一種黑曲霉種子培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種黑曲霉種子培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 巧樣酸是目前產(chǎn)量和消費(fèi)量最大的有機(jī)酸，廣泛應(yīng)用于飲料、食品及醫(yī)藥等行業(yè)。 我國(guó)是巧樣酸生產(chǎn)大國(guó)，總產(chǎn)能已超過100萬(wàn)噸。國(guó)內(nèi)巧樣酸生產(chǎn)是W黑曲霉作為菌種，W 玉米、木馨等淀粉質(zhì)為原料的深層液體發(fā)酵，一般采用二級(jí)發(fā)酵。在進(jìn)行發(fā)酵制備巧樣酸之 前，通常進(jìn)行一級(jí)種子培養(yǎng)，W獲得大量活力高、產(chǎn)酸能力強(qiáng)的黑曲霉菌絲體。
[0003] 微生物生長(zhǎng)過程中，通常對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期細(xì)胞活力較高，一般種子培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)中后期需要移種。在黑曲霉種子培養(yǎng)過程中，也遵循運(yùn)一規(guī)律，W便給后續(xù)發(fā)酵提供活力 旺盛的菌體。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期需要測(cè)定種子生長(zhǎng)曲線來判定。而生長(zhǎng)曲線主要通過細(xì)胞濃度來 反映，一般是通過測(cè)定種子液600nm可見光下吸光度來計(jì)算。而黑曲霉種子培養(yǎng)，通常采用 玉米液化液等淀粉質(zhì)粗料作為培養(yǎng)基，固形物含量較高，并且黑曲霉菌體W菌球形態(tài)存在， 種子液沉降速度快，很難采用吸光度來準(zhǔn)確反映細(xì)胞濃度，因此運(yùn)一方法很難在黑曲霉種 子培養(yǎng)中應(yīng)用。
[0004] 目前，在發(fā)酵之前對(duì)黑曲霉進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，通常是通過觀察來判斷黑曲霉的生長(zhǎng)是 否符合用于生產(chǎn)巧樣酸的發(fā)酵應(yīng)用，但現(xiàn)有的觀察方法主要是通過觀察黑曲霉菌球大小、 形態(tài)，來判斷種子的生長(zhǎng)狀態(tài)，而移種主要根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間來確定。該方法很難真實(shí)反映出黑 曲霉的生長(zhǎng)狀態(tài)，并且由于批次間的差異性，W培養(yǎng)時(shí)間來確定移種，導(dǎo)致不同批次間種子 處于不同的生長(zhǎng)階段，并不能保證處于活力較高的生長(zhǎng)階段，從而影響后續(xù)發(fā)酵結(jié)果。因 此，迫切需要開發(fā)一種能夠準(zhǔn)確反映黑曲霉種子生長(zhǎng)規(guī)律的指標(biāo)和W此作為依據(jù)的移種判 斷標(biāo)準(zhǔn)，為后續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)提供高活力的種子液。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供了一種能夠準(zhǔn)備反映黑曲霉種子生長(zhǎng)指標(biāo)和移種時(shí)機(jī) 的黑曲霉種子培養(yǎng)方法。
[0006] 在本領(lǐng)域中，除細(xì)胞濃度外，產(chǎn)物生成、底物消耗、W及關(guān)鍵酶的產(chǎn)量等也通常作 為微生物種子生長(zhǎng)規(guī)律的參考依據(jù)。發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)酸生成曲線、葡萄糖消耗曲線、糖 化酶活力變化曲線等指標(biāo)在反映黑曲霉種子生長(zhǎng)狀態(tài)也可W起到重要的作用。
[0007] 經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率W及糖化酶活力在種子生長(zhǎng)過 程中分別呈現(xiàn)如下特點(diǎn)： 1) 首先，產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率W及糖化酶活力為0; 2) 接著，Ξ項(xiàng)指標(biāo)迅速增加； 3) 然后，Ξ項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到最大值； 4) 之后，Ξ項(xiàng)指標(biāo)逐漸下降； 5) 最后，Ξ項(xiàng)指標(biāo)重新降至0。
[0008] 由此可見，產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率和糖化酶活力的變化能夠間接反映黑曲霉種 子生長(zhǎng)規(guī)律，并且產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率和糖化酶活力達(dá)最大值的時(shí)間處于相同的時(shí)間 段;產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力達(dá)最大值的時(shí)間可W作為種子進(jìn)入移種時(shí)期的 判斷依據(jù)。
[0009] -種黑曲霉種子培養(yǎng)方法，其中，該方法包括:將黑曲霉抱子懸液接種至培養(yǎng)基中 進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)過程中適時(shí)測(cè)量產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力中的至少一種， 當(dāng)所述產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力達(dá)到最大值后進(jìn)行移種。
[0010] 產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力，運(yùn)Ξ個(gè)指標(biāo)可W僅測(cè)量其中的任意一個(gè) 作為判斷的標(biāo)準(zhǔn)，也可W測(cè)量多項(xiàng)結(jié)果后進(jìn)行結(jié)合判斷。本發(fā)明中產(chǎn)酸速率的測(cè)定是通過 測(cè)定種子罐酸度，再計(jì)算出產(chǎn)酸速率的;耗葡萄糖速率是采用生物傳感分析儀進(jìn)行測(cè)定的； 糖化酶活力采用GB 8275-2009中方法測(cè)定的。
[0011] 發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，W產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力 變化來反映黑曲霉種子生長(zhǎng)狀態(tài)和指導(dǎo)移種，能取得較好的效果，由此制備的種子不同批 次間的差異性小，并且種子活性高，發(fā)酵指標(biāo)穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化率高、發(fā)酵周期短。
[0012] 同時(shí)，在可選的Ξ個(gè)指標(biāo)中，相對(duì)于葡萄糖和糖化酶活力的測(cè)定，酸度的測(cè)定更簡(jiǎn) 單便捷，時(shí)效性更好，且需要的設(shè)備儀器少，消耗低，W產(chǎn)酸速率來反映黑曲霉種子生長(zhǎng)狀 態(tài)和指導(dǎo)移種是最佳選擇;也可W選擇多項(xiàng)指標(biāo)，或與傳統(tǒng)方法相結(jié)合來判斷。
[0013] 優(yōu)選地，所述移種在產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力達(dá)到最大值后1~化內(nèi) 進(jìn)行。相對(duì)于其他時(shí)間段移種，當(dāng)產(chǎn)酸速率、耗葡萄糖速率或糖化酶活力達(dá)最大值后1~化 內(nèi)移種，對(duì)應(yīng)的發(fā)酵指標(biāo)穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化率高、發(fā)酵周期更短。
[0014] 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)過程中還包括對(duì)溶氧濃度的控制，在發(fā)酵過程中控制溶氧濃度 不低于初始濃度的20%。
[0015] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在黑曲霉種子培養(yǎng)過程中，上述Ξ項(xiàng)指標(biāo)受種子罐溶氧濃度影響 較大，特別是溶氧濃度低于初始濃度的20%時(shí)，產(chǎn)酸速率和耗葡萄糖速率會(huì)受到嚴(yán)重影響， 從而破壞種子生長(zhǎng)規(guī)律，對(duì)種子生長(zhǎng)狀態(tài)和移種標(biāo)準(zhǔn)判斷形成干擾。因此，在種子罐培養(yǎng) 中，通過溶氧濃度與攬拌轉(zhuǎn)速或風(fēng)量偶聯(lián)的反饋控制，將溶氧濃度控制在20%W上。
[0016] 進(jìn)一步地，所述溶氧深度通過反饋控制，將溶氧濃度與攬拌轉(zhuǎn)速或風(fēng)量偶聯(lián)，當(dāng)溶 氧濃度低于20%時(shí)，提高攬拌轉(zhuǎn)速或風(fēng)量，或同時(shí)增加轉(zhuǎn)速、風(fēng)量、罐壓來增加溶氧濃度。
[0017] 優(yōu)選地，所述產(chǎn)酸速率是通過在線或離線方式測(cè)定的。在線方式是通過連接高效 液相色譜進(jìn)行測(cè)定;離線方式是采用GB1987-2007中氨氧化鋼滴定法進(jìn)行測(cè)定。
[0018] 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基所選用的氮源包括無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源中的一種或多種;無(wú) 機(jī)氮源為硫酸錠、硝酸錠或尿素;有機(jī)氮源可選擇豆巧粉、棉巧粉、蛋白腺、酵母膏等。
[0019] 優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基總糖最適濃度為8~12%，總氮最適濃度為0.15~0.4%。
[0020] 優(yōu)選地，本發(fā)明中黑曲霉抱子懸液接種后濃度為10~80萬(wàn)個(gè)/毫升種子液。
[0021] 進(jìn)一步地，黑曲霉抱子懸液接種后最優(yōu)范圍為20~40萬(wàn)個(gè)/毫升種子液。
[0022] 上述培養(yǎng)方法培養(yǎng)的黑曲霉種子在巧樣酸發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明中種子培養(yǎng)條件除對(duì)溶氧濃度有較高要求外，其他培養(yǎng)條件均是本領(lǐng)域所 熟知的，培養(yǎng)溫度最適范圍為35~38°C，罐壓為0.05~0.12 Mpa，通風(fēng)比例和攬拌轉(zhuǎn)速根據(jù) 罐體大小、徑高比、獎(jiǎng)葉大小和形狀等因素設(shè)置合適范圍，通常罐體越大需要的通風(fēng)比例和 攬拌轉(zhuǎn)速越小。
[0024] 本發(fā)明的培養(yǎng)方法通過理化指標(biāo)反映種子生長(zhǎng)狀態(tài)并W此指導(dǎo)移種，發(fā)酵結(jié)果標(biāo) 準(zhǔn)差更小，批次間更穩(wěn)定，發(fā)酵轉(zhuǎn)化率提高，發(fā)酵周期明顯縮短。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出詳細(xì)描述，W使本領(lǐng)域技術(shù)人員可W更好地理 解本發(fā)明，從而對(duì)本發(fā)明要求保護(hù)的范圍作出更清楚的限定。
[0026] 本發(fā)明的方法對(duì)種子培養(yǎng)基適用范圍較廣，只要能適合黑曲霉種子生長(zhǎng)的培養(yǎng)基 即可。W下實(shí)施例中的種子培養(yǎng)基選用本領(lǐng)域熟知的玉米液化液和氮源配制而成;其中，氮 源包括無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源中的一種或多種;無(wú)機(jī)氮源為硫酸錠、硝酸錠或尿素;有機(jī)氮源 可選擇豆巧粉、棉巧粉、蛋白腺、酵母膏等。種子培養(yǎng)基總糖最適濃度為8~12%，總氮最適濃 度為0.15~0.4%。采用的菌種為中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中屯、（CICC)保藏的黑霉 CICC40021。
[0027] 實(shí)施例1 玉米進(jìn)行粉碎后，過80目篩;所得玉米粉與自來水，按1:3料水比混合均勻，將漿料抑調(diào) 節(jié)至5.8，按20U/g玉米粉的添加量加入高溫α-淀粉酶;所得粉漿經(jīng)過兩次噴射，艦試呈淺棟 色后得到合格液化液。
[0028] 液化液用自來水稀釋，加入硫酸錠配制成總糖為10%，總氮為0.2%的種子培養(yǎng)基。 12rC滅菌20min后降溫至37°C后，接入黑曲霉CICC 40021抱子懸液(菌株來源:CICC保藏 菌株），使接種后抱子濃度為30萬(wàn)個(gè)/毫升。
[0029] 種子培養(yǎng)條件為:溫度37°C，溶氧濃度與攬拌轉(zhuǎn)速偶聯(lián)反饋控制，通過調(diào)整攬拌轉(zhuǎn) 速將溶氧溶度控制在初始濃度20%W上。
[0030] 培養(yǎng)過程中間隔一定時(shí)間進(jìn)行取樣，離線測(cè)定種子液酸度，根據(jù)酸度變化計(jì)算產(chǎn) 酸速率，并與上一時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)酸速率比較，當(dāng)產(chǎn)酸速率達(dá)到最大值后，化內(nèi)將種子液移種至發(fā) 酵罐內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵罐還原糖〇.5%W下時(shí)結(jié)束發(fā)酵，計(jì)算周期和轉(zhuǎn)化率。
[0031 ] 實(shí)施例2 玉米進(jìn)行粉碎后，過80目篩;所得玉米粉與自來水，按1:3料水比混合均勻，將漿料抑調(diào) 節(jié)至5.8，按20U/g玉米粉的添加量加入高溫α-淀粉酶;所得粉漿經(jīng)過兩次噴射，艦試呈淺棟 色后得到合格液化液。
[0032] 液化液用自來水稀釋，加入硫酸錠配制成總糖為10%，總氮為0.2%的種子培養(yǎng)基。 12rC滅菌20min后降溫至37°C后，接入黑曲霉CICC 40021抱子懸液(菌株來源:CICC保藏 菌株），使接種后抱子濃度為30萬(wàn)個(gè)/毫升。
[0033] 種子培養(yǎng)條件為:溫度37°C，溶氧濃度與風(fēng)量偶聯(lián)反饋控制，通過調(diào)整風(fēng)量和罐壓 將溶氧溶度控制在初始濃度20%W上。
[0034] 培養(yǎng)過程中間隔一定時(shí)間進(jìn)行取樣，離線測(cè)定種子液酸度，根據(jù)酸度變化計(jì)算產(chǎn) 酸速率，并與上一時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)酸速率比較，當(dāng)產(chǎn)酸速率達(dá)到最大值后，化內(nèi)將種子液移種至發(fā) 酵罐內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵罐還原糖〇.5%W下時(shí)結(jié)束發(fā)酵，計(jì)算周期和轉(zhuǎn)化率。
[00巧]實(shí)施例3 玉米進(jìn)行粉碎后，過80目篩;所得玉米粉與自來水，按1:3料水比混合均勻，將漿料抑調(diào) 節(jié)至5.8，按2