酸-醋酸鋼溶液，W 0. 15~0. 3mL/min沖洗所述分子篩 凝膠層析柱獲得蛋白質(zhì)為本發(fā)明所述脫氨酶。
[0041] 利用分子篩在檢狀青霉胞外粗酶液中分離純化了分子量為23kDa蛋白，如圖1是 SDS-PAGE檢測了純化后的該蛋白已經(jīng)達到電泳純。通過MLDI-T0F鑒定蛋白質(zhì)后，得到所 述脫氨酶一段膚段序列"FVIESAATVR"，通過BLAST在NCBI數(shù)據(jù)庫W及在檢狀青霉基因組數(shù) 據(jù)庫中比對，鑒定該蛋白為脫氨酶蛋白。
[004引 實施例2
[0043] 脫氨酶的酶活力測定實驗：
[0044] 應(yīng)用本領(lǐng)域常規(guī)方法纖維素酶和半纖維素酶國標法測定方法將組合物-脫氨 酶對駿甲基纖維素（CMC-Na)，水楊巧（Salicin)，PNPC，微晶纖維素（Avicel)，木聚糖 狂ylan)、PNPG，和纖維二糖分別進行酶活力檢測，檢測結(jié)果如下表1所示；發(fā)現(xiàn)組合物并沒 有糖巧水解酶活性。
[0045] 表1.脫氨酶的酶學(xué)性質(zhì)初步分析
[0046]
[0047] 實施例3
[0048] 本發(fā)明的脫氨酶的作用機理研究
[0049] 將脫氨酶W 40 μ g/mL蛋白濃度分別向里氏木霉和檢狀青霉的粗酶液中添加，里 氏木霉和檢狀青霉粗酶液的水解效率分別提高了 27%和35%。送是首次在纖維素酶系中 發(fā)現(xiàn)脫氨酶，脫氨酶自身沒有酶活力，與纖維素酶之間存在強烈的協(xié)同作用，所W脫氨酶屬 于纖維素酶協(xié)同組合物，如圖2所示。
[0050] 脫氨酶蛋白沒有檢測到水解酶活力，但是當(dāng)其單獨處理四種組分不同的木質(zhì)纖維 素材料后，用HPLC-42A分析水解產(chǎn)物時發(fā)現(xiàn)，水解產(chǎn)物中都有少量的D-葡萄糖和D-山梨 醇，并且檢測到自由基的產(chǎn)生，如圖3所示。在送個過程中，發(fā)明人成功檢測到了自由基的 生成，再次驗證了上述推測成立。發(fā)明人分別采用了兩種方法檢測自由基的生成，分別是分 光光度法，和HPLC檢測法。自由基較為活躍，不易捕獲，不易檢測。W水楊酸作為捕獲劑， 自由基可^氧化水楊酸生成2,5-二居基水楊酸（2,5-0皿4)，其在0056011111處有吸收峰。如 圖4和圖5所示。
[005。 本發(fā)明人推測該脫氨酶蛋白參與了氧化還原反應(yīng)，將D-葡萄糖還原成為D-山梨 醇，并且伴有自由基的生成。
[0052] 當(dāng)脫氨酶單獨處理將苔，巨藻，玉米芯粉后，利用FTIR分析其處理后木質(zhì)纖維素 結(jié)構(gòu)變化。如圖6-9所示，F(xiàn)TIR顯示，3000-4000cm 1是氨鍵的特征區(qū)域透射值明顯增大（吸 收峰降低），說明當(dāng)脫氨酶處理將苔和巨藻后，破壞生物質(zhì)的氨鍵結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致氨鍵的吸收峰 明顯下降。微晶纖維素、玉米枯桿處理前后氨鍵吸收峰變化不大，結(jié)晶度降低了 10%。而巨 藻和將苔結(jié)構(gòu)相對疏松，通過脫氨酶單獨處理后，結(jié)晶度大幅度降低，降低了 70-100%。紅 外光譜圖區(qū)別主要在1600-1000cmi的區(qū)域內(nèi)，送一區(qū)間的信號峰大都來自木素和半纖維 素。其中1515cm 1，1424cm 1來自于木素中芳香核的振動。1027cm i，827cmi附近的吸收峰 是為木素的愈創(chuàng)木核的特征吸收，1328cm 1，1223 cm 1，1123cm 1處于木素的紫了香結(jié)構(gòu)單 元有關(guān)。將苔、巨藻、玉米芯粉經(jīng)過脫氨酶處理后，木素的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，愈創(chuàng)木酪基和紫了香 基特征位點透射值明顯增大，說明脫氨酶可W破壞木素結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致木素的特征吸收峰明顯 下降。脫氨酶可W破壞木素結(jié)構(gòu)和氨鍵結(jié)構(gòu)，減少了木質(zhì)纖維素的降解屏障，所W脫氨酶和 商業(yè)纖維素酶之間存在強烈的協(xié)同作用。
[0053] 結(jié)合通過HPLC分析脫氨酶處理木質(zhì)纖維素后，有D-葡萄糖和D-山梨醇生成。而 D-葡萄糖含有一個潛在的醒基，脫氨酶可W還原D-葡萄糖生成D-山梨醇，同時產(chǎn)生了強氧 化性的自由基冊·，而自由基可W發(fā)生居基化的反應(yīng)。自由基有一個特點；其作用是無選 擇性的，具有廣泛的作用位點。一方面自由基可W破壞纖維素的目-1,4糖巧鍵，生成葡萄 糖。另一方面脫氨酶產(chǎn)生的自由基具有強氧化性，當(dāng)自由基進入木質(zhì)纖維素內(nèi)部后，靠居基 結(jié)合的氨鍵結(jié)構(gòu)消失，鏈間的作用力變小，使木質(zhì)纖維素結(jié)晶區(qū)趨于無定形化，大大降低了 木質(zhì)纖維素抗降解的屏障，為進一步酶解提供有利條件，所W脫氨酶與商業(yè)纖維素酶之間 存在強烈的協(xié)同作用。
[0054] 通過脫氨酶送類組合物的試驗證明了；脫氨酶本身并沒有水解活性，由于分子量 較小，可W透過木質(zhì)纖維素的較小的間隙進入內(nèi)部，同時通過其產(chǎn)生的自由基冊?可W攻 擊木素和氨鍵網(wǎng)絡(luò)，使無定形的纖維素?zé)o序化，結(jié)構(gòu)變得松散。有利于纖維素酶等酶蛋白和 底物結(jié)合，快速地發(fā)生降解反應(yīng)。
[00巧]根據(jù)上述結(jié)論，本發(fā)明人針對纖維素酶和脫氨酶組成的降解木質(zhì)纖維素的組合物 進行試驗研究，最終獲得較為合適的脫氨酶和纖維素酶的添加量W及反應(yīng)條件。
[0056] 實施例4
[0057] -種利用組合物解聚木質(zhì)纖維素的方法，包括W下步驟：
[0058] 試驗組1 ;將所述組合物中的纖維素酶和脫氨酶添加入木質(zhì)纖維素中進行降解 反應(yīng)，其中，Ig所述底物添加10FPU的所述纖維素酶W及Ig所述底物添加80 μ g脫氨酶，所 需溫度為45及抑為4. 4。
[0059] 對照組1 ;將纖維素酶添加入與試驗組1相同質(zhì)量的木質(zhì)纖維素中進行降解反應(yīng)， 其中，Ig所述底物添加10FPU的所述纖維素酶，所需溫度為45°C W及抑為4. 4。
[0060] 實施例5
[0061] 一種利用組合物解聚木質(zhì)纖維素的方法，包括W下步驟：
[0062] 試驗組2 ;將所述組合物中的纖維素酶和脫氨酶添加入木質(zhì)纖維素中進行降解反 應(yīng)，其中，Ig所述底物添加10FPU的所述纖維素酶W及Ig所述底物添加95 μ g脫氨酶，所需 溫度為501：^及抑為4.4。
[0063] 對照組2 ;將纖維素酶添加入與試驗組2相同質(zhì)量的木質(zhì)纖維素中進行降解反應(yīng)， 其中，Ig所述底物添加10FPU的所述纖維素酶，所需溫度為5(TC W及pH為4. 4。
[0064] 實施例6
[0065] 一種利用組合物解聚木質(zhì)纖維素的方法，包括W下步驟：
[0066] 試驗組3 ;將所述組合物中的纖維素酶和脫氨酶添加入木質(zhì)纖維素中進行降解反 應(yīng)，其中，Ig所述底物添加10FPU的所述纖維素酶W及Ig所述底物添加110 μ g脫氨酶，所 需溫度為5(TCW及抑為4.8。
[0067] 對照組3 ;將纖維素酶添加入與試驗組2相同質(zhì)量的木質(zhì)纖維素中進行降解反應(yīng)， 其中，Ig所述底物添加10FPU的所述纖維素酶，所需溫度為5(TC W及抑為4. 8。
[0068] 實施例7
[0069] -種利用組合物解聚木質(zhì)纖維素的方法，包括W下步驟：
[0070] 試驗組4 ;將所述組合物中的纖維素酶和脫氨酶添加入木質(zhì)纖維素中進行降解反 應(yīng)，其中，Ig所述底物添加10FPU的所述纖維素酶W及Ig所述底物添加120 μ g脫氨酶，所 需溫度為55及抑為5. 2。
[0071] 對照組4;將纖維素酶添加入與試驗組2相同質(zhì)量的木質(zhì)纖維素中進行降解反應(yīng)， 其中，Ig所述底物添加10FPU的所述纖維素酶，所需溫度為55°C W及抑為5. 2。
[0072] 實施例4~7的試驗數(shù)據(jù)見下表：
[0073]
[0074] 由上述試驗數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的用于降解木質(zhì)纖維素解聚作用的組合物的木質(zhì)纖 維素的水解明顯提高，取得了顯著的技術(shù)進步，很大程度上提高了水解木質(zhì)纖維的效率，可 應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)，降低生產(chǎn)成本。
[0075] 盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列 運用，它完全可W被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地 實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限 于特定的細節(jié)和送里示出與描述的圖例。
【主權(quán)項】
1. 一種用于木質(zhì)纖維素解聚作用的組合物，其特征在于，所述組合物包括脫氫酶和纖 維素酶。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于木質(zhì)纖維素解聚作用的組合物，其特征在于，所述脫氫 酶包含： (a) 組合物氨基酸序列：SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列； (b) 在（a)限定的所述組合物中經(jīng)過缺失、插入或置換一個或幾個氨基酸且與（a)所述 多肽具有相同生物學(xué)功能的由（a)衍生的氨基酸序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于木質(zhì)纖維素解聚作用的組合物，其特征在于，所述纖維 素酶包括內(nèi)切酶、外切酶以及β-葡萄糖苷酶。4. 一種利用如權(quán)利要求1所述組合物解聚木質(zhì)纖維素的方法，其特征在于，包括以下 步驟： 將所述組合物中的纖維素酶和脫氫酶添加入木質(zhì)纖維素中進行降解反應(yīng)，其中，lg所 述底物添加10FPU的所述纖維素酶以及l(fā)g所述底物添加80-120 μ g脫氫酶。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用組合物解聚木質(zhì)纖維素的方法，其特征在于，lg所述底 物添加110 μ g脫氫酶。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用組合物解聚木質(zhì)纖維素的方法，其特征在于，所述降解 反應(yīng)所需溫度為45~55°C以及pH為4. 4~5. 2。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用組合物解聚木質(zhì)纖維素的方法，其特征在于，所述降解 反應(yīng)所需溫度為50°C以及pH為4. 8。8. 根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一項所述的利用組合物解聚木質(zhì)纖維素的方法，其特征在 于，所述降解反應(yīng)的產(chǎn)物是糖。
【專利摘要】本發(fā)明涉及木質(zhì)纖維素降解技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于木質(zhì)纖維素解聚作用的組合物及其解聚方法。公開了一種用于木質(zhì)纖維素解聚作用的組合物包括脫氫酶和纖維素酶。在相同纖維素酶含量存在的情況下，很大程度上提高木質(zhì)纖維素的降解效率。本發(fā)明還公開了利用組合物解聚木質(zhì)纖維素的方法，為將所述組合物中的纖維素酶和脫氫酶添加入木質(zhì)纖維素中進行降解反應(yīng)，其中，1g所述底物添加10FPU的所述纖維素酶以及1g所述底物添加80-120μg脫氫酶。本發(fā)明申請人經(jīng)過大量的試驗，旨在為實際生產(chǎn)確定降解木質(zhì)纖維素的比較適宜的組合物中脫氫酶和纖維素酶用量以及反應(yīng)條件，最大程度充分利用組合物，提高木質(zhì)纖維降解反應(yīng)獲得糖的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。
【IPC分類】C12N9/02, C12N9/42, C12P19/14
【公開號】CN105586322
【申請?zhí)枴緾N201410604163
【發(fā)明人】高樂, 李晨, 張東遠, 陳樹林
【申請人】中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2014年10月30日