16°C過夜連接，約2地。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，搖菌后涂于含抗生素 Amp的LB平板上，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1地。挑 取單克隆經(jīng)PCR檢測(cè)后送往華大基因進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒即為PMD18-AhRESS. 利用限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI將pMD18-AhRESS載體進(jìn)行酶切，酶切體系如下：2.化g 質(zhì)粒DNA，5.0化10XKbuffer，2.0化SacI，2.0μLBamHI，d地20補(bǔ)至50化，混勻，于37°C消 化酶切l(wèi)lh，反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果，回收目的條帶，獲得帶有SacI和 BamHI位點(diǎn)的AhRESS基因。
[0037] 用限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI對(duì)地I121-NtR2-GUSA載體進(jìn)行酶切，酶切體系如下： 2.0μg質(zhì)粒DNA，5.0化10XKbuffer，2.0μLSacI，2.0化BamHI，d地20補(bǔ)至50化，混勻，于 37°C消化酶切1化，反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果。
[003引將AhRESS基因連接至pBI121-NtR2-GUSA載體中，連接反應(yīng)體系如下：1.0化10X T4ligasebuffer，4.0化基因 DNA片段，4.0化載體DNA片段，1.0化T4DNAligase，混勻，于 16°C過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，菌液涂布于含抗生素 Kan的LB平 板上，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14h。
[0039] 挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系如下：1.0化模板，2.0化10XPCR buffer，1.5yL 2.5mM dNTP，0.1 化普通Taq酶，0.5化 AhRESS- BamHI-primer-F( 5' TCGTGGATCCGCCACCATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC 3'）， 0.化L AhRESS- -SacI-primer-R(5' TCCTGAGCTCTTATATGGCCACACTGCGGAGAACG 3 '），14.4化(1 地20JCR反應(yīng)條件為：94°C 5min一 (94°C 30s一69°C 30s一72°C 1.5min)35巧cles一72°C lOmin一4°C保存。對(duì)菌液PCR呈陽 性的部分菌液進(jìn)行擴(kuò)繁，用堿裂解法提取質(zhì)粒，然后進(jìn)行酶切單、雙檢測(cè)，37°C酶切消化4 h，反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果。檢測(cè)結(jié)果正確的，送往華大基因進(jìn)行測(cè)序。 測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒即為地I121-NtR2-AhRESS載體。
[0040] 【實(shí)施例2】地I121-NTR2-AhRESS載體轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌 取化g左右(體積小于20μ1)的地I121-NTR2-AhRESS質(zhì)粒DNA加入到20化L發(fā)根農(nóng)桿菌感 受態(tài)細(xì)胞中，用移液槍輕輕吹打混勻;冰浴30min，而后于液氮中放置5min，再在42°C恒溫水 浴鍋中水浴Imin，重復(fù)3次;接著于冰上放置5min，加入80化L Y邸液體培養(yǎng)基，于28°C恒溫 振蕩器中振蕩培養(yǎng)，175巧m，化后，300化pm離屯、3min，棄80化1上清，將剩余菌液混勻，涂布 于含50mg/l Kan的Y邸平板上，于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到形成單菌落，約72h;挑取單克隆 于40化1 YEB+50mg^的培養(yǎng)基中，220巧m 28°C振蕩培養(yǎng)16 h;，菌液PCR驗(yàn)證，經(jīng)驗(yàn)證為陽 性克隆的，取60化1菌液與60化1 50%甘油（已滅菌)于無菌化pendorf管中混勻，液氮中速凍 后保存于-70°C冰箱。菌液PCR驗(yàn)證體系如下： PCR反應(yīng)體系：
PBI121-化R12-AhRESS所用引物為：AhRESS-F(5' ATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC3)和 AhRESS-lK5'TTATATGGCCACACTGCGGAGAAC 3'）；PCR反應(yīng)條件為：94°C 5 min一（94°C 30 S 一57°C 30 s一72°C 1.5 min)35巧cles一72°C 10 min一4°C保存。
[0041] 結(jié)果表明，表達(dá)載體質(zhì)粒DM的PCR產(chǎn)物為特異目的條帶，質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)化至發(fā)根 農(nóng)桿菌中，該方法可W實(shí)現(xiàn)攜帶外源基因的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌。
[0042] 【實(shí)施例3】花生發(fā)狀根的誘導(dǎo) 分別制備新會(huì)小?；ㄉ贩N的無菌苗和工程菌，利用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化花生。
[0043] (1)花生無菌苗的制備:配置0.1%氯化隸，取相應(yīng)量的1%氯化隸根據(jù)比例稀釋，保 存于棟色瓶內(nèi)，避光，密封；取花生種子60粒于組培瓶中，75%乙醇浸泡1 min,劇烈搖動(dòng)， 0.1%氯化隸浸泡10 min,劇烈搖動(dòng)，無菌水水洗5次，每次5 min,無菌水浸泡2 h，去掉種皮， 胚根向下插入MS培養(yǎng)基，每瓶3粒;28°C，暗培養(yǎng)48 h，而后將其移至16 h的光周期，8 h暗條 件下培養(yǎng)至長出2片真葉(約8-10 d)。
[0044] (2 )工程菌的制備:從-80°C超低溫冰箱中取出先前保存的相應(yīng)重組質(zhì)粒的菌液， 進(jìn)行劃板(含50 mg/L kan的Y邸平板），挑取單克隆，搖菌，菌液PCR驗(yàn)證，經(jīng)驗(yàn)證為陽性克隆 的菌液，取部分菌液進(jìn)行大量搖菌，一般搖50血菌液，250 rpm，28°C過夜培養(yǎng)至0〇6日日=0.5 (注意不能有結(jié)塊產(chǎn)生，或者用時(shí)滿旋使呈單細(xì)胞狀態(tài)）；取45 mL菌液于50 mL離屯、管中離 屯、，4100 rpm離屯、10 min;倒掉上清液，沉淀重懸于50 mL 1/2 MS基本培養(yǎng)基中，加100 mM 的乙酷下香酬(AS巧0 μレ將制備好的工程菌液于4°C膽藏1-2 h，W供共培養(yǎng)(外植體的侵 染)。
[004引（3)發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化花生:取出花生無菌苗幼苗，分別獲得葉片、子葉、上胚軸 和下胚軸外植體，外植體表面做劃傷處理，分別置于無菌組培瓶，將已制備好的工程菌液分 別倒入，不斷地輕輕晃動(dòng)瓶子，持續(xù)侵染15 min;倒掉工程菌菌液，用無菌濾紙吸干多余的 菌液，將已侵染的花生各種外植體置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS+75 μΜ As)中共培養(yǎng)，28°C暗培養(yǎng) 2-4 d，視菌的長勢(shì)而定;將共培養(yǎng)后外植體取出置于無菌組培瓶，而后往已滅菌的組培瓶 中加入50 mL終濃度為500 mg/L的Cef水溶液，不斷輕輕晃動(dòng)瓶子，持續(xù)5 min,而后將葉片 取出，重復(fù)一次，接著將葉片放入含50 mL無菌水的瓶子中，不斷輕輕晃動(dòng)瓶子，持續(xù)5 min 左右;將洗過菌的本生煙草葉片分別轉(zhuǎn)入發(fā)狀根誘導(dǎo)培養(yǎng)基(B5+500 mg/L Cef)中進(jìn)行發(fā) 狀根誘導(dǎo)，每隔5-7 d轉(zhuǎn)接一次，Ξ周之后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出的毛狀根的數(shù)量，10個(gè)對(duì)照的外植體 與10個(gè)經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌侵染的外植體作為一組，用W統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)各組外植體的毛狀跟誘導(dǎo)率。
[0046] 【實(shí)施例4】轉(zhuǎn)地I121-NTR2-AhRESS花生發(fā)狀根液體懸浮培養(yǎng) 花生外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生的發(fā)狀根經(jīng)除菌后，可用于液體懸浮培養(yǎng)W及發(fā)狀根樣品的制 備。
[0047] 除菌步驟:花生外植體誘導(dǎo)3周后，取不同部位的長約3-5 cm發(fā)狀根于液體培養(yǎng)培 養(yǎng)基(MS+500 mg/L Cef)中，每瓶一條根，120巧m，28°C，暗培養(yǎng)1周后，取生長良好的發(fā)狀 根于液體培養(yǎng)基繼代，繼代培養(yǎng)基為MS+300 mg/L Cef,培養(yǎng)1周后，繼代于MS+100 mg/L Cef,再培養(yǎng)1周后，繼代于MS培養(yǎng)基。Ξ次繼代后頭抱霉素濃度降至0。
[0048] 液體懸浮培養(yǎng):分別取經(jīng)過除菌后遺傳鑒定發(fā)狀根系的3-5條根，接種于液體MS培 養(yǎng)基，28°C，120 rpm，暗培養(yǎng);每周繼代一次，接種剩余的發(fā)狀根用濾紙盡量吸干，液氮速凍 后，凍存于-80°C冰箱。
[0049] 【實(shí)施例5】轉(zhuǎn)基因花生發(fā)狀根基因組PCR鑒定 1.轉(zhuǎn)基因花生發(fā)狀根DNA的提取 取轉(zhuǎn)基因花生發(fā)狀根lOOmg，在液氮中研磨植物組織成粉末，并轉(zhuǎn)移到在65°C預(yù)熱的盛 有抽提液的離屯、管中。在65°C溫育45min，其間不時(shí)混勻。用等體積的24:1的氯仿/異戊醇抽 提勻漿，顛倒混勻(溫和）d4°C，10000巧m離屯、5min，回收上清液。在上清液中加入1/10體積 的65°C的CTAB/化cl的溶液，顛倒混勻(溫和）。用等體積的24:1的氯仿/異戊醇抽提勻漿，顛 倒混勻（溫和）e4°C，10000rpm離屯、5min，回收上清液。加入1倍體積的CTAB沉淀液，翻轉(zhuǎn)混 勻，見到沉淀后進(jìn)行下一步；否則于65°C溫育30min。于4°C，10000巧m離屯、5min。移出上清， 但不要丟棄，用ο . 5ml高鹽的TE緩沖液重懸沉淀，如果沉淀難于重懸，于65°C溫育30min，重 復(fù)至所有的或大部分沉淀溶解。加入0.6倍體積的異丙醇沉淀核酸，充分混勻(溫和），4°C， 1000化pm離屯、15min。用80%乙醇洗沉淀，驚干，并用0.1ml的緩沖液溶解沉淀。最后加入1/20 體積的RNA酶在37°C放化。最后放在-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0050] 2.基因組DNA的PCR檢測(cè) 將花生發(fā)狀根提取的DNA稀釋至l(K)ng/y 1，取山1作為模板，依次加入滅菌蒸饋水14.4 μ1 aOXP