S本生煙草發(fā)狀根液體懸浮培養(yǎng)。
[0020] 通過(guò)液體MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)，繼代時(shí)逐漸降低Cef的濃度，直至最后Cef降至0而發(fā)狀 根在純液體MS培養(yǎng)基中可W快速生長(zhǎng)又不受污染。需要注意的是，外植體不同位點(diǎn)長(zhǎng)出的 根為不同的發(fā)狀根系，除菌時(shí)要W1條根起始。發(fā)狀根快速擴(kuò)繁即將一條發(fā)狀根接種于新鮮 MS培養(yǎng)基中，28°C振蕩暗培養(yǎng)2周，發(fā)狀根產(chǎn)量是接種量的100倍W上。篩選所得的能夠快速 生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀根液體培養(yǎng)后，收獲發(fā)狀根。
[0021 ] 3.轉(zhuǎn)地I121-NtR12-AhRESS本生煙草發(fā)狀根白襲蘆醇含量的檢測(cè)。
[0022] W甲醇為浸提液提取發(fā)狀根中白襲蘆醇，浸提液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得HPLC待檢測(cè)樣 品，通過(guò)HPLC測(cè)定發(fā)狀根中白襲蘆醇含量。
[0023] 有益效果 本發(fā)明利用煙草根特異啟動(dòng)子化R12驅(qū)動(dòng)AhRESS基因在煙草根中特異表達(dá)，將植物表 達(dá)載體經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化至本生煙草中，使AhRESS基因在發(fā)狀根中特異表達(dá)，通過(guò)液體懸 浮培養(yǎng)短期內(nèi)大量擴(kuò)繁發(fā)狀根，實(shí)現(xiàn)白襲蘆醇的大量表達(dá)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀 根培養(yǎng)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)快速、遺傳性狀穩(wěn)定，可為利用植物基因工程手段高效生產(chǎn)白襲蘆醇提供 基礎(chǔ)。利用有機(jī)溶劑浸提法提取轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀根中白襲蘆醇，經(jīng)高效液相色譜 (HPLC)測(cè)定，其白襲蘆醇含量最高為2.12yg/g(FW)，是未轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根中白襲蘆醇含量的4 倍。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1地I121-35S-GUSA遺傳轉(zhuǎn)化本生煙草發(fā)狀根的GUS染色圖.Bar=lcm。
[00巧]圖2 PBI121-35S-GUSA遺傳轉(zhuǎn)化本生煙草發(fā)狀根的GUS染色壓片圖.A:CK，B: 地I121-35S-GUSA轉(zhuǎn)化本生煙草發(fā)狀根系。
[0026] 圖3發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的地I121-NtR12-AhRESS遺傳轉(zhuǎn)化本生煙草外植體誘導(dǎo)發(fā)狀 根的變化圖.A:誘導(dǎo)1周，B:誘導(dǎo)2周，C:誘導(dǎo)3周。
[0027] 圖4轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀根系中AhRESS基因 RT-PCR檢測(cè)電泳圖.M:Marker 2000， 1-9:轉(zhuǎn)地1121-NtR12-AhRESS發(fā)狀根系，10:陽(yáng)性對(duì)照，11:陰性對(duì)照。
[0028] 圖5轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀根系液體懸浮培養(yǎng)圖.A:接種，B:培養(yǎng)1周，C:培養(yǎng)2周。
[0029] 圖6轉(zhuǎn)基因本生煙草發(fā)狀根系白襲蘆醇HPLC分析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 【實(shí)施例1】地I121-NtR12-AhRESS載體的構(gòu)建 1.煙草根特異啟動(dòng)子化R12的克隆 稱取約0.1 g煙草葉片，置于研鉢中用液氮凍融，迅速將其研磨成粉末;利用CTAB法提取 煙草中的DNA，用40化、lOng/化的RNase無(wú)菌水溶解，置于37°C溶解化左右。取1化提取好的 煙草DNA點(diǎn)樣，進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳條件：電泳緩沖液1 X TAE，1.0%的瓊脂糖凝膠，電壓120V， 電泳時(shí)間約20min;同時(shí)取化L用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。結(jié)果顯示所提取的煙草葉片 DNA OD260/OD280為1.73，表明DNA純度較高，濃度達(dá)到化g/yL，可用于后續(xù)啟動(dòng)子克隆。
[0031 ]根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期克隆獲得的化R12啟動(dòng)子的拼接序列，設(shè)計(jì)引物化R12-XhoI-primer-F(5'GCGCCGCTCGAGTAATACTACAATAATAATTAAG 3'），化R12- XbaI-primer-R(5' CGCTCTAGAGTTGTTGATATGTTTATGTTACTC 3'），按照下列的PCR體系進(jìn)行擴(kuò)增。該體系包括 32.化Ld地20，10μL10XPrimeSTARPCRBuffer(Mg2+plus)，4化dNTPMixture(各 2.5mmol)，：LyL 化RIS-XhoI-primer-F (10μηιο1)，：?μΙ 化R12- XbaI-p;rime;r-R(10ymol)，ly L 煙草〇0臟，0.5化 Prime STAR 服 DNA polymerase (2.5 υ/μL )，體系總體積為50化。
[0032] 將50化的PCR反應(yīng)體系混勻，均分為2管，每管各25化。PCR反應(yīng)條件為:98°C 5min 一（98°C 10s一53°C 15s一72°C 2mir〇5cycles一（98°C 10s一60°C 15s一72°C 2min) 23巧cles一72°C lOmin一4°C保存。
[0033] PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，連接至pMDlS-T Vector中，體系如下：5化 Solution 1,4.扣L DNA回收產(chǎn)物，0.5化PMD18-T Vector巧Ong/化），該體系總體積10化。 將各成分分別加入2(Κ)化的PCR管中，混勻，16°C過(guò)夜連接，約16-24h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸 桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，搖菌后涂于含抗生素 Amp的LB平板上，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12-16h。挑取單克隆經(jīng)PCR檢測(cè)后送往華大基因進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如SEQ ID N0.1。測(cè)序結(jié) 果正確的重組質(zhì)粒即為pMD18-NtR12。
[0034] 2.花生白襲蘆醇合酶基因 AhRESS的克隆 利用CTAB法提取花生葉片基因組DNA，W花生白襲蘆醇合酶基因特異引物AhRESS-Ba恤I-primer-F( 5' TCGTGGATCCGCCACCATGGTGTCTGTGAGTGGAATTC 3'），AhRESS-SacI- primer-lK5' TCCTGAGCTCTTATATGGCCACACTGCGGAGAACG 3'）進(jìn)行PCR檢測(cè)。其回收產(chǎn)物即為 花生AhRESS基因編碼框DNA序列。通過(guò)連接酶構(gòu)建在PMD18-T載體中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài) 細(xì)胞D冊(cè)α中，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果如SEQ ID NO.2。
[00巧]3.地I121-NtR12-AhRESS載體的構(gòu)建 WpCAMBIA-1301載體質(zhì)粒為模板，用帶有限制性酶切位點(diǎn)的特異引物(GUSAF-BamHI-Spel:日'aggaGGATCCACTAGTaccatggtagatctgagggtaaatttc3'和GUSAR-SacI-AscI-Swal: 5 ' aggagagctcGGCGCGCCTAAATTTAGAAATTCGAGCTGGTCACCTGT 3 '）進(jìn)行PCR，其回收產(chǎn)物即為 克隆得到的GUSA基因。將pBI 121載體利用BamM和SacI進(jìn)行酶切，切除該載體上的GUSA基 因，回收酶切后的載體條帶;將GUSA基因連接至酶切后的地1121載體上，得到地1121-GUSA 載體。
[0036] 將pMD 18-NtRl2載體利用限制性內(nèi)切酶SacI和BamHI進(jìn)行酶切，酶切體系如下：2.0 μg質(zhì)粒DNA，5.0化10XKbuffer，2.0μLSacI，2.0化BamHI，d地20補(bǔ)至50化，混勻，于37°C 消化酶切10-1化，反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果，回收目的條帶，獲得NtR12 啟動(dòng)子。
[0037] 利用限制性內(nèi)切酶Sac巧郵amHI將pBI 121 -GUSA載體進(jìn)行酶切，切除35S啟動(dòng)子，酶 切體系如下：2.0yg質(zhì)粒DNA，5.0化 10XK buffer，2.0yL Sacl，2.0化 BamHI，d地2〇補(bǔ)至50 yL，混勻，于37°C消化酶切1化，反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果。
[0038] 將化R12啟動(dòng)子連接至切除35S啟動(dòng)子的PBI121-GUSA載體中，連接反應(yīng)體系如下： Ι.ΟμΙ 10XT4ligase buffer,4.0化基因 DNA片段，4.0化載體DNA片段，1.0化 T4 DNA ligase，混勻，于16°C過(guò)夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，菌液涂布于含 抗生素 Kan的LB平板上，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14h。
[0039] 挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系如下：1.0化模板，2.0化10XPCR buffe;r，1.5yL 2.5mM dNTP，0.1 化普通Taq酶，0.5化 NtR12- XhoI-primer-F'O.SliL 化尺12-乂6日1可'山6'-3，14.4化(1地20。？〇?反應(yīng)條件為：94。〇5111111一（94。〇303一53。〇303 一72°C 2min巧巧cles一（94°C 30s一60°C 30s一72°C 2min)30巧cles一72°C lOmin一4°C 保存。對(duì)菌液PCR呈陽(yáng)性的部分菌液進(jìn)行擴(kuò)繁，用堿裂解法提取質(zhì)粒，然后進(jìn)行酶切單、雙檢 ^U，37°C酶切消化4 h，反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果。檢測(cè)結(jié)果正確的，送往 華大基因進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒即為地I121-NtR12-GUSA載體。
[0040] 將花生白襲蘆醇合酶基因 AhRESS連接至PMD18-T載體中，體系如下：5化 Solution 1,4.扣L DNA回收產(chǎn)物，0.5化PMD18-T Vector巧Ong/化），該體系總體積10化。 將各成分分別加入2(Κ)化的PCR管中，混勻，16°C過(guò)夜連接，約2地。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 感受態(tài)細(xì)胞DH5a中，搖菌后涂于含抗生素 Amp的LB平板上，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1地。挑 取單克隆經(jīng)PCR檢測(cè)后送往華大基因進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序