一種委陵菜屬植物提取物及從中分離四種單寧類化合物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及天然藥物領(lǐng)域，具體設(shè)及從委陵菜屬植物小葉金露梅提取物，W及從 該提取物中分離制備原花青素 B3、原花青素 B6、原花青素 B7和2,3,4,6-四-0-沒(méi)食子酷葡萄 糖的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有研究表明，委陵菜屬的多種植物均為藥用植物，具有抗炎，抗糖尿病，抗腫瘤 等作用;且單寧類化合物為該屬植物的重要成分。單寧類活性物質(zhì)分為兩類:即縮合型單寧 (其中包括原花青素)和水解型單寧，它們具有抗炎、抗氧化、促進(jìn)傷口愈合、抗菌、抗病毒等 作用。
[0003] 小葉金露梅(Potentilla parvifolia Fisch.)是委陵菜屬植物中的一種，具體是 菩薇科委陵菜屬落葉灌木，又名小葉金老梅等。其作為一種傳統(tǒng)的中藏藥，W花、葉入藥。 《中藥大辭典》中記載小葉金老梅功能主治:利尿消水，治寒濕腳氣，癢疹，乳腺炎。
[0004] 目前，未見(jiàn)有富集單寧類物質(zhì)的小葉金露梅提取物W及從小葉金露梅中分離制備 得到單寧類化合物的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種委陵菜屬植物小葉金露梅提取物，其含有不 低于6%w/w的原花青素 B7或/和不低于4%w/w的2,3,4,6-四-0-沒(méi)食子酷葡萄糖。上述兩種 物質(zhì)均為首次從委陵菜屬中發(fā)現(xiàn)。
[0006] 進(jìn)一步地，所述提取物還含有不低于14%w/w原花青素 B3和不低于7%w/w的原花 青素 B6。
[0007] 原花青素 B3(I)、原花青素 B6(n)、原花青素 B7(虹）和2,3,4,6-四-0-沒(méi)食子酷葡 萄糖(IV)的結(jié)構(gòu)如下所示：
[000引
[0009] 進(jìn)一步地，所述提取物含有15~16 % w/w的原花青素 B3,8~9 % w/w的原花青素 B6， 7~8 % w/w的原花青素 B7和5~6 % w/w的2,3,4,6-四-0-沒(méi)食子酷葡萄糖。
[0010]進(jìn)一步地，所述2，3，4，6-四-0-沒(méi)食子酷葡萄糖中，a-型2，3，4，6-四-0-沒(méi)食子酷 葡萄糖與e-型2，3，4，6-四-O-沒(méi)食子酷葡萄糖的摩爾比為3:1。
[0011 ] 進(jìn)一步地，所述提取物是小葉金露梅化tentilla parvifolia Fisch.地上部分的 提取物。所述地上部分為所有地上部分，包括莖、葉、花。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種制備所述小葉金露梅提取物的方法，其特征在于:包括W下 步驟：
[0013] (1)制備小葉金露梅醇粗提物:取小葉金露梅，切割或粉碎，醇提取，濃縮得到小葉 金露梅醇粗提物；
[0014] (2)制備小葉金露梅醇粗提物的乙酸乙醋萃取部分：取步驟（1)制備得到醇粗提 物，石油酸萃取，取剩余液體，乙酸乙醋萃取，得到小葉金露梅醇粗提物的乙酸乙醋萃取部 分；
[0015] (3)制備富集所述四種單寧類化合物的濃縮物：W硅膠柱色譜分離步驟(2)制備得 到的乙酸乙醋萃取部分，W石油酸-乙酸乙醋體積比100:0~0:100梯度洗脫，收集石油酸-乙酸乙醋體積比1:1~0:100的流分，濃縮即得;優(yōu)選0:100的流分，即純乙酸乙醋洗脫下的 流分。
[0016] 進(jìn)一步地，步驟（1)中，所述醇是60%-90%的乙醇，優(yōu)選70%乙醇；所述提取的溫 度是60°C ;提取的次數(shù)是3次;每次提取時(shí)，醇與小葉金露梅的體積質(zhì)量比為30:6.5L/Kg;
[0017] 進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述石油酸的萃取次數(shù)為2~10次，每次萃取時(shí)，與醇粗提 物的體積比為1:8;所述乙酸乙醋的萃取次數(shù)為2~10次，每次萃取時(shí)，與醇粗提物的體積比 為 1:10。
[0018] 進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述梯度洗脫是依次W石油酸-乙酸乙醋的體積比為100: 1、50:1、10:1、1:1、2:3的洗脫液和乙酸乙醋洗脫液（即石油酸-乙酸乙醋的體積比0:100)進(jìn) 行的梯度洗脫。
[0019] 進(jìn)一步地，步驟(3)中，所述石油酸-乙酸乙醋的體積比為100:1、50:1、10:1、1:1、 2:3的洗脫液和乙酸乙醋洗脫液與小葉金露梅的體積質(zhì)量比依次為3 :6.5、4:6.5、6:6.5、 10:6.5、10.5:6.5和11.5:6.5171(邑。
[0020] 進(jìn)一步地，前述小葉金露梅提取物是由前述的方法制備得到的。
[0021] 本發(fā)明還提供了從前述小葉金露梅提取物中分離制備四種單寧類化合物的方法， 所述四種單寧類化合物為原花青素 B3、原花青素 B6、原花青素 B7和2,3,4,6-四-0-沒(méi)食子酷 葡萄糖，包括W下步驟：
[0022] 利用高速逆流色譜法分離制備四種單寧類化合物：
[0023] (a)取前述小葉金露梅提取物溶于進(jìn)樣溶劑中，制備得到進(jìn)樣溶液；
[0024] (b)將進(jìn)樣溶液注入高速逆流色譜儀，檢測(cè)收集原花青素 B3、原花青素 B6、原花青 素 B7和2,3,4,6-四-0-沒(méi)食子酷葡萄糖的流分，除去溶劑，即得原花青素 B3、原花青素 B6、原 花青素 B7和2，3，4，6-四-0-沒(méi)食子酷葡萄糖的產(chǎn)品；
[0025] 所述高速逆流色譜法的固定相為兩相溶劑體系的上相，流動(dòng)相為兩相溶劑體系的 下相;所述兩相溶劑體系由正己燒-乙酸乙醋-甲醇-水=(0.8~1.2): (10.8~11.2): (1~ 1.4):(10.8~11.2)(乂八)組成，優(yōu)選的比例為1:11:1.2:11(乂八）。
[0026] 進(jìn)一步地，所述進(jìn)樣溶劑是由所述上相和下相按照1:1的體積比組成的溶劑;所述 進(jìn)樣溶劑與提取物的體積質(zhì)量比為1:15~1:30mL/mg。
[0027] 進(jìn)一步地，所述高速逆流色譜儀中分離管的轉(zhuǎn)速為900 ±50rpm。
[0028] 進(jìn)一步地，所述高速逆流色譜儀中分離管的溫度設(shè)置為30±5°C。
[00巧]進(jìn)一步地，所述流動(dòng)相的流速為1.2±0.3mL/min。
[0030] 進(jìn)一步地，所述檢測(cè)的波長(zhǎng)為270 ±5nm。
[0031] 本發(fā)明還提供了一種分離制備原花青素 B3、原花青素 B6、原花青素 B7和2,3,4,6-四-0-沒(méi)食子酷葡萄糖的方法，包括W下步驟：
[0032] 取含有原花青素 B3、原花青素 B6、原花青素 B7和2,3,4,6-四-0-沒(méi)食子酷葡萄糖的 溶液或提取物，按照前述的高速逆流色譜法進(jìn)行。
[0033] 本發(fā)明還提供了所述提取物在制備抗炎、抗氧化、促進(jìn)傷口愈合、抗菌、抗病毒、利 尿、消水腫、治寒濕腳氣、治療癢疹或治療乳腺炎藥物中的用途。
[0034] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它是所述的小葉金露梅提取物為活性成分，加 上藥學(xué)上常用的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。
[0035] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了含有原花青素 B7與2,3,4,6-四-0-沒(méi)食子酷葡萄糖的委陵菜屬 植物提取物。
[0036] 本發(fā)明制備的小葉金露梅提取物，富集多種單寧類物質(zhì)，該提取物中的原花青素 B3的含量高達(dá)15~16%w/w;原花青素 B6的含量高達(dá)8~9%w/w;原花青素 B7的含量高達(dá)7~ 8%w/w;2,3,4,6-四-0-沒(méi)食子酷葡萄糖的含量高達(dá)5~6%w/w。該提取物可用于抗炎、抗氧 化、促進(jìn)傷口愈合、抗菌、抗病毒、利尿、消水腫、治寒濕腳氣、治療癢疹或治療乳腺炎。
[0037] 同時(shí)，本發(fā)明提供的方法，首次從小葉金露梅中分離制備得到了高純度的原花青 素 B3、原花青素 B6、原花青素 B7和2,3,4,6-四-0-沒(méi)食子酷葡萄糖，它們的純度依次為 98.3 %，97.2 %，99.0 %和95.2 %。上述四個(gè)單寧類化合物為首次從小葉金露梅植物中發(fā) 現(xiàn)，且原花青素 B7與2,3,4,6-四-0-沒(méi)食子酷葡萄糖為首次從委陵菜屬中發(fā)現(xiàn)，極大地?cái)U(kuò)展 了運(yùn)些化合物植物原料的選擇范圍。
[003引并且，本發(fā)明采用的高速逆流色譜法（high-speed couter-current C虹omatography，HSCCC)，是一種不使用固態(tài)支撐體或載體的液液分配色譜技術(shù)，其克服了 固相載體對(duì)樣品的吸附而產(chǎn)生的損失、變性等缺點(diǎn)，具有在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效制備性分離 的優(yōu)點(diǎn)。該方法具有重復(fù)性好、產(chǎn)品純度高、制備量大的優(yōu)點(diǎn)，適用于從各種含有上述四種 化合物的天然產(chǎn)物中制備高純度單體，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0039] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可W做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0040] W下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于W下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說(shuō)明】
[0041 ]圖1為溶劑體系正己燒-乙酸乙醋-甲醇-水=1:11:1.2:11時(shí)，小葉金露梅提取物 的高速逆流色譜圖。
[0042]圖2中，（a)為本發(fā)明小葉金露梅提取物的高效液相色譜圖，（b)~(e)依次為化合 物I~IV的高效液相色譜圖。
[0043] 圖3為原花青素 B3(I)、原花青素 B6(n)、原花青素 B7(in)和2,3,4,6-四-0-沒(méi)食子 酷葡萄糖(IV)的紫外光譜。
[0044] 圖4為實(shí)施例2中石油酸:乙酸乙醋= l:l(v/v)的洗脫液部分的高效液相色譜圖。
[0045] 圖5為實(shí)施例2石油酸:乙酸乙醋= 2:3(v/v)的洗脫液部分的高效液相色譜圖。
[0046] 圖6為溶劑體系正己燒-乙酸乙醋-甲醇-水=1:10:1:10時(shí)，小葉金露梅提取物的 高速逆流色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0047] 本發(fā)明所用藥材為小葉金露梅(Potentilla parvifolia Fisch.)的干燥地上部 分，于2014年8月采于青海省海北州。植物物種由中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所的張發(fā)起 博