缺陷短波單胞菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于環(huán)境保護技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及缺陷短波單胞菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，城鎮(zhèn)化進程的不斷加快，人們對生活品質(zhì)的要求越來越高，淡水需求量也在日益增大，但生產(chǎn)生活污廢水排放中的污染物質(zhì)未得到有效消減，水環(huán)境狀況還沒有得到根本改善。尤其是含有氮磷的污染物不斷地排放到水體中，導(dǎo)致水體自凈功能喪失，河流和湖泊的藻類水華頻繁爆發(fā)，嚴重破壞了水體生態(tài)環(huán)境，威脅水生生物，并嚴重影響著人們的生活、經(jīng)濟生產(chǎn)和身體健康。
[0003]藻類水華的爆發(fā)使得水體溶解氧減少，水質(zhì)變臭，水體透明度下降，浮游生物和魚蝦類等水生生物因生存環(huán)境惡化而死亡，生物量及種類減少，水體生物多樣性結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最終影響著人們的生活、經(jīng)濟生產(chǎn)和身體健康。在我國，微囊藻是引起地表水體水華的常見藻種，它屬于藍藻門，通常為球形或橢圓形單細胞聚組成的聚集體，微囊藻中的部分藻種，如銅綠微囊藻和水華微囊藻，能夠產(chǎn)生并分泌微囊藻毒素，對水生生物以及人體健康帶來很大的環(huán)境風(fēng)險和危害。
[0004]控制水體中藻類過度繁殖的方法主要有物理法、化學(xué)法和生物法。物理法包括在水華出現(xiàn)時直接進行打撈收集的方法，也包括向水體中投加絮凝性物質(zhì)的方法，如投加改性粘土，可以將藻體絮凝沉降至水底?；瘜W(xué)法主要指投加殺藻劑，常用殺藻劑有硫酸銅和有機農(nóng)藥，但硫酸銅和農(nóng)藥會殘留水中，對生態(tài)環(huán)境造成二次污染，除此外還有人工合成的各種有機殺藻劑，以及生物殺藻劑等。生物法是近些年受關(guān)注比較多的方法，主要有種植水生植物，利用植物的化感作用控制水華，例如種植浮萍、菖蒲等;或通過人為構(gòu)筑的水生生態(tài)鏈來控制水華，例如養(yǎng)殖鰱魚和鳙魚等;或向水體中投入溶藻菌類、食藻蟲等，通過攝食藻類而控制水華。生物法因為其高效性、專一性及環(huán)境友好等優(yōu)點成為藻類水華治理的熱點。
[0005]溶藻菌是指一類以直接或間接方式抑制藻類生長或殺死藻類、溶解藻細胞的細菌和真菌的統(tǒng)稱，是水生生態(tài)系統(tǒng)生物種群結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分，對維持藻類生物量平衡具有非常重要的作用。由于水體藻類水華的爆發(fā)是多種因素綜合作用的結(jié)果，利用溶藻菌治理水華，可使水環(huán)境保持生態(tài)平衡，從而達到防止藻類水華的目的，并且不增加額外的環(huán)境理化污染。溶藻菌廣泛存在于水體及自然環(huán)境狀態(tài)下，是一種天然的物質(zhì)財富，通過溶藻菌可以達到以藻養(yǎng)菌、以菌控藻和原位治藻的目的。因此，篩選以水華藻類或其代謝產(chǎn)物為營養(yǎng)的高效溶藻細菌，并研制溶藻菌劑，具有很好的研究意義和實際運用價值。
[0006]目前，在溶藻菌方面，已有從不同的環(huán)境中分離出了多種溶藻細菌，篩選出的溶藻菌涉及多個屬種，有桿菌、球菌、弧菌等，但是所篩選的菌種主要是針對銅綠微囊藻，而對引起水華的其他微囊藻屬也具有溶藻效果的菌劑，還較缺乏。因此，本發(fā)明不僅篩選出具有能夠溶解銅綠微囊藻的細菌，而且能夠?qū)σ鹚A的其它微囊藻也具有溶解抑制效果，所篩選的菌劑具有易培養(yǎng)、成本低廉，并在微囊藻溶解方面具有高效以及使用操作簡便的特點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供具有溶藻特性的缺陷短波單胞菌。
[0008]本發(fā)明的再一目的是提供上述具有溶藻特性的缺陷短波單胞菌的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明提供了一株具有溶藻特性的缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)AA06，保藏編號為CGMCC N0.11571，用于微囊藻水華的控制。
[0010]該菌株為革蘭氏陰性菌，菌落顏色為灰白色，較為干燥，中間有凸起，類似草帽狀，過氧化氫酶實驗為陽性，甲基紅實驗為陽性，產(chǎn)氨實驗為陽性，檸檬酸鹽利用實驗為陽性。[00??] 本發(fā)明還提供了上述缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)用于溶解微藻的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述微藻為中華微囊藻、銅綠微囊藻或惠氏微囊藻。所示缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)菌液與微藻液的比例為1:10v/v?5:10v/vo
[0012]本發(fā)明的主要效果及優(yōu)點:.本發(fā)明篩選得到的菌株對藍藻水華的優(yōu)勢藻種微囊藻有著很強的溶藻效果，在一定的條件下，可完全去除微囊藻。本發(fā)明篩選得到的菌株對環(huán)境友好，不會產(chǎn)生二次污染，可用于新型的殺藻劑的生產(chǎn)和應(yīng)用，最終控制藍藻微囊藻水華。
【附圖說明】
[0013]圖1是不同的菌液濃度對實際水體微囊藻進行溶藻10天后的葉綠素a含量。
[0014]圖2是不同的菌液濃度對實際水體微囊藻進行溶藻10天后的葉綠素a去除率。
[0015]圖3是用光學(xué)顯微鏡觀察下的細胞變化情況。a為實際水樣溶藻前的藻細胞，b為第10天對照樣中的藻細胞，c為溶藻第5天的藻細胞，d為溶藻第10天的藻細胞。
[0016]圖4是用掃描電子顯微鏡觀察下的細胞變化情況。a為實際水樣溶藻前的藻細胞，b為第10天對照樣中的藻細胞，c和d為溶藻第10天的藻細胞。
[0017]缺陷短波單胞菌(Brevundimonasdiminuta)AA06，保藏編號為CGMCC N0.11571，于2015年11月3日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)。
【具體實施方式】
[0018]實施例1菌株分離
[0019]1、溶藻細菌的篩選
[0020]以自然界的土壤為細菌來源，將采來的土樣放到燒杯中，大約占到燒杯容積的2/3，加入無菌水，攪拌均勻，靜置2h，移取上清液1ml至100ml滅菌后的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37°C條件下培養(yǎng)48h，備用。
[0021]其中所述的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基組成為:蛋白胨5.0g、NaCl5.(^、牛肉膏5.(^、蒸餾水1000ml，pH約為7.5，對于固體培養(yǎng)基，需再添加瓊脂粉2.0 % (m/v)，所用的培養(yǎng)基均要在 120°C、0.11]\^?條件下滅菌30111；[11。
[0022]調(diào)節(jié)菌液的密度，使其約為108CFU/mL，按照1:10(v/v)的比例將菌液加入到微囊藻藻液中，藻細胞密度約為19個/L，5-7天后，以黃化后的藻液為目標菌種的分離源，采用平板涂布和分區(qū)劃線法，經(jīng)多次分離純化，并在藻液中逐一嘗試，最終獲得具有較高溶藻效能的菌株，將其接種在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，于4°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?br>[0023]微囊藻的培養(yǎng)基為8611培養(yǎng)基:恥勵3150011^/1、1(2冊044011^/1、]\%504.7H20 75mg/LXaCl2.2H20 36mg/L、檸檬酸6mg/L、檸檬酸鐵銨6mg/L、Na2EDTA lmg/L、Na2C0320mg/L、H3B032.86mg/L、MnCl2.4H20 I.81mg/L、ZnS04.7H20 0.222mg/L、NaMo04.2H20 0.39mg/L、CuSO4.5H20 0.079mg/L、Co(N03)2.6H2O 0.0494mg/L;pH約為7.1-7.5，在 120°C、0.1lMpa條件下滅菌30min后使用。微囊藻接種于BGll培養(yǎng)基中，于30°C、20001x、14h/10h光暗比條件下培養(yǎng)。
[0024]使用引物27F(AGAGTT TGA TCC TGG CTC AG)和 1492R(TAC GGC TAC CTTGTTACGACT T)，使用PCR技術(shù)，擴增16S rDNA片段，并對擴增產(chǎn)物進行測序，得到該菌株的16S rDNA序列，進行比對，經(jīng)鑒定該菌株為缺陷短波單胞菌(Brevundimonas diminuta)。
[0025]實施例2菌株Brevundimonas diminuta在微囊藻溶藻中的應(yīng)用
[0026]將該菌種接種到滅菌后的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37°C條件下培養(yǎng)48h，待菌的密度為1.0乂109-1.0乂101(^1]/110寸，按菌液:藻液體積百分比1:10-5:10將菌液加入到藻液中，所處理藻液中的藻細胞密度為111個/L以下。可得出，菌株Brevundimonasdiminuta對微囊藻有較高的溶藻能力，菌藻混合后培養(yǎng)10天，溶藻效率可達98%以上(以葉綠素a為度量指標)(如圖1、2所示)。
[0027]實施例3
[0028]本實施例是按菌液:藻液體積比為3:10的投菌量處理銅綠微囊藻。具體實施步驟如下:將缺陷短波單胞菌接種于1ml滅菌后牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37°C條件下培養(yǎng)48h，再將菌液轉(zhuǎn)接到10ml滅菌后牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37°C下培養(yǎng)48h，調(diào)節(jié)菌液密度約為109CFU/mL，然后按照菌藻體積比3:10的投菌量將菌液加入到藻液中，測定藻液葉綠素a的初始濃度為1531yg/L，溶投加菌液10天后，葉綠素濃度為68.7yg/L，溶藻效率為 95.5%。
[0029]實施例4
[0030]本實施例是按菌液:藻液體積比為3:10的投菌量處理中華微囊藻。具體實施步驟如下:將缺陷短波單胞菌接種于1ml滅菌后牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37°C條件下培養(yǎng)48h，再將菌液轉(zhuǎn)接到10ml滅菌后牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37°C下培養(yǎng)48h，調(diào)節(jié)菌密度約為109CFU/mL，然后按照菌藻體積比3:10的投菌量將菌液加入到藻液中，測定藻液葉綠素a的初始濃度為1399yg/L，溶投加菌液10天后，葉綠素濃度為48.lyg/L，溶藻效率為96.6%。
[0031]實施例5
[0032]本實施例是按菌液:藻液體積比為5:10的投菌量處理惠氏微囊藻。具體實施步驟如下:將缺陷短波單胞菌接種于1ml滅菌后牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37°C條件下培養(yǎng)48h，再將菌液轉(zhuǎn)接到10ml滅菌后牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37°C下培養(yǎng)48h，調(diào)節(jié)菌密度約為109CFU/mL，然后按照菌藻體積比5:10的投菌量將菌液加入到藻液中，測定藻液葉綠素3的初始濃度為14414〖/1，溶投加菌液10天后，葉綠素濃度為(^〖/1，去除率為100%。
[0033]與現(xiàn)有假單胞菌(Pseudomonadaceae sp.)對比，將假單胞菌接種于1ml滅菌后牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37°C條件下培養(yǎng)48h，再將菌液轉(zhuǎn)接到10ml滅菌后牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37°C下培養(yǎng)48h，調(diào)節(jié)菌液密度約為109CFU/mL，然后按照菌藻體積比5:10的投菌量將菌液加入到藻液中，測定藻液葉綠素a的初始濃度為855yg/L，投加菌液10天后，葉綠素濃度為719yg/L，跟對照樣藻的死亡率基本一致，該菌株并沒有溶藻能力，而本發(fā)明的溶藻細菌菌株AA06具有優(yōu)良的溶藻能力。
【主權(quán)項】
1.缺陷短波單胞菌(Brevundimonasdiminuta)AA06，其特征在于，其保藏編號是:CGMCC N0.11571。2.權(quán)利要求1所述缺陷短波單胞菌(Brevundimonasdiminuta)AA06用于溶解微藻的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述微藻為中華微囊藻、銅綠微囊藻或惠氏微囊藻。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，缺陷短波單胞菌(Brevundimonasdiminuta)的菌液與微藻液的比例為1:10v/v?5:10v/v。
【專利摘要】本發(fā)明屬于環(huán)境保護技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及缺陷短波單胞菌及其應(yīng)用，其保藏編號是：CGMCC？No.11571。本發(fā)明篩選得到的菌株對藍藻水華的優(yōu)勢藻種微囊藻有著很強的溶藻效果，在一定的條件下，可完全去除微囊藻。本發(fā)明篩選得到的菌株對環(huán)境友好，不會產(chǎn)生二次污染，可用于新型的殺藻劑的生產(chǎn)和應(yīng)用，最終控制藍藻微囊藻水華。CGMCC No.1157120151103
【IPC分類】C12R1/01, C12N1/20, C02F3/34
【公開號】CN105567589
【申請?zhí)枴緾N201511006221
【發(fā)明人】梁文艷, 樊乾龍, 張恒峰, 黃娟, 趙亮, 許建新, 王自力, 蔡飛, 徐軍
【申請人】深圳市鐵漢生態(tài)環(huán)境股份有限公司, 梁文艷, 北京北林先進生態(tài)環(huán)保技術(shù)研究院有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2015年12月29日