支原體td-pcr檢測方法及引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物領(lǐng)域，特別是設(shè)及支原體的TD-PCR(降落聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))檢測方 法及其引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 支原體是哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的主要污染源，它能夠干擾細(xì)胞的功能，是困 擾實(shí)驗(yàn)室及工業(yè)生產(chǎn)的主要問題。哺乳動物細(xì)胞廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)治療性生物制品，因此需 對其進(jìn)行支原體檢查W確保產(chǎn)品的純度及安全性。污染細(xì)胞最常見的支原體包括:發(fā)酵支 原體(M.fementans)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)、口腔支原體(M.orale)、精氨酸支原體 (M.arginina)、唾液支原體(M. salivarium)和人型支原體(M.hominis)。被運(yùn)些支原體污染 的細(xì)胞常常不引起明顯的細(xì)胞病變，也不導(dǎo)致培養(yǎng)液渾濁，難W憑肉眼發(fā)現(xiàn)，因此，建立一 種高效、快速、敏感度高的檢測方法十分必要。
[0003] 《美國藥典/國家處方集》中明確規(guī)定了兩種檢測支原體的方法。其中，培養(yǎng)法需要 將細(xì)胞樣本直接培養(yǎng)到固體及液體培養(yǎng)基當(dāng)中來擴(kuò)增培養(yǎng)。為了檢測一些無法培養(yǎng)的支原 體，樣本還需被接種到指示細(xì)胞當(dāng)中通過后續(xù)DNA染色檢測。培養(yǎng)法檢測周期長(28天），檢 測成本高，一些治療細(xì)胞的生命周期較短，無法用此方法檢測。
[0004] 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)相對于傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測支原體具有更加快速經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)。 一些PCR引物能夠特異性擴(kuò)增支原體保守序列，并檢測絕大部分的支原體，因而PCR法被廣 泛用于臨床W及實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞及組織支原體的檢測。然而PCR法的靈敏性及特異性是其被接 受成為生物醫(yī)藥檢測方法的最大障礙。盡管PCR法十分靈敏，能夠檢測1-10個(gè)拷貝值的支原 體DNA，但在哺乳動物細(xì)胞的支原體檢測中卻并不靈敏，檢測限大約為1000c化/ml,超過了 培養(yǎng)法的檢測限。雖然細(xì)胞培養(yǎng)中支原體的感染水平一般為1〇7-1〇8,但低水平的支原體感 染用PCR法檢測易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
[0005] 另外，支原體DNA的提取，目前常用的方法是用苯酪氯仿抽提DNA，運(yùn)種方法的缺點(diǎn) 是：1、抽提過程較為復(fù)雜繁瑣;2、苯酪、氯仿對環(huán)境及人體的危害性較大;3、時(shí)間較長，一般 需兩至Ξ天。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種支原體TD-PCR檢測方法，它可W提高 PCR法檢測支原體的靈敏度和準(zhǔn)確性。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的支原體TD-PCR檢測方法，步驟包括：
[000引1)抽提待測樣品DNA;
[0009] 2)采用TD-PCR方法檢測待測樣品DNA中是否含有支原體。
[0010]較佳的，步驟1)，采用Qiagen試劑盒提取待測樣品DNA，抽提方法為：用500化PBS 重懸樣本，加入50化蛋白酶K，滿旋混勻，再加入50化L Buffer AL裂解液，滿旋混勻，在56°C 下解育30分鐘，加入11化L 3M醋酸鉛，223化L純乙醇，在-20°C~-30°C下沉淀DNA60min，再 在2-8°C下離屯、eOminW上，離屯、力leOOOgW上，用500μΙ 75%的乙醇清洗DNA沉淀，用焦碳 酸二乙醋將沉淀的DNA重懸成0.化g/μΙ DNA溶液。
[0011] 步驟1)，所述TD-PCR方法的PCR反應(yīng)體系包括:PCR反應(yīng)體系包括:DEPC水，不含 MgCb或dNTPs的10 X緩沖液，50mM MgCb溶液，lOmM dNTPs，20μΜ正向引物，20μΜ反向引物， 5υ/μ1 Platiη咖叫aq DNA聚合酶，共40μ1。PCR反應(yīng)條件為：94°C融鏈；70-60°C退火；72°C延 伸。
[0012] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供用于上述方法的引物對。
[0013] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的引物對，包括正向引物和反向引物，所述正向引物 具有如SEQ ID NO. 1所示的序列或其互補(bǔ)序列，所述反向引物具有如SEQ ID NO.2所示的序 列或其互補(bǔ)序列。
[0014] 本發(fā)明利用改進(jìn)后的QIAGEN試劑盒抽提DNA，再通過TD-PCR方法檢測支原體，相比 現(xiàn)有的支原體檢測方法，不僅縮短了檢測時(shí)間，而且增加了檢測的特異性和穩(wěn)定性，同時(shí)還 減少了實(shí)驗(yàn)過程中有毒有害試劑對于人體及環(huán)境的危害，將該方法用于生物制品的放行檢 巧。，檢測周期可W由原來的28天降為1~2天，大大縮短了檢測周期。
【附圖說明】
[001引圖1是用改進(jìn)的QIAGEN試劑盒抽提樣本DNA的流程示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016]為對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、特點(diǎn)與功效有更具體的了解，現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā) 明詳述如下：
[0017] 實(shí)施例1
[0018] 本實(shí)施例的支原體TD-PCR檢測方法，具體包括W下步驟：
[0019] 1.抽提樣本DNA
[0020] 本實(shí)施例采用改良的QIAGEN試劑盒抽提方法抽提樣本DNA，運(yùn)種方法省去了苯酪 氯仿方法反復(fù)抽提DNA的步驟，在裂解液Buffer AL高效裂解細(xì)胞后，通過助沉淀劑醋酸鉛， 并在低溫助沉淀作用下，極大的提高了支原體DNA的獲得率。具體抽提步驟為：
[0021] 用50化L PBS(憐酸鹽緩沖液)重懸樣本，加入50化蛋白酶K(Qiagen)，滿旋混勻，再 加入500μΙ Buff er AL(裂解液，Qiagen)，滿旋混勻，在56°C下解育30分鐘。然后，加入11化L 3M醋酸鉛，2 2：34化的純乙醇，在-20 °C~-30 °C下沉淀DNA 6Omiη W上，再在2-8 °C下離屯、 60minW上，離屯、力大于leOOOg。用50化L 75%的乙醇清洗DNA沉淀兩次。用一定體積的DEPC (焦碳酸二乙醋)將沉淀的DNA重懸成0.化g/化DNA溶液(如果DNA抽提后，濃度小于0.化g/μ L，則后續(xù)PCR擴(kuò)增時(shí)，每個(gè)PCR反應(yīng)管中需加入化L最大濃度的DNA溶液）。
[0022] 2.PCR 擴(kuò)增
[0023] PCR反應(yīng)的引物為：
[0024] 正向引物:GGCGAATGGGTGAGTAACACG(SEQ ID N0.1)
[0025] 反向引物:CGGATAACGTTGCGACCTATG(SEQ ID N0.2)
[0026] PCR反應(yīng)試劑包括:DEPC水，10 X緩沖液（不含MgCl2或dNTPs)，50mM MgCb溶液， lOmM dNTPs，正向引物20μΜ，反向引物20μΜ，5υ/μ1 P Lati num? Taq DNA聚合酶，共40μ1。
[0027] PCR 擴(kuò)增：
[0028] 在4個(gè)PCR反應(yīng)管中加入待測樣本DNA，其中3管不再加入其它DNA，第4管中再加入 10個(gè)拷貝數(shù)或菌落活性單位的支原體DNA。
[0029] 做3管試劑對照，第1管只加入所有PCR反應(yīng)試劑，第2管加入所有PCR反應(yīng)試劑和10 個(gè)拷貝數(shù)或菌落活性單位的支原體DNA，第3管加入所有PCR反應(yīng)試劑和100個(gè)拷貝數(shù)或菌落 活性單位的支原體DNA。
[0030] 在第1個(gè)PCR反應(yīng)管中加入人源性朋DNA或C冊DNA作為陰性對照，在第2管中加入 人源性H9DNA或C冊DNA和10個(gè)拷貝數(shù)或菌落活性單位的支原體DNA，在第3管中加入人源性 H9DNA或C冊DNA和100個(gè)拷貝數(shù)或菌落活性單位的支原體DNA。
[0031] 運(yùn)用降落PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94°C融鏈;70-60°C退火;72°C延伸。擴(kuò)增產(chǎn)物 通過凝膠電泳分離并在紫外光下檢測。
[0032] 檢測結(jié)果必須同時(shí)滿足如下有效性評判準(zhǔn)則：1)10個(gè)和100個(gè)基因拷貝數(shù)或菌落 活性單位的支原體DNA加入標(biāo)準(zhǔn)的H9細(xì)胞DNA或C冊細(xì)胞DNA后，gel red染色凝膠和Flash凝 膠電泳結(jié)果為陽性且產(chǎn)物大小正確(大小為438-46化P，根據(jù)支原體菌株不同而不同）；2)試 劑對照PCR擴(kuò)增后的凝膠電泳結(jié)果必須為陰性;3)陰性對照PCR擴(kuò)增后的凝膠電泳結(jié)果必須 為陰性。如果滿足上述有效性評判準(zhǔn)則，可進(jìn)一步評估檢測樣本。若測試樣品PCR擴(kuò)增后3個(gè) 重復(fù)均為陰性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷為陰性;若測試樣品PCR擴(kuò)增后3個(gè)重復(fù)中有2-3個(gè)能夠檢測到 大小為(438-470bp)的陽性條帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷為陽性;若測試樣品PCR擴(kuò)增后3個(gè)重復(fù)中的 1個(gè)能夠檢測到陽性條帶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為不確定，實(shí)驗(yàn)將會重做或/和調(diào)查W獲得明確的結(jié)果。
[0033] 實(shí)施例2檢測限驗(yàn)證
[0034] 根據(jù)歐洲藥典5.8章2.6.7的要求，核酸提取方法必須能夠達(dá)到10C即/ML的檢測限 才能成為培養(yǎng)法的替代檢測方法。按照支原體作為污染源出現(xiàn)的概率及動植物種類史，歐 洲藥典對于核酸提取方法的檢測限驗(yàn)證推薦了9種支原體。其中，萊氏無膽醬原體 (Achol邱lasma laidlawii)為人用及獸用疫苗生產(chǎn)過程中必須檢測的支原體，人型支原體 (Mycoplasma hyorhinis)為非鳥類疫苗必須檢測的支原體，肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fe;rmen1:ans)為人用疫苗必須檢測的支原體，精氨 酸支原體(Mycoplasma A巧inine)核酸比率較低，檢測難度為最高。由于本方法的PCR擴(kuò)增 部分已經(jīng)在藥明康德（費(fèi)城)做過詳實(shí)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，本驗(yàn)證將作為其轉(zhuǎn)移驗(yàn)證開展對W下五 種常見支原體進(jìn)行檢測限驗(yàn)證:肺炎支原體、萊氏無膽醬原體、發(fā)酵支原體、人型支原體、精 氨酸支原體。其中，肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)來源于藥明康德美國費(fèi)城實(shí)驗(yàn) 室，萊氏無膽醬原體、發(fā)酵支原體、人型支原體、精氨酸支原體來源于美國菌種保藏中屯、 (ATCC)。將上述五種支原體稀釋至濃度為100cfu/ml、10cfu/ml及5cfu/ml，取1ml，由Ξ名實(shí) 驗(yàn)人員各自用實(shí)施例1的方法，通過改良QIAGEN試劑盒方法抽提DNA后，分別用降落PCR擴(kuò) 增，最終獲得該方法的檢測限為lOcfu/mL。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 支原體TD-PCR檢測方法，其特征在于，步驟包括： 1) 抽提待測樣品DNA; 2) 采用TD-PCR方法檢測待測樣品DNA中是否含有支原體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1 )，采用Qiagen試劑盒提取待測樣品 DNA。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟1 )，DNA抽提方法為：用50化L PBS重懸 樣本，加入50化蛋白酶K，滿旋混勻，再加入50化L Buffer AL裂解液，滿旋混勻，在56 °C下解 育30分鐘，加入11化L 3M醋酸鉛，223化L純乙醇，在-20°C~-30°C下沉淀DNASOmin，再在2-8 °C下離屯、60minW上，離屯、力ieOOOgW上，用50化L 75%的乙醇清洗DNA沉淀，用焦碳酸二乙 醋將沉淀的DNA重懸成0.化g/化DNA溶液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)，PCR反應(yīng)體系包括:DEPC水，不含 MgCb或dNTPs的10 X緩沖液，50mM MgCb溶液，IOmM dNTPs，20咖正向引物，20測反向引物， 抓AUP UtInum^aq DNA聚合酶，共40iil。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)，PCR反應(yīng)條件為:94°C融鏈;70-60 。(:退火;72°C延伸。6. 用于權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述方法的引物對，其特征在于，包括正向引物和反向引 物，所述正向引物具有如SEQ ID NO.1所示的序列或其互補(bǔ)序列，所述反向引物具有如SEQ ID NO.2所示的序列或其互補(bǔ)序列。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種支原體TD-PCR檢測方法，步驟包括：1)抽提待測樣品DNA；2)采用TD-PCR方法檢測待測樣品DNA中是否含有支原體。本發(fā)明還公開用于上述檢測方法的引物對。本發(fā)明通過TD-PCR方法檢測支原體，相比現(xiàn)有的支原體檢測方法，不僅縮短了檢測時(shí)間，而且增加了檢測的特異性和穩(wěn)定性，同時(shí)還減少了實(shí)驗(yàn)過程中有毒有害試劑對于人體及環(huán)境的危害。
【IPC分類】C12N15/10, C12Q1/04, C12N15/11, C12R1/35, C12Q1/68
【公開號】CN105586421
【申請?zhí)枴緾N201610091494
【發(fā)明人】魏良君, 賈明媚, 唐蘇
【申請人】蘇州藥明康德檢測檢驗(yàn)有限責(zé)任公司, 無錫藥明康德生物技術(shù)股份有限公司
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2016年2月19日