; 3) BC膜的純化 將透明BC膜用超純水沖洗2地，然后用質(zhì)量濃度1.5%的氨氧化鋼水溶液于90°C煮地，再 用乙酸中和PH值至7.0,最后用去離子水沖洗后，于30°C真空干燥至恒重，得到干態(tài)的細(xì)菌 纖維素。
[0014] 步驟1)和2)中，所述的發(fā)酵挪子水為新鮮挪子水添加3wt%鮮棒紫馨汁后自然發(fā)酵 4天。
[0015] 實(shí)施例2~4: 方法同實(shí)施例1，不同之處在于發(fā)酵培養(yǎng)基中薦糖:甘油醒質(zhì)量比依次為15:5、5:15、0: 20 O
[0016] 實(shí)施例5(發(fā)酵培養(yǎng)基中薦糖:甘露糖質(zhì)量比為10:10) 一種控制分子量制備細(xì)菌纖維素的方法，包括W下步驟： 1) 菌種的活化:將木醋桿菌菌種經(jīng)固體斜面培養(yǎng)基3(TC恒溫靜置活化3天，再接種于種 子培養(yǎng)基中，于25 °C恒溫靜置培養(yǎng)2天，得液體活化種子液;斜面培養(yǎng)基為每升含有硫酸錠3 g，硫酸儀0.2 g，瓊脂15 g，余量為新鮮挪子水，pH 3.5;種子培養(yǎng)基為每升含有薦糖5g，硫 酸錠3g，硫酸儀0.2g，憐酸二氨鐘0.5g，余量為發(fā)酵挪子水，pH 4.00; 2) BC膜的制備:將液體活化種子液W體積分?jǐn)?shù)為4.0%的接種量，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在 發(fā)酵培養(yǎng)基里面添加濃度為lOg/L的甘露糖，28°C超聲至完全溶解，超濾，濾液30°C恒溫震 蕩化，加碳酸氨鋼的飽和水溶液調(diào)pH值至7.0，30°C靜置培養(yǎng)3天，得到透明BC膜;發(fā)酵培養(yǎng) 基為每升含有薦糖lOg，硫酸錠3g，硫酸儀0.2g，憐酸二氨鐘0.5g，余量為自然發(fā)酵挪子水， 抑 3.50; 3) BC膜的純化:將透明BC膜用超純水沖洗2地，然后用質(zhì)量濃度2%的氨氧化鋼水溶液于 90°C煮地，再用乙酸中和PH值至7.0,最后用去離子水沖洗后，于28°C真空干燥至恒重，得到 干態(tài)的細(xì)菌纖維素。
[0017] 步驟1)和2)中，所述的發(fā)酵挪子水為新鮮挪子水自然發(fā)酵3天。
[001引實(shí)施例6~8: 方法同實(shí)施例5,不同之處在于發(fā)酵培養(yǎng)基中薦糖:甘露糖質(zhì)量比依次為15:5、5:15、0: 20 O
[0019] 實(shí)施例9 一種控制分子量制備細(xì)菌纖維素的方法，包括W下步驟： 1) 菌種的活化:將木醋桿菌菌種經(jīng)固體斜面培養(yǎng)基3(TC恒溫靜置活化5天，再接種于種 子培養(yǎng)基中，于25 °C恒溫靜置培養(yǎng)2天，得液體活化種子液;斜面培養(yǎng)基為每升含有硫酸錠5 g，硫酸儀Ig，瓊脂20 g，余量為新鮮挪子水，P冊(cè).0;種子培養(yǎng)基為每升含有薦糖50g，硫酸錠 Sg，硫酸儀1 g，憐酸二氨鐘2g，余量為發(fā)酵挪子水，pH 5.00; 2) BC膜