肺重；
[0040] 圖10所示的是本發(fā)明鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物抗肺癌實(shí)驗(yàn)小鼠平均凈體重 變化；
[0041] 圖11所示的是本發(fā)明鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物抗肺癌實(shí)驗(yàn)小鼠平均胸腺指 數(shù)；
[0042] 圖12所示的是本發(fā)明鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物抗肺癌實(shí)驗(yàn)小鼠平均脾指 數(shù)；
[0043] 圖13所示的是本發(fā)明鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物抗肺癌實(shí)驗(yàn)小鼠治療期間平 均體重；
[0044] 圖14所示的是本發(fā)明鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物抗肺癌實(shí)驗(yàn)小鼠治療期間平 均飲食量。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述。應(yīng)該指出，以下具體說(shuō)明都是例示 性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說(shuō)明。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ) 具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。
[0046] 1、原料、材料：
[0047] 三棱采摘自保定安國(guó)并經(jīng)過(guò)鑒定；A549細(xì)胞、Hep_G2細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液 病醫(yī)院提供。
[0048] 2、試劑：
[0049] 95 %乙醇?jí)蜃蕴旖蚴斜狈教灬t(yī)化學(xué)試劑廠；分析級(jí)甲醇購(gòu)自天津康科德科技有限 公司；色譜級(jí)乙酸乙酯購(gòu)自Honeywell公司；DMS0購(gòu)自Sigma公司；F-12K培養(yǎng)基購(gòu)自Life Technologies Corporation ;MEM 培養(yǎng)基貝勾自 Life Technologies Corporation。
[0050] 3、儀器設(shè)備：
[0051] 分析純水由密立博純水儀生產(chǎn)；超微粉碎機(jī)購(gòu)自山東三清不銹鋼設(shè)備有限公司； 臺(tái)式冷凍離心機(jī)購(gòu)自Thermo公司；恒溫鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)儀上海亞容生化儀器廠；C18反相硅膠色譜柱購(gòu)自博納艾吉爾有限公司；制備型高效 液相色譜儀購(gòu)自江蘇漢邦科技有限公司；細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀購(gòu)自艾森生物（杭州）有限公司； 細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自立德泰勅（上海）科學(xué)儀器有限公司。
[0052] 實(shí)施例1 :
[0053] 本實(shí)施例從三棱中提取鄰苯二甲酸二丁酯單體化合物的方法，包括以下步驟：
[0054] ⑴取干燥的三棱為原料，放入超微粉碎機(jī)中進(jìn)行超微粉碎，同時(shí)粉碎全過(guò)程用4°C 的水作為超微破碎機(jī)內(nèi)部冷卻液，超微粉碎時(shí)間為12min，得到超微粉。
[0055] ⑵取上述三棱超微粉3Kg，經(jīng)過(guò)三次乙酸乙酯提取，第一次提?。?kg超微粉加入 24L乙酸乙酯，提取70min，提取結(jié)束，25°C，6000rpm離心30min，收集殘?jiān)?。第二次提取：?一次殘?jiān)犹崛∪?2L乙酸乙酯，提取70min，提取結(jié)束，25°C，6000rpm離心30min，收集殘 渣。第三次提?。旱诙翁崛?jiān)尤?L乙酸乙酯，提取70min，提取結(jié)束，25°C，6000rpm 離心30min，收集殘?jiān)?，為粗品A。
[0056] 將粗品A干燥后，按料液比（g/ml)為1 : 8加入95%乙醇，充分混勻后72°C加熱 70min進(jìn)行提取，離心取沉淀，然后重復(fù)3次，將得到的上清合并，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮后轉(zhuǎn) 移至60°C恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥，得到粗品B。
[0057] ⑶將干燥至恒重的粗品B用流動(dòng)相（80%甲醇-水溶液）配制成25mg/mL的溶液， 溶解后過(guò)0. 45 μ m的有機(jī)濾膜，得到三棱小分子提取物的樣品溶液。
[0058] 所述樣品溶液進(jìn)行高壓制備液相色譜分離，采用的色譜柱為C18反相硅膠色譜 柱，硅球粒徑為10 μ m，色譜柱直徑為150_，柱長(zhǎng)為250_。采用A流動(dòng)相為純水、B流動(dòng)相 為甲醇的二元流動(dòng)相體系進(jìn)行固相萃取，進(jìn)樣量為3mL/針，流動(dòng)相流速為16mL/min，洗脫 方式為：20 %甲醇-水溶液洗脫5min、40 %甲醇-水溶液洗脫7min、80 %甲醇-水溶液洗脫 13min、100%甲醇洗脫5min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。液相色譜圖如圖1所示，收集21-22min洗 脫液（11號(hào)峰）作為目的組分，經(jīng)多功能膜分離系統(tǒng)濃縮后真空冷凍干燥，得到本發(fā)明目的 組分。
[0059] 將以上得到的目的組分（11號(hào)峰），進(jìn)行HPLC高效液相分析，如圖2所示，顯示其 純度達(dá)到99%以上，為單一化合物。
[0060] 將目的組分（11號(hào)峰）進(jìn)行NMR碳譜氫譜及MS分析，核磁譜圖如圖3-5所示，判 定該化合物為鄰苯二甲酸二丁酯。
[0061] 取本實(shí)施例得到的鄰苯二甲酸二丁酯化合物進(jìn)行以下實(shí)施例2~4腫瘤抑制試 驗(yàn)。
[0062] 實(shí)施例2 :抑制人肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的試驗(yàn)
[0063] 細(xì)胞培養(yǎng)：
[0064] 在5%C02,37°C，飽和濕度下，用F-12K(10%FBS+1%PS)培養(yǎng)基培養(yǎng)人肺癌A549 細(xì)胞，選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)后用培養(yǎng)基稀釋為一定濃度的細(xì)胞 懸液。
[0065] 細(xì)胞生長(zhǎng)情況監(jiān)測(cè)：
[0066] 將細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀放入5 % C02, 37°C飽和濕度培養(yǎng)箱中。取8孔板，每孔加入 150 μ L F-12K培養(yǎng)基，放入細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀中走基線，走完基線后取出八孔板，每孔加入稀 釋好的Α549細(xì)胞懸液345 μ L，至每孔細(xì)胞數(shù)約2 X 104個(gè)，靜置3min，在倒置顯微鏡下觀察 細(xì)胞是否均勻。每孔加入5 μ L稀釋好的藥物至終濃度為50 μ g/mL，含1 % DMS0的培養(yǎng)基 作為空白對(duì)照組，放入細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀中檢測(cè)，檢測(cè)完畢時(shí)拍照記錄。
[0067] 空白對(duì)照孔：不加藥物，加1 % DMS0 ;
[0068] 實(shí)驗(yàn)孔：加藥物（即發(fā)明目的產(chǎn)物鄰苯二甲酸二丁酯）。
[0069] 試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。
[0070] 結(jié)果表明：鄰苯二甲酸二丁酯在50 μ g/mL時(shí)對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制較強(qiáng)。
[0071 ] 實(shí)施例3 :抑制人肝癌Η印-G2細(xì)胞生長(zhǎng)的試驗(yàn)
[0072] 細(xì)胞培養(yǎng)：
[0073] 在5%C02,37°C，飽和濕度下，用MEM(10%FBS、1%PS)培養(yǎng)基培養(yǎng)人肺癌Η印-G2 細(xì)胞，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)后用培養(yǎng)基稀釋為一定濃度的細(xì) 胞懸液。
[0074] 細(xì)胞生長(zhǎng)情況監(jiān)測(cè)：
[0075] 將細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀放入5 % C02, 37°C飽和濕度培養(yǎng)箱中。取8孔板，每孔加入 150 μ LMEM培養(yǎng)基，放入細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀中走基線，走完基線后取出八孔板，每孔加入稀釋 好的Η印-G2細(xì)胞懸液345 μ L，至每孔細(xì)胞數(shù)約4X 104個(gè)，靜置3min，在倒置顯微鏡下觀 察細(xì)胞是否均勻。每孔加入5 μ L稀釋好的藥物至終濃度為所需藥物濃度50 μ g/mL，含1 % DMSO的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，放入細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀中檢測(cè)，檢測(cè)完畢時(shí)拍照記錄。
[0076] 空白對(duì)照孔：不加藥物，加入1 % DMS0 ;
[0077] 實(shí)驗(yàn)孔：加藥物（即發(fā)明目的產(chǎn)物鄰苯二甲酸二丁酯）。
[0078] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。
[0079] 結(jié)果表明：鄰苯二甲酸二丁酯在50 μ g/mL時(shí)能較好的抑制Hep_G2細(xì)胞生長(zhǎng)。
[0080] 實(shí)施例4 :
[0081] 1、藥品及試劑
[0082] lewis肺癌瘤株（第2代）、三棱提取物樣品（本發(fā)明目的產(chǎn)物鄰苯二甲酸二丁 酯）、環(huán)磷酰胺片（天津金世制藥有限公司，20130101)、吐溫80 (北京博潤(rùn)萊特科技有限公 司分裝）。
[0083] 2、試驗(yàn)動(dòng)物
[0084] C57BL/6小鼠（18~25g)(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK (京）2012-0001，合格證號(hào)： 11400700020779)
[0085] 3、器材及儀器
[0086] 注射器、無(wú)菌平皿、離心管、手術(shù)器械、超凈工作臺(tái)、組織勻漿器。
[0087] 4、實(shí)驗(yàn)步驟
[0088] 4. 1小鼠 Lewis肺癌荷瘤模型建立
[0089] 取接種腫瘤8-13天狀態(tài)良好的荷瘤脫臼處死，體表酒精消毒，在無(wú)菌（超凈臺(tái)） 環(huán)境下剝離小鼠腫瘤至盛有生理鹽水的無(wú)菌平皿，剪至小塊，將小塊腫瘤放入組織勻漿器， 按體積比1:3左右加入生理鹽水勻漿，勻漿液倒入50ml無(wú)菌離心管，備用。用lml注射器 在C57小鼠右腋下注射接種0. 2ml，腫瘤細(xì)胞混懸液的制備均在無(wú)菌條件下（超凈工作臺(tái) 中）完成。從取出腫瘤腹水至腫瘤接種完畢在60分鐘內(nèi)完成。
[0090] 4. 2藥物制備方法
[0091] 三棱提取物灌胃劑：稱定一定重量的三棱提取物樣品至離心管中，加入所需溶劑 體積2%吐溫-80,渦旋混合后再加入所需體積的生理鹽水，混勻后，備用。
[0092] 環(huán)磷酰胺灌胃劑：去掉環(huán)磷酰胺片的薄膜衣后進(jìn)行稱取，稱取一定重量至研缽中， 加入所需體積的生理