一種光學純2-羥基丁酸的生物制備新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物催化制備藥物中間體和綠色化學領(lǐng)域，設(shè)及一種由蘇氨酸一鍋法 制備光學純2-徑基下酸的方法。主要設(shè)及一種(10-2-?基下酸與（5)-2-?基下酸的生物制 備新方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性2-徑基下酸可廣泛應(yīng)用于藥物合成、生物可降解材料及精細化學品的合成。 如(10-2-?基下酸可用于抗癒痛藥物左乙拉西坦及布瓦西坦的合成，（5)-2-?基下酸則可 用于PPARa括抗劑(R)-K-13675與PPAR 丫括抗劑MK-0533的合成。此外，光學純的2-徑基下 酸在生物可降解材料領(lǐng)域也有巨大的應(yīng)用前景。
[0003] 文獻報道光學純2-徑基下酸的生產(chǎn)主要有2-下酬酸的酶催化還原法、2-徑基下酸 的酶催化拆分法，如馬翠卿等(CN101974603)報道了利用含NAD(煙酷胺腺嚷嶺雙核巧酸） 非依賴性1-徑酸脫氨酶的微生物完整細胞或粗酶液拆分2-徑基下酸生成(10-2-?基下酸 及2-下酬酸的方法。由于2-下酬酸及2-徑基下酸生產(chǎn)成本較高，致使光學醇2-徑基下酸生 產(chǎn)成本居高不下。文獻調(diào)研發(fā)現(xiàn)蘇氨酸脫水酶可W催化蘇氨酸脫水生成2-下酬酸，但是，由 于2-下酬酸對該酶具有較大的抑制作用，致使累積的產(chǎn)物濃度不是很高。
[0004] 我們發(fā)現(xiàn)目前生物催化合成(10-2-?基下酸或(5)-2-?基下酸的工藝中，尚沒有 利用生物催化劑由蘇氨酸一鍋法合成(10-2-?基下酸或(5)-2-?基下酸的方法。本方法利 用蘇氨酸脫水酶、乳酸脫氨酶與甲酸脫氨酶進行串聯(lián)反應(yīng)或在基因工程菌中共表達蘇氨酸 脫水酶、乳酸脫氨酶與甲酸脫氨酶，由蘇氨酸一鍋法制備(10-2-?基下酸或（5)-2-?基下 酸。該過程具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)速度快、無污染和工藝路線簡單等顯著特點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對已報道制備方法中（10-2-?基下酸或(5)-2-?基下酸產(chǎn)物濃度低、光學純度 不高、生產(chǎn)成本高等問題，本發(fā)明提出利用蘇氨酸脫水酶、乳酸脫氨酶與甲酸脫氨酶催化蘇 氨酸一鍋法生產(chǎn)(R)-2-超基下酸或(S)-2-超基下酸。（如化學方程式1)。
[0006] 化學方程式1合成路線。
[0007] 本發(fā)明的具體步驟如下： 1.單表達載體的構(gòu)建 本發(fā)明中所述的產(chǎn)蘇氨酸脫水酶的基因工程菌，具體的構(gòu)建方法是：W大腸桿菌K12基 因組DNA為模板，根據(jù)預(yù)先設(shè)計好的引物i 1 vA-F(CGCGGATCCGATGGCTGACTCGCAAC)和i 1 vA-R (CCCAAGCTTTCACTAACCCGCCAAAAAG)的PCR擴增條件和擴增體系進行PCR，得到i I vA基因， BamHI和HindIII雙酶切后與BamHI和HindIII雙酶切后的pRSFduet載體連接，轉(zhuǎn)化化21 (DE3)感受態(tài)，挑取單克隆搖菌，提質(zhì)粒進行雙酶切驗證，酶切片段大小正確的質(zhì)粒進行測 序進一步驗證。
[0008] 本發(fā)明中所述的產(chǎn)乳酸脫氨酶的基因工程菌，具體的構(gòu)建方法是:將來源于表皮 葡萄球菌（51:日地5^1〇(3〇(3州8 691(161'1111(113)41'〔〔 12228的0型乳酸脫氨酶基因（0-〇)的和來 源于家兔(化yctolagus cuniculus )的L型乳酸脫氨酶基因化-LDH)由上海旭冠公司合成， 分別連接在pRSFduet和祀T32a載體上。然后將表達載體分別轉(zhuǎn)入化21 (DE3)感受態(tài)，挑取 單克隆搖菌，并對基因工程菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，實現(xiàn)了 D型乳酸脫氨酶與L型乳酸脫氨酶的高 效異源表達。
[0009] 2.雙酶共表達載體的構(gòu)建 分別將pRSFduet-D-LDH和祀T32aA-LDH用Nde巧日趾〇1酶切，膠回收D-LD^PkL畑基 因片段，分別連接到pRSFduet-i 1 vA載體的第二個表達框，轉(zhuǎn)化化21 (DE3)感受態(tài)，挑取單 克隆搖菌，提質(zhì)粒進行雙酶切驗證，酶切片段大小正確的質(zhì)粒進行測序進一步驗證，得到 pRSFduet-ilvA- D -LDH and pRSFduet-ilvA- L -LDH雙酶共表達載體。
[0010] 3.=酶共表達載體的構(gòu)建 從本實驗室保存質(zhì)粒pET21d-FDH上擴增得到來源于博伊下假絲酵母（Candida boidinii)的甲酸脫氨酶的整個表達框(包含RBS序列和啟動子），通過互補序列用一步克隆 試劑盒將片段連接在pRSFduet-i IvAA-LDH and pRSFduet-i IvA-D-LDH雙表達載體上，轉(zhuǎn) 化化21 (DE3)感受態(tài)，挑取單克隆搖菌，提質(zhì)粒進行雙酶切驗證，酶切片段大小正確的質(zhì)粒 進行測序進一步驗證，得到pRSFduet-i 1 vAA-LDH-抑H 和 pRSFduet-i 1 vA-D-LDH-抑HS酶 共表達載體。然后將分別表達載體轉(zhuǎn)入化21 (DE3)感受態(tài)，挑取單克隆搖菌，并對基因工程 菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，實現(xiàn)高效異源表達。
[0011] 4.酶的表達與菌體收集 將含有質(zhì)粒的大腸桿菌化21 (DE3)在37°C搖床過夜培養(yǎng)種子液,1%接種LB液體培養(yǎng)基 中進行培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)至0D600約0.8后，向其中加入終濃度0.1 mM的異丙基-P-D-硫代化喃 半乳糖巧（IPTG)進行誘導(dǎo)表達，誘導(dǎo)溫度為25°C，誘導(dǎo)時間為20小時。誘導(dǎo)表達結(jié)束后，于 6000巧m離屯、20分鐘收集菌體。
[0012] 本發(fā)明中所述的蘇氨酸脫水酶、乳酸脫氨酶與甲酸脫氨酶重組菌及=酶共表達重 組菌所用到的載體系列包括:pET系列質(zhì)粒、pTXBl系列、pGEX系列、pETduet系列、pTYB系列。
[0013] 本發(fā)明中所述的蘇氨酸脫水酶、乳酸脫氨酶與甲酸脫氨酶重組菌及=酶共表達重 組菌，其特征在于所述的能高效表達外源基因的宿主菌為下列之一 :BL21系列、Rosetta系 列、Origami系列、Tuner系列。
[0014] 在本發(fā)明中，由構(gòu)建的蘇氨酸脫水酶質(zhì)粒、D-乳酸脫氨酶質(zhì)粒、L-乳酸脫氨酶質(zhì) 粒、甲酸脫氨酶質(zhì)粒W及=酶共表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主得到的轉(zhuǎn)化體可W基于已知信息生長并 產(chǎn)生本發(fā)明所述的蘇氨酸脫水酶、D-乳酸脫氨酶、1^-乳酸脫氨酶和甲酸脫氨酶。任何一種人 工的或天然的含有合適碳源、氮源、無機和其他營養(yǎng)物質(zhì)的介質(zhì)，只要能滿足宿主菌體的生 長并且能夠表達出目的蛋白均可使用。培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件沒有明確的限制，可W根據(jù)培 養(yǎng)方法和類型等的不同而進行適當?shù)倪x擇，只要能滿足宿主生長并能產(chǎn)生相應(yīng)活性的蘇氨 酸脫水酶、D-乳酸脫氨酶、乳酸脫氨酶和甲酸脫氨酶即可。
[0015] 本發(fā)明還設(shè)及利用蘇氨酸脫水酶、甲酸脫氨酶和D-乳酸脫氨酶或k乳酸脫氨酶轉(zhuǎn) 化蘇氨酸制備(10-2-?基下酸或(5)-2-?基下酸的方法，所述方法為： 1)將所述產(chǎn)蘇氨酸脫水酶、甲酸脫氨酶、D-乳酸脫氨酶或k乳酸脫氨酶的基因工程菌 經(jīng)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，按一定比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時間后，加入誘導(dǎo)劑IPTG或乳 糖或二者混合物誘導(dǎo)培養(yǎng)一定時間，離屯、收集菌體，然后將蘇氨酸脫水酶、甲酸脫氨酶和D-乳酸脫氨酶或レ乳酸脫氨酶加入到pH值為7.0~8.5的緩沖液(含35.7~89.3 g/L蘇氨酸、 62.4~156g/L甲酸鋼、0~0.1mM憐酸化唉醒(PLP)、0.5g/LNAD+)，利用抑在線調(diào)控系統(tǒng)， 流加2 M HC1，控制反應(yīng)體系的抑維持在7.0~8.5,在25~30 °C反應(yīng)完全后經(jīng)離屯、、酸化、 萃取、脫溶后得到(10-2-?基下酸或(5)-2-?基下酸，收率大于90%。
[0016] 2)將所述產(chǎn)蘇氨酸脫水酶、甲酸脫氨酶、D-乳酸脫氨酶或k乳酸脫氨酶的共表達 基因工程菌經(jīng)種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，按一定比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)一定時間后，加入誘導(dǎo) 劑IPTG或乳糖或二者混合物誘導(dǎo)培養(yǎng)一定時間，離屯、收集菌體，加入pH值為7.0~8.5的緩 沖液(含35.7~89.3 g/L蘇氨酸、62.4~156 g/L甲酸鋼、0~0.1 mM PLP、0.5 g/L NAD+)，利 用抑在線調(diào)控系統(tǒng)，流加2 M肥1，控制反應(yīng)體系的pH維持在7.0~8.5,在25~30 °C反應(yīng)完 全后經(jīng)離屯、、酸化、萃取、脫溶后得到(10-2-?基下酸或(5)-2-?基下酸，收率大于90%。
[0017] 反應(yīng)中適用的介質(zhì)可W是水或含有不同緩沖液的水介質(zhì)，其所用的緩沖液可W是 水中加入一種或幾種憐酸鹽或化is硫酸鹽。
[0018] 本發(fā)明所述的抑值優(yōu)選蘇氨酸脫水酶、甲酸脫氨酶、D-乳酸脫氨酶或心乳酸脫氨 酶可W表達其活性的pH范圍內(nèi)，優(yōu)選抑值為7.0~8.5。反應(yīng)溫度優(yōu)選蘇氨酸脫水酶、甲酸脫 氨酶、D-乳酸脫氨酶或k乳酸脫氨酶可W表達其活性的溫度范圍內(nèi)，優(yōu)選20~40°C。
[0019] 本發(fā)明所述的催化劑是可W是全細胞、破菌液、粗酶及純酶。
【具體實施方式】
[0020] W下通過具體的實施例來進一步說明，其目的在于更好的理解
【發(fā)明內(nèi)容】
，但是運 些實施例不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
[0021] 實施實例1基因工程菌的培養(yǎng)和靜息細胞的制備 挑取平板上單菌落接種至5 ml含相應(yīng)抗生素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15 h左右作為種子 液，按照1%的接種量接種至含600 ml的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37°C，200 rpm的搖床上培養(yǎng)至 0〇6〇日=0