一種雙歧桿菌乳酸菌混合發(fā)酵菌酶解法制備工藝及其運用
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及生物菌領域，具體為一種雙歧桿菌乳酸菌混合發(fā)酵菌酶解法制備工藝 及其運用。
【背景技術】
[0002] 雙歧桿菌是人體內存在的一種生理性細菌，是人體有益菌中最值得重視和研究的 一種，它與人體的健康密不可分。可以說是大自然賜予人類的健康法寶。
[0003] 雙歧桿菌是人體和動物體腸道中最重要的正常菌群之一，能在腸道黏膜上生長形 成一道膜菌群，構成一道生物學屏障，從而使入侵的致病菌在腸道內失去生長繁殖的落腳 點，雙歧桿菌在腸道內生長繁殖代謝產生的乙酸、乳酸、醋酸等。既能使腸道環(huán)境變酸，而不 利于有害菌在腸道內生長，又能促使腸道蠕動有利于排便和排出有害細菌。雙歧桿菌可以 持續(xù)產生，維生素8132、86、812及丙氨酸，天冬氨酸和蘇氨酸等人體必要的營養(yǎng)物質，同時 產生短鏈脂肪酸，抗氧化劑，修復胃腸黏膜，促使胃腸潰瘍恢復。
[0004] 雙歧桿菌能抑制硝酸鹽的還原，降低血液中的氨和游離酚含量的作用，增強人體 免疫力和降低體內膽固醇，保持低血脂狀態(tài)。
[0005] 長期服用雙歧桿菌能夠降低胃腸細胞的受損，有助于防止胃腸器官的癌變，降低 胃腸內致癌物質，減低血液中的毒性，減輕肝臟壓力，平衡胃腸道菌群，清除胃腸道內的腐 敗菌，將糞便中的亞硝酸鹽等誘發(fā)癌癥的物質分解，從而阻止致癌物質的形成，為人體免疫 系統(tǒng)提供營養(yǎng)，抑制癌細胞繁殖，產生抑制腫瘤細胞的化合物，降低細胞化學誘變的機會， 對腹瀉、便秘有雙向調節(jié)的明顯作用。
[0006] 科學研究已證實，世界上不少長壽地區(qū)的長壽老人，其腸道內的雙歧桿菌仍保持 著青春壯年水平。
[0007] 微生態(tài)學的現(xiàn)代化崛起和醫(yī)學技術的進展，使雙歧桿菌研究的重要性越來越被認 識，由于雙歧桿菌制品在世界范圍內得以廣泛應用，大眾已認識到其重要性，這也為雙歧桿 菌制品的研究開發(fā)奠定了發(fā)展基礎。
[0008] 雙歧桿菌是一種嚴格厭氧菌，它對生存環(huán)境的要求非?？量蹋瑢I養(yǎng)條件要求較 高，易受氧、水分、光線，保護基質等條件的影響，保質期較短，服用后又被胃酸、膽汁酸等的 滅活，能安全進入腸道的微乎其微，加上生產工藝，配方的不合理缺陷，發(fā)酵過程中未能在 很大程度上使雙歧桿菌產生更多對人體有益的有效物質，所以服用雙歧桿菌制品后的效果 就會下降或不明顯。
[0009] 雙歧桿菌的多種生物學功能，已被科學發(fā)現(xiàn)并應用于各個領域，雙歧桿菌要求厭 氧及營養(yǎng)要求條件較高且生長緩慢，因此雙歧桿菌的生產關鍵問題是篩選耐氧、耐酸、粘附 力強，產量高的菌株，尋求該菌株必要的生長促進物，并選擇該菌株在非厭氧條件或兼性厭 氧條件下的最佳生產工藝，配方等技術。多年來國內外科學家對雙歧桿菌菌株的篩選、馴 化、誘變等做了一系列實驗，據(jù)資料顯示，到目前為止，非厭氧或兼性厭氧雙歧桿菌的生產 及產品在常溫下的保存技術仍在實驗室階段，因此，提高雙歧桿菌活菌產量及先進的生產 工藝及配方這一問題顯得越來越重要。
[0010] 雙歧桿菌活菌及其發(fā)酵代謝產物對人體健康起到重要作用，但現(xiàn)階段雙歧桿菌的 生產方法，主要是厭氧發(fā)酵法，但該方法生產周期長，設備投資大，設備利用率和產菌收率 低，有效物質單一，產品使用效果不顯著，適用范圍小，因產品對氧和溫度極為敏感，對酸的 抵抗力較差，活菌保持較為困難，貨架期短，不能有效發(fā)揮治療、保健作用。
[0011] 針對現(xiàn)有技術所存在的技術問題，山東環(huán)億生物科技有限公司，經多年的深入研 究開發(fā)，經過人體、動物、植物的多方面試驗，成功的開發(fā)出一整套齊全的配方、酶解、誘導、 發(fā)酵法生產雙歧桿菌及其代謝產物的方法，該方法的優(yōu)點在于具有生產配方簡單、易操作、 發(fā)酵周期短、產品收率高、原材料易得、活菌收率高、代謝產物豐富，生產成本更加低廉，使 用效果更加明顯廣泛，產品貨架期長，并突破了常溫下可保存的難點。

【發(fā)明內容】

[0012] 為了解決以上的技術問題，本發(fā)明提供了一種雙歧桿菌乳酸菌混合發(fā)酵菌酶解法 制備工藝，對菌種進行了較為全面的分離篩選，規(guī)定了特殊的配方及發(fā)酵工藝，使雙歧桿菌 產品達到了耐氧、耐酸、耐常溫下儲存。干粉在常溫下能保持12個月不變，有效物質短鏈脂 肪酸、乙酸、乳酸，經測定比一般生產方法及配方活菌分別提高了 10倍、15倍，應用效果明 顯，發(fā)酵液中的活菌量由原來的6-8億個/毫升，提高到了現(xiàn)在的16-20億個活菌/毫升，以 下是具體技術方案： 一種雙歧桿菌乳酸菌混合發(fā)酵菌酶解法制備工藝，步驟包括:制備擴大菌種液和一級 種子培養(yǎng)液得到一級菌種液，再將一級菌種液與種子培養(yǎng)基在種子罐混合培養(yǎng)得到種子罐 菌種，再將所述的種子罐菌種與發(fā)酵罐培養(yǎng)基混合培養(yǎng)并通過誘導液進行發(fā)酵得到發(fā)酵 液，當發(fā)酵完畢后，進行發(fā)酵液離心，得到濕菌泥，其中濕菌泥即為雙歧桿菌乳酸菌的混合 發(fā)酵菌泥，再將濕菌泥的冷凍干燥，其中冷凍干燥還包括懸菌液的制備和真空干燥，其中懸 菌液的制備包括取濕菌泥并加入無菌蒸餾水加熱至60~65°C，并攪拌并加入麥芽糊精，溶化 后再加入水、脫脂奶粉、乳糖、甘油，在30~40°C的條件下攪拌1~2小時，得到懸菌液，然后將 懸菌液放入恒溫室中恒溫60分鐘進行預凍，其中真空干燥步驟為將預凍好的料盤放入真空 干燥室進行抽真空干燥，并且干燥條件為真空度為10~15pa，溫度為-50°C，干燥室溫度為32 °C，干燥時間為55小時，凍干完畢后收集凍干料;其中擴大菌種液制備包括酶解法制備試管 培養(yǎng)基和接種兩部分;其中一級種子培養(yǎng)液制備包括酶解法制備一級種子培養(yǎng)液;所述的 種子培養(yǎng)基的制備包括酶解法制備種子培養(yǎng)基;所述的發(fā)酵罐培養(yǎng)基的制備包括酶解法制 備發(fā)酵罐培養(yǎng)基。
[0013] 其中，所述的擴大菌種液的制備包括酶解法制備試管培養(yǎng)基:將10g核桃仁、10g花 生仁、5克酪蛋白酸鈉、0.1克無水氯化鈣不分前后順序投入到300ml水中進行研磨并打成漿 狀過濾得到漿液，再在漿液中加入700ml水并進行加熱至53°C~57°C并進行攪拌，在攪拌中 加入脂肪酶進行酶解，酶解后再加入無花果酶進行酶解得到酶解液，然后向酶解液中加入 3gL-精氨酸、3g番前粉、6g牛肉膏、2g酵母浸粉、5g蛋白胨、0. lg梓檬酸銨、0.6g絲氨酸、3g氯 化鈉、5g乳糖、8g葡萄糖、8g乙酸鈉、3.2g磷酸氫二鉀進行攪拌溶解后分裝于試管中，每支試 管中分裝20ml。將所述多個試管放入醫(yī)用消毒器中，采用0.1~0.14Mpa滅菌20分鐘后得到試 管培養(yǎng)基； 4、接種：在無菌條件下，打開凍干管菌種，其中凍干管菌種包括：雙歧桿菌（菌號： CGTMCC-1.2212，中國普通微生物菌種保藏管理中心），短雙歧桿菌（菌號：CGTMCC- 1.2213,中國普通微生物菌種保藏管理中心），嬰兒雙岐桿菌(菌號:CGTMCC-1.2202,中國 普通微生物菌種保藏管理中心），鼠李糖乳桿菌(菌號:CICC一6065，中國工業(yè)微生物菌種保 藏管理中心），將所述的4株菌種內分別加入以上滅菌的試管培養(yǎng)基lml，搖動溶化后得到凍 干管菌懸液備用，再將所述的4支凍干管菌懸液分別各取lml加入至4支試管培養(yǎng)基中在31-37°C的溫度下，采用150-210轉/分鐘的轉速，在搖瓶機中搖動24~30小時制得擴大菌種液。
[0014] 其中，一級種子培養(yǎng)基培養(yǎng)中各組分為：核桃仁20克、花生仁20克、酪蛋白酸鈉10 克、L一精氨酸5克、番茄粉6克、牛肉膏8克、酵母浸粉3克、蛋白胨3克、檸檬酸胺0.15克、絲氨 酸0.8克、葡萄糖酸0.4克、氯化鈉3克、乳糖10克、葡萄糖15克、乙酸鈉6克、無水氯化鈣0.1 克、磷酸氫二鉀2克、50萬單位脂肪酶10克、10萬單位無花果酶10克、自來水1000毫升，PH自 然;將一級種子培養(yǎng)基中的核桃仁、花生仁、酪蛋白酸奶、無水氯化鈣加入所述600毫升的水 中進行研磨至漿狀，過濾后得到漿液，然后再所得漿液中加入400毫升水并加熱到53°057 °C并進行攪拌，在攪拌下加入脂肪酶進行酶解，酶解后再加入無花果酶進行酶解得到酶解 液，然后向酶解液中加入其他原料，進行攪拌熔化得到一級種子培養(yǎng)液;將一級種子培養(yǎng)液 量取所用量加入到三角瓶中封口后滅菌，將裝有經過滅菌的培養(yǎng)液的三角瓶放超凈工作臺 中降溫，當溫度降到31°C~37°C，在無菌條件下將所述培養(yǎng)好的擴大菌種液接到三角瓶中， 即100ml -級種子培養(yǎng)液接入的擴大菌種液為4ml，在31-37°C的溫度下，采用搖瓶機在 150-210轉/每分鐘的轉速下，搖動12-28小時得到一級菌種液。
[0015] 其中，種子罐培養(yǎng)步驟:將種子罐及發(fā)酵罐進行空罐滅菌處理;其中種子罐培養(yǎng)基 中各組分的重量比為:核桃仁1.5%、花生仁1.5%、酪蛋白酸鈉0.2%、L一精氨酸0.3%、番茄 粉0.2%、牛肉膏0.4%、蛋白胨0.2%、丁酸鈣0.5%、檸檬酸胺0.02%、絲氨酸0.04%、葡萄糖酸 0.5%、氯化鈉0.3%、乳糖0.5%、葡萄糖1%、乙酸鈉0.3%、無水氯化鈣0.03%、可溶性淀粉0.3%、 50萬單位脂肪酶1%、10萬單位無花果酶1%、磷酸氫二鉀0.2%、聚醚消泡劑0.01%、自來水90%， PH自然;將種子罐培養(yǎng)基配方中的核桃仁、花生仁、酪蛋白酸鈉、無水氯化鈣加入20公斤的 水中進行研磨至漿狀，過濾后得到漿液，然后將漿液加熱到53°C~57°C進行攪拌，在攪拌中 加入脂肪酶進行酶解，再加入無花果酶進行酶解得到酶解液，將所述的酶解液、剩余量的水 和原料不分先后順序的投入種子罐并進行攪拌，然后經過高溫滅菌及降溫處理后，將所述 培養(yǎng)好的一級菌種液在無菌條件下接種到經滅菌處理的種子罐中，接種量分別是