一種鑒定阿膠原料中驢源性成分的特異引物對及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及名貴中藥阿膠原料的品質(zhì)鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種鑒定阿膠原料 驢源性成分的特異引物對及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿膠為《中國藥典》2015版的收錄品種，為馬科動物驢Equus asinm L.的干燥皮或 鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠。其藥用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為"上品"，稱 其"可久服輕身益氣"，是藥食同源的重要物種，尤其在治未病方面功效顯著。關(guān)于阿膠的醫(yī) 方醫(yī)案有3200多個，其中包括200多個膏方和200多個食療方?，F(xiàn)代研究表明阿膠能調(diào)節(jié)身 體機(jī)能，增強(qiáng)免疫力，在腫瘤輔助治療、血液病等重大疾病防治上，其治療優(yōu)勢也正逐步凸 顯。僅《中國藥典》2015版收載的含阿膠的成藥即多達(dá)34個。我國驢養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展嚴(yán)重滯后，驢 的存欄數(shù)呈逐年下滑之勢。W致近年制膠原料驢皮短缺、原料價(jià)格上漲，造成目前阿膠市場 混亂，滲雜使假情況屢屢發(fā)生，主要滲假成分包括豬皮、牛皮膠、馬皮膠甚至皮革下腳料等， 給大眾用藥安全帶來重大隱患。傳統(tǒng)的阿膠真?zhèn)舞b別方法，采用外觀性狀和理化性質(zhì)等方 法，需要極為豐富的個人經(jīng)驗(yàn)和深厚的專業(yè)知識，而各種雜皮膠的制備工藝與正品相似，故 其外觀性狀極為相近，更大大增加了鑒別的難度。近來有采用近紅外光譜技術(shù)對阿膠真品 和偽品進(jìn)行快速區(qū)分的報(bào)道，但由于正品和偽品之間缺乏特征性指標(biāo)，易對未知樣品造成 誤判。故把好原料關(guān)對于阿膠及其制品的質(zhì)量控制相當(dāng)關(guān)鍵。驢Equus . asinus L.和馬 Equus . cabal lus oriental is Noack為同科同屬動物，聽子為馬和驢的雜交種。驢皮與馬 皮、聽皮在毛色、性狀等方面十分相近，肉眼很難區(qū)分，故市場上W馬皮等作為驢皮偽品制 造阿膠較為常見。
[0003] 因此，尋找一種簡單、快速且準(zhǔn)確可靠的鑒定阿膠原料驢源性成分的方法顯得尤 為迫切。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鑒定阿膠原料驢源性成分的特異引物 對及其方法。
[0005] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0006] 所述鑒定阿膠原料驢源性、馬源性成分的共用特異性引物對包括引物PF和引物 PR：
[0007] 引物PF的序列為5'-TTTGCCTTCCACTTTATTCTA-3'（沈Q ID N0.1);
[000引 引物PR的序列為5'-GTGTAGGGTAGGGATGAGTG-3'（沈Q ID N0.2)。
[0009]所述鑒定阿膠原料驢源性成分的方法包括如下步驟：
[0010] (1)按常規(guī)動物組織基因組DM提取法提取待測皮張的DNA;用上述的引物對對待 測阿膠原料皮張的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0011] (2)阿膠原料驢源性成分鑒別：向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入限制性內(nèi)切酶BamH I進(jìn)行酶 切，限制性內(nèi)切酶BamH I的酶切位點(diǎn)為5'…G'GATCC···3' ；將酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠 電泳，若在50-35化P出現(xiàn)兩個片段(約76bp和314bp)，則供試品為驢源性，若不出現(xiàn)上述兩 個片段，則供試品不為驢源性。
[0012] 步驟(1)中所述擴(kuò)增體系及條件如下：
[0013] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)WSSliL為參考，各種物品的用量分別為： lOxPC民bu化r (Mg:- plus) 2.5 ^山， clNTPs (2.5mM) 2μΙ； 引物郎（ΙΟμΜ) 〇.5μL.,
[0014] 引物 PR (ΙΟμΜ) 0.5μL^' TaqDNA 巧伯峭(2.5lJ/,uU O.SpL DNA 投板 1.0μΙ_. 去離子水 補(bǔ)齊至25μΙ^，
[0015] PCR反應(yīng)條件：反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s， 53°C 退火 30s，72°C 延伸 453,35個循環(huán)后，72°(：延伸1〇111111。
[0016] 下面對本發(fā)明設(shè)計(jì)原理等作進(jìn)一步說明：
[0017] 本發(fā)明首先檢索Genbank驢、馬及豬、牛、羊等其他物種切tb相關(guān)序列（見表1)，下 載代表性序列進(jìn)行比對分析，在此基礎(chǔ)上WOligo軟件設(shè)計(jì)僅能對驢、馬獲得目的擴(kuò)增的特 異引物，并經(jīng)由肥B化tter針對驢與其他物種DNA序列的差異選擇合適的DNA限制性內(nèi)切酶 切位點(diǎn)，通過分析聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物的限制性酶切圖譜差異，達(dá)到快速、準(zhǔn)確鑒別驢源性 成分的目的。
[001引表1引物設(shè)計(jì)參考序列 [0019]
[0021] 經(jīng)比對驢與其它8種動物的切tb序列，僅驢、豬和羊在614bp處均有BamH I酶切位 點(diǎn)（圖2)，又由于所設(shè)計(jì)的引物是驢特異性的（圖1)，故其他物種一般沒有目的PCR產(chǎn)物，即 使有，其PCR產(chǎn)物也不能被BamHI酶切。
[0022] 從供試皮張中提取其DNA，在給定的PCR條件下，用一對引物(PF、PR)，驢、馬、驢聽、 馬聽能夠擴(kuò)增出一段DNA片段;進(jìn)一步用限制性內(nèi)切酶BamH I (酶切位點(diǎn)為5 '…G'GATCC··· 3'）對供試品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，僅驢、驢聽會在50- 350bp出現(xiàn)兩個片段(約76bp和314bp)，而馬皮、馬聽不會出現(xiàn)上述兩片段。當(dāng)供試樣品經(jīng)用 本法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA片段 的大小，便可W準(zhǔn)確地鑒定驢源性成分。
[0023] 該阿膠原料驢源性成分的PCR-RFLP鑒別方法是綜合利用基因序列比對、特異性酶 切位點(diǎn)分析和引物設(shè)計(jì)等生物信息學(xué)技術(shù)，并經(jīng)過反復(fù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證才得W建立。使用此方 法，只需通過簡單的DNA提取、PCR特異性擴(kuò)增、酶切、電泳檢測即可完成對驢源性成分的鑒 另IJ，具有操作簡單、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。
[0024] 本發(fā)明的有益效果是:解決了非驢皮充當(dāng)原料偽制阿膠而當(dāng)下對此無力鑒別的難 題，提供了鑒定所需的一對PCR引物、PCR反應(yīng)條件、一種限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明利用驢與其 他近似物種DNA序列的差異，建立了快速、便捷、可靠的PCR-RFLP鑒別方法，對于保證阿膠質(zhì) 量，打擊市場上阿膠及其制劑的偽劣品、保障人民用藥安全具有重要價(jià)值。
【附圖說明】
[0025] 圖1:驢源、馬源性成分的特異引物設(shè)計(jì)圖；
[0026] 圖2:驢源性成分的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)圖；
[0027] 圖3:驢皮PCR產(chǎn)物電泳圖；M: 5化P DNA Ladder Marker(條帶大小自下而上依次為 50bp、lOObp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、500bp);P1:MP01;1-43:LP01-43;B: 空白對照；
[002引圖4:馬皮PCR產(chǎn)物電泳圖；M: 5化P DNA Ladder Marker(條帶大小自下而上依次為 50bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、500bp);P2:LP01;l-6:MP01-06;B: 空白對照
[00巧]圖5:驢聽皮PCR產(chǎn)物電泳圖；M:5化P DNA Ladder Marker(條帶大小自下而上依次 為 50bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、500bp);Pl:MP01;l-3:LL01-03; B:空白對照；
[0030] 圖6:馬聽皮PCR產(chǎn)物電泳圖；M: 5化P DNA Ladder Marker(條帶大小自下而上依次 為50bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、500bp);P2:LP01;l-16:ML01-16; B:空白對照；
[0031 ] 圖7:待定皮張 PCR產(chǎn)物電泳圖；M:50bp DNA Ladder Marked條帶大小自下而上依 次為 50bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、500bp);Pl:MP01;P2:LP01;l- 13:孤01-13;B:空白對照；
[0032] 圖8:其他物種PCR產(chǎn)物電泳圖；M:50bp DNA Ladder Marker(條帶大小自下而上依 次為50bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、500bp);B:空白對照；1-7: QT01-07(依次為碟、鴨、羊、雞、豬、兔、牛）;P1:MP01
[0033] 圖9:驢皮酶切產(chǎn)物電泳圖；Μ:50bp DNA Ladder Marker(條帶大小自下而上依次 為50bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、350bp、400bp、500bp);Pl:MP01;l-43:LP01-43; B: