044]⑥電泳檢測與分析。
[0045]反應結束后，產(chǎn)物加入2μ1 loading buffer，以10bp DNA ladder為DNA分子量標準，采用8%的變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，電泳緩沖液為0.5 X TBE，200 V穩(wěn)壓電泳2_2.5h，至loading buffer移到凝膠底部時電泳結束。電泳結束后，采用銀染法染色，最后將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)上拍照。所有數(shù)據(jù)重復兩次，選擇80-800bp內(nèi)有重復條帶的數(shù)據(jù)為“I”，沒有條帶的為“O”。
[0046]⑦差異片段回收及二次擴增。
[0047]利用干凈的刀片將膠板上的差異條帶小心切割后放入1.5ml的離心管中，標記記錄。每管加入50μ1 ddifeO，沸水浴30min，4°C下12000rpm離心20 min，取2μ1上清液作為模板進行二次擴增。二次擴增反應體系及程序如下:回收的PCR產(chǎn)物3μ1，10 XBuffer 5μ1，dNTPs(10Mm/L)3yl，E-ACAC50ng/p 1)0.5μ1 ,M-CTAC50ng/pI)0.5μ1，Tag聚合酶(5ιι/μ 1)0.25μ I，MgCl2(25mM/L)2.5μ1，ddH20 35.25μ1，反應總體積50μ1，混勻，稍離心，進行PCR擴增反應，擴增程序同選擇性擴增。反應結束后取3μ1在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，在凝膠成像儀下觀察拍照，剩余的47μ1擴增產(chǎn)物-20°c下保存?zhèn)溆谩?br>[0048]⑧二次擴增產(chǎn)物回收。
[0049]二次擴增產(chǎn)物回收按照AxyPrep瓊脂糖凝膠回收試劑盒的操作步驟進行，利用干凈的刀片將膠板上的只有一條條帶的二次擴增產(chǎn)物條帶小心切割并切碎后放入1.5ml的離心管中，加入3倍凝膠體積的Buffer DE-A，混合均勻后于75°C加熱，加熱期間每3min進行渦旋混合一次，直至凝膠塊完全熔化。向離心管中加入0.5倍Buffer DE-A體積的Buffer DE-B，混勻。將混合液轉移到試劑盒內(nèi)提供了DNA制備管后放入2ml離心管中，12000g離心Imin后棄濾液。加入500μ1 Buffer Wl，12000g離心30s后棄濾液。再加入700μ1 Buffer W2，12000g離心30s后棄濾液。再利用700μ1 Buffer W2洗滌一次后12000g離心lmin。將制備管置于干凈的1.5ml離心管中，在制備膜中央加入25-30μ1去離子水，室溫靜置lmin，12000g離心Imin洗脫即得二次擴增產(chǎn)物。
[0050]⑨擴增產(chǎn)物克隆。
[°°511 二次擴增產(chǎn)物的克隆按照pMD18-T Vector cloning kit克隆試劑盒操作說明，首先在微量離心管中加入2μ1 二次擴增產(chǎn)物，0.5μ1 PMD18-T Vector,2.5μ1 Solut1n I，總反應體積為5μ1，16°C下反應30min后全部轉移至含有100μ1 JM109感受態(tài)細胞的離心管中，冰浴30min，42°C加熱45s后，再在冰中放置Imin，加入SOC培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)60min，在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)形成單菌落，挑選白色菌落進行進一步培養(yǎng)及PCR檢測，對符合的陽性克隆進行測序。
[0052]⑩測序及比對。
[0053]使用篩選出的多態(tài)性較好的一對引物組合E-ACA+M-CTA進行相關試驗，共計觀察到37個穩(wěn)定的差異條帶，其中在80-800 bp內(nèi)的差異條帶有28個，對28個差異條帶進行切膠，回收，純化，檢測后送到上海英俊生物技術公司完成序列檢測工作，獲得測序成功的序列18個，利用BLAST程序對獲得的序列進行在線比對和分析，發(fā)現(xiàn)可推測功能的序列12個，并且發(fā)現(xiàn)了與耐鹽直接相關的基因。
【主權項】
1.適用于能源作物一一荻耐鹽基因挖掘的CDNA-AFLP體系構建方法，其特征在于取不同耐鹽荻資源根系、葉片，以提取的總RNA為模板合成cDNA雙鏈并純化，利用EcoRI及Mse I限制性內(nèi)切酶對獲得的雙鏈cDNA進行限制性酶切并連接接頭，然后進行預擴增和選擇性擴增，利用變性聚丙烯酰胺凝膠對反應產(chǎn)物進行電泳、銀染后分析擴增產(chǎn)物多態(tài)性及不同耐性材料的差異條帶，并通過對差異條帶的回收、克隆、測序分析，挖掘能源作物一一荻的耐鹽基因。2.根據(jù)權利要求1所述的適用于能源作物一一荻耐鹽基因挖掘的cDNA-AFLP體系構建方法，其特征在于所述的EcoRI限制性內(nèi)切酶的識別序列為6bp，所述的MseI限制性內(nèi)切酶的識別序列分別為4bp。3.根據(jù)權利要求1所述的適用于能源作物一一荻耐鹽基因挖掘的cDNA-AFLP體系構建方法，其特征在于所述的EcoRI限制性內(nèi)切酶的接頭序列為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，MseI限制性內(nèi)切酶接頭序列為SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4。4.根據(jù)權利要求1所述的適用于能源作物一一荻耐鹽基因挖掘的cDNA-AFLP體系構建方法，其特征在于所述的EcoRI限制性內(nèi)切酶接頭序列互補的預擴增引物序列為E00:SEQID N0.5，MseI限制性內(nèi)切酶接頭序列互補的預擴增引物序列為M00:SEQ ID N0.6。5.根據(jù)權利要求1所述的適用于能源作物一一荻耐鹽基因挖掘的cDNA-AFLP體系構建方法，其特征在于所述的選擇性擴增引物為EcoRI限制性內(nèi)切酶選擇性引物一條，MseI限制性內(nèi)切酶選擇性引物一條;EcoRI限制性內(nèi)切酶選擇性引物選自E-AAC: SEQ ID N0.7,E-AAG:SEQ ID N0.8,E-ACA:SEQ ID N0.9,E-ACT:SEQ ID N0.10,E-ACC:SEQ ID N0.11,E-ACG:SEQ ID N0.12,E-AGC:SEQ ID N0.13,E-AGG:SEQ ID N0.14中的任意一條;所述的MseI限制性內(nèi)切酶選擇性引物選自M-CAA:SEQ ID N0.15,M-CAC:SEQ ID N0.16,M-CAG:SEQ IDN0.17,M-CAT:SEQ ID N0.18,M-CTA:SEQ ID N0.19,M-CTC:SEQ ID N0.20,M-CTG:SEQ IDN0.21,M-CTT:SEQ ID N0.22中的任意一條。6.根據(jù)權利要求1所述的適用于能源作物一一荻耐鹽基因挖掘的cDNA-AFLP體系構建方法，其特征在于所述的選擇性擴增的反應體系及程序如下:ddH20 3.425μ1,Buffer Ιμ?，dNTPs(10Mm/l)1.5yl，E-NNN (50ng/yl，具體為SEQ ID N0.7-14中的一條)0.5μ1，M—NNN(50ngAil，具體為SEQ ID N0.15-22中的一條)0.5μ1，Tag聚合酶(5ιι/μ1)0.125μ1，預擴增稀釋后模板2.5μ1，MgC12(25mM/L)0.45yl，反應總體積ΙΟμΙ，混勻，稍離心，進行PCR擴增反應，擴增程序為94°C2min ； 94°C30s，65°C(每循環(huán)降低0.7°C)30s，72°C60s，共12個循環(huán)；94°C30s，56°C30s，72°C Imin共23個循環(huán);72°C10min，反應結束后產(chǎn)物利于聚丙烯凝膠電泳與銀染分析。7.根據(jù)權利要求1所述的適用于能源作物一一荻耐鹽基因挖掘的cDNA-AFLP體系構建方法，其特征在于所述的挖掘荻耐鹽差異表達基因的方法還包括差異片段的回收及二次擴增，并進一步進行克隆及測序比對分析。
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及一種適用于能源作物——荻耐鹽基因挖掘的cDNA-AFLP體系構建方法。技術方案包括不同耐鹽荻資源根系、葉片總RNA的提?。浑p鏈cDNA的合成及純化；雙鏈cDNA的限制性酶切及接頭連接；連接產(chǎn)物的預擴增及選擇性擴增；電泳后銀染并分析擴增產(chǎn)物多態(tài)性及不同耐性材料的差異條帶；差異條帶的回收、克隆、測序分析。本發(fā)明通過建立的荻cDNA-AFLP體系，不需要預先知道任何序列信息，且多態(tài)性強，假陽性低，速度快，解決了目前荻無該體系的問題，拓寬了其分子標記輔助育種的思路和領域，擴展了基因挖掘的方式。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/10
【公開號】CN105567674
【申請?zhí)枴緾N201510928068
【發(fā)明人】宗俊勤, 劉建秀, 陳靜波, 李丹丹, 張兵, 李建建, 郭海林, 汪毅
【申請人】江蘇省中國科學院植物研究所
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2015年12月15日