一種快速診斷結(jié)核病潛伏感染的引物及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及采用分子生物學(xué)快速檢測的技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種qRT-PCR技術(shù)快 速診斷結(jié)核病潛伏感染的引物及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來結(jié)核病疫情呈加重蔓延之勢，其發(fā)病和死亡人數(shù)均居甲、乙兩類傳染病之 首，給個人、家庭、社會造成了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)和精神壓力。世界上約1/^3的人感染了結(jié)核分 枝桿菌，其中約90%的人呈結(jié)核潛伏感染狀態(tài)（latent TB infection，LTBI)。大多數(shù)活動 性結(jié)核都是因為潛伏感染者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌重新激活所致，所W及早診斷、早治療潛伏 感染者是降低結(jié)核病發(fā)病率，控制結(jié)核分枝桿菌傳播的重要途徑之一。
[0003] 結(jié)核潛伏感染者因其沒有臨床癥狀和體征，診斷比較困難。目前用于診斷結(jié)核潛 伏感染的方法，是干擾素丫釋放實驗（interferon gamma release assays,IGRAs)，但 IGRAs無法區(qū)分活動性結(jié)核患者和結(jié)核潛伏感染者。結(jié)核潛伏感染者常被看成一種感染但 是并未發(fā)病的人群，但不同的結(jié)核潛伏感染者對結(jié)核分歧桿菌感染的免疫應(yīng)答能力并不完 全相同，活動性結(jié)核患者也有類似的特征。為了能夠快速、準(zhǔn)確篩查結(jié)核潛伏感染者，本發(fā) 明采用qRT-PCR技術(shù)設(shè)計獨特的、對結(jié)核分歧桿菌具有良好敏感性、特異性的引物和試劑 盒，對實現(xiàn)微量外周血快速診斷結(jié)核潛伏感染提供有效的輔助作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種用于結(jié)核病潛伏感染檢測的引物及試劑盒。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案，qRT-PCR技術(shù)快速診斷結(jié)核病潛伏感染的引物，包括如下引物 中的至少一組引物：
[0006] 第一組：<210〉1，<210〉2。
[0007] 第二組：<210〉3，<210〉4。
[000引 第Ξ組：<210〉5，<210〉6。
[0009] qRT-PCR技術(shù)快速診斷結(jié)核病潛伏感染的試劑盒，其組成成分包括:SYBR酶、cDNA 和下列引物引物中的至少一組：
[0010] 第一組：<210〉1，<210〉2。
[0011] 第二組：<210〉3，<210〉4。
[0012] 第Ξ組：<210〉5，<210〉6。
[0013] 結(jié)核潛伏感染者的靜脈血經(jīng)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后TNF-a、IFN-r、比-2 的 mRNA 表達(dá)水平 2.5-4.1、8.1-13.2、184.2-220.6。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明引物和試劑盒根據(jù)結(jié)核分歧桿菌的特異基因序列而定， 尋找具有易于預(yù)測的、檢測的、發(fā)展價值的TNF-a、IFN-丫、比-2因子，其在結(jié)核病患者、結(jié)核 潛伏感染者和健康人中的mRNA表達(dá)水平，特異性、敏感性高，而且用血量少、用時短等特點， 利用巧光定量PCR方法、使用本發(fā)明引物和試劑盒進(jìn)行檢測時，只需40化1外周靜脈血，有利 于用于篩查老年人及兒童結(jié)核分枝桿菌潛伏感染，整個過程耗時小于8小時。本發(fā)明對于結(jié) 核病潛伏感染檢測及臨床用藥都有較高的參考價值，可W廣泛推廣，為結(jié)核病防控工作提 供技術(shù)支持。
【具體實施方式】
[0015] 為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實施例對 本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0016] W下實施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能W此來限制本發(fā)明 的保護范圍。
[0017]實施例1 [001引檢測方法：
[0019] (1)采集受試者(潛伏感染者)外周靜脈血:肝素鋼抗凝處理，所有血樣，一經(jīng)采集， 立即送檢。取40化1分為兩份，每份20化1。一份加入合成的特異性抗原化SAT-6、CFP-10、 TB7.7)，使其終濃度均達(dá)到20μg/ml，另一份不加任何抗原刺激物作為對照組，是基礎(chǔ)分泌 水平值，兩份血樣幹旋震蕩后，放入37 °C溫箱解育4小時。
[0020] (2)血總RNA的提取:血樣解育4小時后，用RNeasy Mini Kit(Qiagen)試劑盒按說 明書逐步提取總RNA。為減少RNA降解，離屯、機溫度設(shè)定為4°C，所有操作在冰袋上進(jìn)行，并根 據(jù)核酸蛋白檢測儀檢測D260/280紫外吸收率，確定RNA純度，瓊脂糖凝膠電泳觀察其完整 性。
[002。 （ 3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：首先冰上預(yù)冷無酶PCR管，吸取RNA 5yg RNA，嚴(yán)格按照試劑盒 (TIANScript RT Kit-TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒)說明書，逐步逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 逆轉(zhuǎn)錄總體系為20μ1，比例為化 1 oligo(dT)15,2yl Super Pure dNTPs，5.5yl 腳ase- 化ee dd 肥0,4μ1 5 XFirst-Strand Buffer，0.扣 1 RNasinayl TIANScript M-MLV。因檢 測因子較多，逆轉(zhuǎn)錄完成后，將cDNA用無酶水稀釋到50μ1，混勻，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0022] (4)巧光定量PCR檢測:選用ABI公司的SYBR酶，反應(yīng)體系為SOiiUSYBR 10化，肥0 6 化，上游引物化L，下游引物化L，cDNA化L，用β-actin做內(nèi)參。使用ABI公司的750(Fast巧光 定量檢測儀，40個循環(huán)，參數(shù)如下：50 °C lmin20s; 95 °C lOmin; 95 °C 15s; 60 °C Imin，溶解曲線 參數(shù):95°C15s;60°Clmin 95°C30s;60°C15s。檢測細(xì)胞因子的量= 2-Δ Act(A ACt=ACt 蛋白刺激組-A Ct空白對照組）。
[0023] 實施例2
[0024] 檢測方法：
[0025] (1)采集受試者(健康者)外周靜脈血:肝素鋼抗凝處理，所有血樣，一經(jīng)采集，立即 送檢。取40化1分為兩份，每份20化1。一份加入合成的特異性抗原巧SAT-6、CFP-10、TB7.7)， 使其終濃度均達(dá)到20μg/ml，另一份不加任何抗原刺激物作為對照組，是基礎(chǔ)分泌水平值， 兩份血樣幹旋震蕩后，放入37°C溫箱解育4小時。
[0026] (2)血總RNA的提取:血樣解育4小時后，用RNeasy Mini Kit(Qiagen)試劑盒按說 明書逐步提取總RNA。為減少RNA降解，離屯、機溫度設(shè)定為4°C，所有操作在冰袋上進(jìn)行，并根 據(jù)核酸蛋白檢測儀檢測D260/280紫外吸收率，確定RNA純度，瓊脂糖凝膠電泳觀察其完整 性。
[0027] (3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：首先冰上預(yù)冷無酶PCR管，吸取RNA扣g RNA，嚴(yán)格按照試劑盒 (TIANScript RT Kit-TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒)說明書，逐步逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 逆轉(zhuǎn)錄總體系為20μ1，比例為化 1 oligo(dT)15,2yl Super Pure dNTPs，5.5yl 腳ase- 化ee dd 肥0,4μ1 5 XFirst-Strand Buffer，0.扣 1 RNasinayl TIANScript M-MLV。因檢 測因子較多，逆轉(zhuǎn)錄完成后，將cDNA用無酶水稀釋到50μ1，混勻，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[002引 （4)巧光定量PCR檢測:選用ABI公司的SYBR酶，反應(yīng)體系為20化，SYBR 10化，肥0 6 化，上游引物化L，下游引物化L，cDNA化L，用β-actin做內(nèi)參。使用ABI公司的750(Fast巧光 定量檢測儀，40個循環(huán)，參數(shù)如下：50 °C lmin20s; 95 °C lOmin; 95 °C 15s; 60 °C Imin，溶解曲線 參數(shù):95°C15s;60°Clmin 95°C30s;60°C15s。檢測細(xì)胞因子的量= 2-Δ Act(A ACt=ACt 蛋白刺激組-A Ct空白對照組）。
[0029] 實施例3
[0030] 檢測方法：
[0031] (1)采集受試者(活動性肺結(jié)核患者)外周靜脈血:肝素鋼抗凝處理，所有血樣，一 經(jīng)采集，立即送檢。取40化1分為兩份，每份200μ1。一份加入合成的特異性抗原化SAT-6、 CFP-10、ΤΒ7.7)，使其終濃度均達(dá)到20μg/ml，另一份不加任何抗原刺激物作為對照組，是基 礎(chǔ)分泌水平值，兩份血樣幹旋震蕩后，放入37°C溫箱解育4小時。
[0032] (2)血總RNA的提取:血樣解育4小時后，用RNeasy Mini Kit(Qiagen)試劑盒按說 明書逐步提取總RNA。為減少RNA降解，離屯、機溫度設(shè)定為4°C，所有操作在冰袋上進(jìn)行，并根 據(jù)核酸蛋白檢測儀檢測D260/280紫外吸收率，確定RNA純度，瓊脂糖凝膠電泳觀察其完整 性。
[0033] (3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：首先冰上預(yù)冷無酶PCR管，吸取RNA扣g RNA，嚴(yán)格按照試劑盒 (TIANScript RT Kit-TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒)說明書，逐步逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 逆轉(zhuǎn)錄總體系為20μ1，比例為化 1 oligo(dT)15,2yl Super Pure dNTPs，5.5yl 腳ase- 化ee dd 肥Ο，4μ1 5 XFirst-Strand Buffer，0.扣 1 RNasinayl TIANScript M-MLV。因檢 測因子較多，逆轉(zhuǎn)錄完成后，將cDNA用無酶水稀釋到50μ1，混勻，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0034] (4)巧光定量PCR檢測:選用ABI公司的SYBR酶，反應(yīng)體系為SOiiUSYBR 10化，肥0 6 化，上游引物化L，下游引物化L，cDNA化L，用β-actin做內(nèi)參。使用ABI公司的750(Fast巧光 定量檢測儀，40個循環(huán)，參數(shù)如下：50 °C lmin20s; 95 °C lOmin; 95 °C 15s; 60 °C Imin，溶解曲線 參數(shù):95°C15s;60°Clmin 95°C30s;60°C15s。檢測細(xì)胞因子的量= 2-Δ Act(A ACt=ACt 蛋白刺激組-A Ct空白對照組）。
[0035] 實施例一至實施例Ξ的實驗結(jié)果對比如下：
[0036] 用SPSS20.0做單因素方差分析顯示，Ξ個人群中運3個細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平，方 差齊性，整體比較