出來的核巧酸序列，經(jīng)電泳檢測測序后，與區(qū)分高梁 芒的有無。 所述引物對的核巧酸序列如下所示：
上游引物： 下游引物： 所述的控制高梁芒的有無基因 SbAn-I鑒定方法，包含W下步驟： (1) 通過常規(guī)PCR法擴增，獲得高梁有芒無芒基因 SbAn-I基因序列； (2) 利用多序列比對軟件工具(如MegAl i gn或DNAMAN軟件），將步驟(1)所獲得的序列翻 譯成蛋白質(zhì)序列后進行比對，得到高梁有芒無芒基因 SbAn-I所特異的3處單堿基差異，該差 異位于該基因的外顯子，最終導(dǎo)致功能特異性氨基酸的改變； (3) 對步驟(2)所獲得的序列在不同的高梁自然群體中進行驗證，從而確定高梁芒的有 無基因 SbAn-I的功能。經(jīng)測定有芒樣品236份和無芒高梁樣品182份，有芒和無芒的基因序 列=個位點發(fā)生突變從而區(qū)分高梁種質(zhì)的有芒或無芒，該基因的功能正確率達72% W上。 為了進一步證實該基因 SbAn-I為控制芒的有無基因，利用有芒L361和無芒BTx623的Fi表型 為無芒，雜交后代F2代高梁株系，867株F2單株中，無芒為654株，有芒213株，卡方檢驗表明， F2群體中無芒與有芒單株數(shù)量符合3:1分離模型。從Fi單株表型和F2群體的表型分離情況可 W判定，本研究中雙親芒性受一核質(zhì)單基因控制，且無芒對有芒為顯性。該訊An-I基因在運 些F2群體中所有654株的該基因 S個突變位點SNP為雜合(TC，AG，CT)或未突變(T，G，C)，213 株有芒樣品全部為純合的（C，A，T)。因此，我們確定該基因 SbAn-I即為控制芒的有無的功 能。圖 4注釋:BTx623，9-5，L180 為無芒，L361，L007，8-10 位有芒。

上游引物： 退火溫度69.8 下游引物： 退火溫度67.4 所述訊An-1的PCR擴增反應(yīng)體系如下：高梁基因組DNA Iul,上下游引物各Iul，2X化q PCR Master Mix 12.5ul，d加20 9.5ul 總體積 25ul;反應(yīng)在BIO-RAD TlOOTM Thermal 巧cler PCR儀進行擴增，反應(yīng)流程如下:94°C預(yù)變性3分種;94°C 30秒、55 °C 30秒、72°C 50秒， 34個循環(huán);72 °C 5分種;4 °C保存。
【主權(quán)項】
1. 一種控制高粱芒的有無基因 SbAn-1，其特征在于:所述核苷酸序列為SEQ NO. 1: ATGTTGCGGTATTGGTAAGAAGACCGATTTATATACATATAATGATTAAAAAAATATAATGTGAATATTTCCC TCAGCAACTAAAATATATAATTTGGATATATATACAGAGGGACAAAAGACTGATATTTTCCCGACAAGCTGTATATT TAACAATTAGAAAGACGAATAAAATGTAGGGCCACAATTTTTTGTTTTATATTTATGGAATCATTAACATGTATGGT ATGGTGTGGTGGACAACTTCAGTTGCCCTACCTCTTGACATAACATGGTACACTTTTTTTGAGAGAACCAAGAAAGT TCAAGGAACAAGTCAAAAAAGCCTTTGTGTGTCTCTATGCGTAAACAAGGCTTACCTTCACTTCAAAACAGTCGGAA TTGAAGATAGCTTTGTGTCCTAAGCATGAGGCTATATAGCCTGTGGAGGTTTTGCCCAATCAAGACAGCCTCAACCC CAAAGCCACTCTATGGCATCAAGTTCAACCACACAGGATGCCAACAATGGTGTTAGGCATGACAACAACCTCCTGCC CATTGCCAACGTTGGGCGGATCATGAAGGATGCCCTCCCTCCACAGGCCAAGATTTCAAAGCATGCTAAGGAGACCA TCCAGGAGTGTGCAACTGAGTTTGTGGGCTTCGTCACTGGCGAGGCCTCCGAGCGGTGCCGCCGAGAGCGGCGGAAG ACCATCAACGGTGATGACATCTGTCATGCTATGAGGAGCCTTGGCCTCGACCACTACGCCGACTCCATGCACAGGTA CCTGCAGAGGTATCGCGAGACTGAGGAGCTAGCGGCAACACTCAACAACGGCGGCGGCGGCCGTGATGGACGGGCCA TTCAGATTGATGTGAGGGCTGAGCTGTCCATTTTCAAGGGCAGCAACCAGCAAGATGGTAGAGACTAA〇2. -種控制高粱芒的有無基因 SbAn-1，其特征在于:有芒高粱該基因發(fā)生三個位點的 突變，第一個點72367561，T突變?yōu)镃即TTT(苯丙氨酸)突變?yōu)門TC(苯丙氨酸)為同義突變，另 外兩個位點發(fā)生了非同義突變，非同義突變SNP位點位于高粱基因組3號染色體第72367415 位核苷酸和72367368位核苷酸，該兩個位點核苷酸分別由G突變?yōu)锳，C突變?yōu)棣?，氨基酸分別 都由精氨酸(Arg/R)突變?yōu)榻M氨酸(His/H)和半胱氨酸(Cys/C)。3. -種控制高粱有芒或無芒的SbAn-1基因的檢測方法，其特征在于：由引物對 Sb03g045130F和Sb03g045130R從高粱基因組DNA中擴增出來的核苷酸序列，經(jīng)電泳檢測測 序后，與區(qū)分高粱芒的有無;所述引物對的核苷酸序列如下所示： 上游引物：Sb03g045130F ATGGCATCAAGTTCAACCACACA 下游引物：Sb03g045130R TTAGTCTCTACCATCTTGCTGGTTG。4. 如權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于:所述的控制高粱芒的有無基因 SbAn-Ι鑒 定方法，包含以下步驟： (1) 通過常規(guī)PCR法擴增，獲得高粱有芒無芒基因 SbAn-Ι基因序列； (2) 利用多序列比對軟件工具(如MegAlign或DNAMAN軟件），將步驟（1)所獲得的序列翻 譯成蛋白質(zhì)序列后進行比對，得到高粱有芒無芒基因 SbAn-Ι所特異的3處單堿基差異，該差 異位于該基因的外顯子，最終導(dǎo)致功能特異性氨基酸的改變； (3) 對步驟(2)所獲得的序列在不同的高粱自然群體中進行驗證，從而確定高粱芒的有 無基因 SbAn-Ι的功能。經(jīng)測定有芒樣品236份和無芒高粱樣品182份，有芒和無芒的基因序 列三個位點發(fā)生突變從而區(qū)分高粱種質(zhì)的有芒或無芒，該基因的功能正確率達72%以上。 為了進一步證實該基因 SbAn-Ι為控制芒的有無基因，利用有芒L361和無芒^^623的？!表型 為無芒，雜交后代F2代高粱株系，867株F 2單株中，無芒為654株，有芒213株，卡方檢驗表明， F2群體中無芒與有芒單株數(shù)量符合3:1分離模型。從h單株表型和內(nèi)群體的表型分離情況可 以判定，本研究中雙親芒性受一核質(zhì)單基因控制，且無芒對有芒為顯性。該SbAn-Ι基因在這 些卩 2群體中所有654株的該基因三個突變位點SNP為雜合(TC，AG，CT)或未突變(T，G，C)，213 株有芒樣品全部為純合的（C，A，T)。因此，我們確定該基因 SbAn-1即為控制芒的有無的功 能。5. 如權(quán)利要求3或4所述的檢測方法，其特征在于:所述SbAn-1的PCR擴增反應(yīng)體系如 下：高粱基因組DNA lul,上下游引物各lul，2XTaq PCR Master Mix 12.5ul，ddH20 9.5ul 總體積25ul;反應(yīng)在BIO-RAD T100? Thermal cycler PCR儀進行擴增，反應(yīng)流程如下：94°C 預(yù)變性3分種;94 °C 30秒、55 °C 30秒、72 °C 50秒，34個循環(huán);72 °C 5分種;4 °C保存。6. -種控制高粱芒的有無基因 SbAn-Ι的應(yīng)用，其特征在于:包括對高粱種質(zhì)資源的篩 選和鑒定，以及作為分子標(biāo)記輔助育種。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種控制高粱有芒無芒基因SbAn-1的功能，屬于分子生物學(xué)和高粱育種領(lǐng)域，本發(fā)明的控制高粱有無基因SbAn-1是通過全基因組關(guān)聯(lián)分析所獲得，該技術(shù)能夠一次性檢測到多個核苷酸多態(tài)位點，從而有利于大批量地挖掘與簡單性狀的基因。選擇基因以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，可以直接用于高粱芒的有無基因SbAn-1及其等位基因的鑒別，從而實現(xiàn)分子標(biāo)記輔助育種。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105603072
【申請?zhí)枴緾N201610046318
【發(fā)明人】陸曉春, 白春明, 劉軼飛, 王春語, 叢玲, 朱振興, 王平, 張麗霞, 李丹, 鄭文靜, 李金紅, 陶承光, 鄒劍秋
【申請人】遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2016年1月22日