利用cDNA-AFLP體系挖掘荻耐鹽基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種適用于能源作物——荻耐鹽基因挖掘的cDNA-AFLP體系構(gòu)建方法。具體來講取不同耐鹽荻資源根系、葉片，及時提取其RNA并進(jìn)行雙鏈cDNA的合成及純化，利用EcoRI及MseI內(nèi)切酶對獲得的雙鏈cDNA進(jìn)行限制性酶切并連接接頭，然后進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增，利用變性聚丙烯酰胺凝膠對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，銀染后拍照分析擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性及不同耐性材料的差異條帶，并通過對差異條帶的回收、克隆、測序分析，挖掘能源作物——荻的耐鹽基因。通過建立荻cDNA-AFLP體系，不需要預(yù)先知道任何序列信息，且多態(tài)性強(qiáng)，假陽性低，速度快，解決目前荻無該體系的問題，拓寬了其分子標(biāo)記輔助育種的思路和領(lǐng)域，擴(kuò)展了基因挖掘的方式。
[0002]屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0003]能源是社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要保證，開發(fā)利用不會對環(huán)境帶來危害的可再生能源資源，是解決目前過度依賴化石能源、降低環(huán)境污染的重要手段，對于目前我國乃至全球的可持續(xù)健康發(fā)展均有重要的意義。2007年中央一號文件明確指出，鼓勵有條件的地方利用邊際土壤，發(fā)展生物質(zhì)原料作物栽培種植。鹽脅迫是影響植物生長發(fā)育的重要脅迫因子，是限制我國鹽堿地高效利用的關(guān)鍵因子，而耐鹽材料的選育和利用將對鹽堿地高效利用和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。
[0004]荻(M.saccharif lora(Maxim.)Nakai)為禾本科芒屬(M.Anderss.)廣布種，多年生高大C4草本，原產(chǎn)于東亞，我國是芒屬植物資源的分布中心(陳守良等，中國植物志，1997，10(2): 19)。由于其作為能源植物所具有的經(jīng)濟(jì)、高效和可持續(xù)性，越來越受到重視并已在歐美等發(fā)達(dá)國家得到了深入發(fā)展而由于目前生產(chǎn)上常用的奇崗(Miscanthus xgiganteus)等材料的耐鹽性相對有限，極大影響了其在鹽堿地的栽培應(yīng)用。已有研究表明，轉(zhuǎn)高效耐鹽基因的分子育種對提高植物耐鹽性有積極作用。而作為我國資源豐富的本土植物，分析不同耐鹽材料在基因表達(dá)方面的差異，挖掘耐性材料中有效的耐鹽基因，對于后續(xù)材料的耐鹽持續(xù)改良和分子育種顯得尤為重要。
[0005]分子標(biāo)記技術(shù)是以個體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映，是植物遺傳育種領(lǐng)域內(nèi)一種新的技術(shù)手段。AFLP技術(shù)是種高效的分子標(biāo)記技術(shù)，其基本原理是對基因組DNA的酶切片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶完全消化，酶切片段與特定的人工接頭相連接，作為擴(kuò)增的模板，接頭序列和鄰近的限制性酶切位點序列作為引物結(jié)合位點，然后用特定的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。它結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)特點，具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性，可在一次單個反應(yīng)中檢測到大量的片段，可以說AFLP技術(shù)是一種具有很大功能的DNA指紋技術(shù)。
[0006]cDNA-AFLP技術(shù)結(jié)合了RT-PCR和AFLP技術(shù)的優(yōu)點，較傳統(tǒng)的AFLP技術(shù)，cDNA-AFLP以純化的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。進(jìn)而借鑒AFLP的方法，用識別序列分別為6_bp和4-bp的兩種限制性內(nèi)切酶酶切雙鏈cDNA，酶切片段與人工接頭連接后，利用與接頭序列互補(bǔ)的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示。cDNA-AFLP不需要預(yù)先知道任何序列信息，且多態(tài)性強(qiáng)，本低，速度快，更適合對生物體轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全面分析。然而cDNA-AFLP技術(shù)流程復(fù)雜，操作繁瑣，技術(shù)要求高，尤其是擴(kuò)增引物的設(shè)計常常需要根據(jù)植物種類的不同而有所差異，同時在試驗過程中的反應(yīng)體系內(nèi)Mg2+和dNTPs的含量和比例更會直接影響實驗的結(jié)果，需要不斷進(jìn)行引物組合的篩選和反應(yīng)體系的優(yōu)化，工作量巨大，從而導(dǎo)致開發(fā)特定植物適合的cDNA-AFLP體系的過程極其困難，限制了 cDNA-AFLP技術(shù)在植物研究領(lǐng)域的應(yīng)用。而在荻研究方面，還未見有關(guān)其cDNA-AFLP體系建立的報道。
[0007]因此，根據(jù)能源作物——荻的表達(dá)特點，開發(fā)荻特有且成熟的cDNA-AFLP技術(shù)體系，將會對荻重要基因的發(fā)掘、克隆及分子標(biāo)記輔助選擇育種及比較基因組學(xué)研究等起到重要推動作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是建立能源作物——荻成熟cDNA-AFLP技術(shù)體系，該體系具有重復(fù)性好、多態(tài)性豐富、適合荻不同部位的特點，為能源作物荻重要耐鹽基因的發(fā)掘、克隆及分子標(biāo)記輔助選擇育種及比較基因組學(xué)研究等提供了新的方法。
[0009]本發(fā)明提供的能源作物——荻cDNA-AFLP技術(shù)體系挖掘耐鹽基因的具體步驟如下:
分別采集正常生長及鹽脅迫下荻的葉和根，用錫箔紙包裹后立刻置于液氮罐里進(jìn)行速凍，然后利用Trizol試劑提取采集材料的總RNA。提取樣品總RNA并純化后，做DNA消化，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測，根據(jù)檢測結(jié)果將提取的材料總RNA稀釋成100ng/ μ?濃度后，以總RNA為模板合成雙鏈cDNA，然后用識別序列分別為6bp和4bp的兩種限制性內(nèi)切酶酶切雙鏈cDNA，酶切后的片段兩端與相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶接頭序列進(jìn)行連接，利用與限制性內(nèi)切酶接頭序列互補(bǔ)的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，再以預(yù)擴(kuò)增引物為模板進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，采用變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后，采用銀染法染色，獲得鹽脅迫下荻的差異表達(dá)基因的差異片段，回收差異片段二次擴(kuò)增后進(jìn)行克隆及測序，從而獲得鹽脅迫下荻差異表達(dá)基因。
[0010]其中所述的cDNA雙鏈合成主要利用cDNA第一鏈的合成試劑盒進(jìn)行第一鏈的合成，cDNA第二鏈的合成使用DNA polymerasel和RNase H進(jìn)行。
[0011 ]其中所述的識別序列為6bp的限制性內(nèi)切酶為EcoRI限制性內(nèi)切酶，酶切反應(yīng)按照內(nèi)切酶說明書進(jìn)行;識別序列為4bp的限制性內(nèi)切酶為MseI限制性內(nèi)切酶，酶切反應(yīng)按照內(nèi)切酶說明書進(jìn)行。
[0012]其中所述的EcoRI限制性內(nèi)切酶所述的接頭序列為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，MseI限制性內(nèi)切酶接頭序列為SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4。酶切產(chǎn)物的連接反應(yīng)體系按照說明書進(jìn)行。
[0013]其中所述的EcoRI限制性內(nèi)切酶接頭序列互補(bǔ)的預(yù)擴(kuò)增引物序列為E00:SEQ IDN0.5，MseI限制性內(nèi)切酶接頭序列互補(bǔ)的預(yù)擴(kuò)增引物序列為M00:SEQ ID N0.6。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系及程序如下:CldH2O 9.7μ1,Buffer 2μ1，dNTPs( 10Mm/l )0.6μ1，E00(50ng/yl )0.7μ1，M00(50ngAil)0.7μ1，Tag聚合酶(5ιι/μ1)0.Ιμ?，已連接的模板(1: 10)5μ1，MgCl2(25mM/l)
1.2μ1，反應(yīng)總體積20μ1，混勻，稍離心，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增程序為94°C2min ； 94°C30s，56°C30s，72°C60s，共30個循環(huán);72°C10min。反應(yīng)結(jié)束后取5μ1，用1.0%的瓊脂糖檢測。
[0014]其中所述的選擇性擴(kuò)增引物為EcoRI限制性內(nèi)切酶選擇性引物一條，MseI限制性內(nèi)切酶選擇性引物一條。EcoRI限制性內(nèi)切酶選擇性引物選自E-AAC:SEQ ID N0.7,E-AAG:SEQ ID N0.8,E-ACA:SEQ ID N0.9,E-ACT:SEQ ID N0.10,E-ACC:SEQ ID N0.11,E-ACG:SEQID N0.12，E-AGC:SEQ ID N0.13,E-AGG:SEQ ID N0.14中的任意一條;所述的MseI限制性內(nèi)切酶選擇性引物選自M-CAA:SEQ ID N0.15,M-CAC:SEQ ID N0.16,M-CAG:SEQ ID N0.17,M-CAT:SEQ ID N0.18,M-CTA:SEQ ID N0.19,M-CTC:SEQ ID N0.20,M-CTG:SEQ ID N0.21,M-CTT:SEQ ID N0.22中的任意一條。
[0015]其中所述的選擇性擴(kuò)增反應(yīng)程序如下:根據(jù)荻轉(zhuǎn)錄組特點，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍后進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系及程序如下:ddH20 3.425μ1，Buffer Ιμ?，dNTPs( 10Mm/l) I.5μ1，E-NNN (50ng/yl，具體為SEQ ID N0.7-14中的一條)0.5μ1，M—NNN (50ng/yl，具體為SEQID 吣.15-22中的一條)0.5口1，了&8聚合酶