一種D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacB基因及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 發(fā)明設(shè)及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明設(shè)及一種D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶dacB 及其基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 膚聚糖是由雙糖單位，四膚尾還有膚橋聚合而成得多層網(wǎng)狀大分子結(jié)構(gòu)。膚聚糖 層的骨架由N-乙酷葡萄糖胺和N-乙酷胞壁酸通過β-1，4糖巧鍵連接而成，糖鏈間由膚鏈交 聯(lián)，構(gòu)成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，運樣構(gòu)成了整個細(xì)菌表面的細(xì)胞壁。作為細(xì)胞壁的主要成分，膚 聚糖的組成與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性、外膜的通透性的維持、細(xì)菌的抗干燥能力和耐熱性等均 密切相關(guān)。dacB基因表達的D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶能夠從膚聚糖五膚上移除最后一個 末端D-Ala，導(dǎo)致轉(zhuǎn)膚反應(yīng)中供體不可用，可W控制膚聚糖的網(wǎng)狀交聯(lián)水平，從而改變細(xì)胞 的通透性。
[0003] 大腸桿菌化schericMa coli)表達系統(tǒng)是目前基因工程中最常用的蛋白表達系 統(tǒng)，有操作簡單、成本低廉等優(yōu)點，可W快速大規(guī)模地生產(chǎn)目的蛋白。但是在E.coli的表達 過程中，大部分蛋白在信號膚的引導(dǎo)下分泌到周質(zhì)空間，會導(dǎo)致中間體大量積聚，對蛋白質(zhì) 的生產(chǎn)造成阻礙。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種可W提高E.coli胞外分泌水平的D-丙氨酷-D-丙氨酸簇 膚酶、其氨基酸序列、編碼該D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶的基因、含有該基因的重組質(zhì)粒、含 有該重組載體的重組菌株、該D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶的應(yīng)用。
[0005] 具體包括：
[0006] 本發(fā)明提供了一種D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶dacB，其氨基酸序列如序列1所示。
[0007] 序列 1:
[000引 MRFSRFII化TSCIAFSVQAANVDEYVT化PAGANLALMVQKVGASAPAIDYHSQQMALPASTQKVITALAALIQLG PDFRFTTTLETKGNVENG化KGDLVARFGADPTLKRQDIRNMVATL邸SGVNQIDGNVLIDTSIFA甜DKAPGWPWN DMTQCFSAPPAAAIVDRNCFSV化YSAQKPGDMAFIRVASYYPVTMFSQVR化PRGSAEAQYCEUWVPGDLNRFTL TG化PQRSEP…LAFAVQDGASYAGAIL邸ELKQAGITWSGTLLRQTQVNEPGTVVASKQSAPLHDLLKIMLKKSDN MIADTVFRMIGHARFNVPGTWRAGSDAVRQILRQQAGVDIGNTIIADGSGLSRHNLIAPATMMQVLQYIAQ 皿肥 LN FISMLPLAGYDG化QYRAGL冊AGVDGKVSAKTG化QGVY化AGFITTASGQRMAFVQ化SGYAVEPADQRNRRIPL VRFESRLYKDIYQNN
[0009] 其中，該酶基因編碼477個氨基酸，其理論分子量為51.8化化。
[0010] 本發(fā)明提供了編碼上述D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶的基因 dacB，具體的，該酶的基 因序列如序列2所示。
[00川序列2:
[0012]
[0013] 本發(fā)明通過PCR方法克隆了 D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶基因 dacB，DNA全序列分析 結(jié)果表明，D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶的編碼基因 dacB全長1434bp。
[0014] 將上述D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶基因 dacB序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列在 GenBank中進行BLAST比對，該基因與來源于E.coli str.K-12 substr.MG1655的D-丙氨酷- D-丙氨酸簇膚酶序列相似性最高(99% )。
[0015] 本發(fā)明還提供了包含上述D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶基因 dacB的重組質(zhì)粒，為 pRSFDuet-dacB。將本發(fā)明的D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶基因插入至表達載體相應(yīng)的限制酶 切位點，使其核巧酸序列與表達調(diào)控序列相連接，作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選實驗方案，優(yōu)選 D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶基因插入到質(zhì)粒pRS抑uet，使該核巧酸序列位于T71ac啟動子的 下游并受其調(diào)控，得到重組E.coli表達質(zhì)粒pRS抑uet-dacB。
[0016] 本發(fā)明還提供了上述D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶基因 dacB的應(yīng)用菌株，優(yōu)選所述 菌株為E.coli。
[0017] 本發(fā)明能夠增強E.coli胞內(nèi)蛋白到達胞外，促進其分泌，降低其在胞內(nèi)積累，提供 一種可提高E.coli蛋白胞外分泌水平的D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶、及其氨基酸序列、基因 序列。
【附圖說明】
[0018] 圖1為D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶重組質(zhì)粒pRS抑uet-dacB圖譜。
[0019] 圖2為D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶的過量表達
[0020] 圖3為過量表達D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶對E.coli胞外分泌α-半乳糖巧酶的影 響。
【具體實施方式】
[0021] 實施例l:E.coli BL21(DE3)D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶基因 dacB的克隆
[0022] 基于PCR獲得D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶dacB的DNA序列，將D-丙氨酷-D-丙氨酸簇 膚酶的基因片段與表達載體pRS抑uet連接，獲得重組質(zhì)粒pRS抑uet-dacB(圖1)。然后轉(zhuǎn)化 到E.coli BL2UDE3)感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組菌株E.coli BL21(DE3)/dacB。
[0023] 實施例2: D-丙氨酷-D-丙氨酸簇膚酶酶活
[0024] 將已構(gòu)建的重組菌，接種250mL搖瓶培養(yǎng)，經(jīng)誘導(dǎo)劑（IPTG)誘導(dǎo)后，收集E. coli細(xì) 胞，采用超聲破碎法破壁細(xì)胞。高速離屯、后，收集破壁上清，取樣測定破壁上清中的簇膚酶 酶活力。通過測定酶活力計算出過量表達后，簇膚酶dacB- Δ P在胞內(nèi)的比酶活力為2.65U/g (圖2)，對照組簇膚酶比酶活力僅為1.51U/g。
[0025] 實施例3:過量表達dacB對E.coli胞外分泌α-半乳糖巧酶的影響
[0026] 在Ε. col i中過量表達簇膚酶dacB時，誘導(dǎo)lOh后，Ε. col i胞外分泌α-半乳糖巧酶的 水平顯著提高，胞外α-半乳糖巧酶酶活力達到6.80U/g(圖3)。但沒有過量表達任何簇膚酶 的對照菌株誘導(dǎo)發(fā)酵lOh后，在E.coli胞外測得的α-半乳糖巧酶的酶活力僅為1.82U/g。
【主權(quán)項】
1. 一種D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacB，其特征在于：由序列1所示氨基酸序列組成的 蛋白質(zhì)。2. -種D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacB，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的D-丙 氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacB。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacB，其特征在于:其DNA序列如 序列2所示。4. 包含權(quán)利要求2或3所述的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因 dacB的重組質(zhì)粒。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述載體為pRSFDuet。
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，一種D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacB基因及應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種來源于大腸桿菌(Escherichia？coli)BL21(DE3)的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacB，其氨基酸序列如序列1所示，且本發(fā)明提供了編碼上述dacB的編碼基因dacB。本發(fā)明的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶能夠從肽聚糖五肽上移除最后一個末端D-丙氨酸(D-Ala)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)肽反應(yīng)中供體不可用，從而控制肽聚糖的網(wǎng)狀交聯(lián)水平，可以提高E.coli蛋白胞外分泌水平。
【IPC分類】C12N15/57, C12N15/70, C12N9/48
【公開號】CN105671025
【申請?zhí)枴緾N201610123619
【發(fā)明人】許菲, 楊海泉, 胡金遠(yuǎn), 強書敏, 沈微, 陳獻忠, 鄭虹寧, 寧璐璐
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2016年6月15日
【申請日】2016年3月4日