一種利用兩步擴增法檢測MicroRNA的方法
【專利說明】 —種利用兩步擴增法檢測M i c r oRN A的方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和核酸化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種利用滾環(huán)擴增-環(huán)介導(dǎo)等溫擴增兩步擴增法檢測MicroRNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]微小RNA(microRNAs)是一種約21-23個堿基的內(nèi)源非編碼小RNA，長度約為21-22個核苷酸，其長度變化范圍也可以從19到25個核苷酸不等。MicroRNA在體內(nèi)一般是由兩步酶解過程產(chǎn)生，最原始的是pr1-microRNA，長度大約為300?1000個堿基;pr1-microRNA經(jīng)過一次加工后，成為pre-microRNA即microRNA前體，長度大約為70?90個喊基;pre-microRNA再經(jīng)過Dicer酶酶切后，成為長約20?24nt的成熟microRNA。具體原理如下:pr1-microRNA經(jīng)過Drosha酶消化得到一個莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的pre_microRNA，Drosha酶存在于細胞核中，而Drosha催化的酶切過程也常在細胞的這一區(qū)域進行。Export in 5蛋白將pre-microRNA從核中轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)。隨后pre-microRNA被Dicer酶在細胞質(zhì)中剪切得到雙鏈RNA，解鏈后成為成熟的microRNA JicroRNA對靶基因mRNA的作用有三種方式:(1)切斷靶基因的mRNA分子；(2)抑制靶基因mRNA的翻譯；(3)結(jié)合抑制。研究發(fā)現(xiàn)microRNA可以作為重要的疾病標(biāo)志物，大量研究證實其與多種重大疾病息息相關(guān)，在很多疾病的早期階段，microRNA譜會有特征性的異常。因此如果能夠在microRNA變異的早期能夠及時地加以檢測，將會大大有助于重大疾病的早期預(yù)警、早期診斷以及預(yù)后治療。并且想要進一步確定microRNA在基因調(diào)控中的重要地位，關(guān)鍵是要迅速、準(zhǔn)確地定量檢測microRNA。
[0004]目前檢測Mi cr ο RNA的方法比較成熟主要有No r t h er η印跡分析、微點陣(microarray)分析和實時定量焚光PCR(quantitative Real-Time PCR)。Northern印跡分析和微點陣(microarray )需要的樣品大、檢出限高、線性范圍窄、分析周期長、特異性差，已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代分析要求。實時定量PCR較前兩者而言有明顯優(yōu)勢，需要樣品量少、檢出限較低、線性范圍寬，分析時間相對縮短，特異性高，已成為一種定量MicroRNA的標(biāo)準(zhǔn)方法。隨著時代發(fā)展，這三種檢測手段均已不能滿足人類需求，對于實際樣品的分析檢測亟需更靈敏的檢測手段。滾環(huán)擴增(RCA，rolling circle amplificat1n)是90年代中期發(fā)展出一種新的核酸等溫擴增方法，能實現(xiàn)105_109倍的擴增效率。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop-mediatedisothermal amplificat1n，LAMP)技術(shù)是2000年日本學(xué)者提出的一種適用于基因診斷的恒溫核酸擴增技術(shù)，能實現(xiàn)109?101()倍的核酸擴增效率，目前已發(fā)展成為成熟的疾病檢測技術(shù)。而我們的實驗則是運用一種巧妙的方法將滾環(huán)擴增技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)相結(jié)合，以期實現(xiàn)MicroRNA的超靈敏檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種microRNA特異性的超靈敏低背景的利用滾環(huán)擴增和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增兩步擴增法檢測microRNAs的方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下:
一種利用兩步擴增法檢測microRNA的方法，包括以下步驟:首先設(shè)計含有限制性內(nèi)切酶位點的線性滾環(huán)擴增模板，以目標(biāo)microRNA為連接探針將線性滾環(huán)擴增模板連接成環(huán)，并以成環(huán)的滾環(huán)擴增模板為引物進行滾環(huán)擴增，實現(xiàn)信號的第一步放大;然后將滾環(huán)擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶切割成相同的短單鏈，以上述短單鏈為模板進行環(huán)介導(dǎo)擴增，實現(xiàn)信號的第二步放大。
[0007]上述利用兩步擴增法檢測microRNA的方法具體包括以下步驟:
(1)首先針對目標(biāo)microRNA設(shè)個5’端磷酸化修飾的線性滾環(huán)擴增模板，所述的線性滾環(huán)擴增模板包括三個區(qū)段:與目標(biāo)microRNA—端互補的5’端區(qū)段、與目標(biāo)microRNA其余片段互補的3’端區(qū)段及含有一個限制性內(nèi)切酶位點的中間區(qū)段；
(2)模板環(huán)化過程:向含目標(biāo)microRNA的體系中加入DNA連接酶和5’端磷酸化修飾的線性滾環(huán)擴增模板，目標(biāo)microRNA與5 ’端磷酸化修飾的線性滾環(huán)擴增模板堿基互補配對使5’端磷酸化修飾的線性滾環(huán)擴增模板首尾相連，得到成環(huán)的滾環(huán)擴增模板；
(3)滾環(huán)擴增過程:以成環(huán)的滾環(huán)擴增模板為引物進行滾環(huán)擴增，得到滾環(huán)擴增產(chǎn)物；
(4)切割過程:用限制性內(nèi)切酶將滾環(huán)擴增產(chǎn)物切割成若干個完全相同的短單鏈；
(5)環(huán)介導(dǎo)等溫擴增過程:以步驟(4)所述的短單鏈為模板進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增，然后向環(huán)介導(dǎo)等溫擴增產(chǎn)物中加入DNA顯色劑，并用實時熒光定量PCR采集和分析擴增信號。
[0008]步驟(1)中所述的限制性內(nèi)切酶位點為EcoR頂每的酶切位點。
[0009]步驟(1)中所述的含有一個限制性內(nèi)切酶位點的中間區(qū)段為21nt。
[0010]步驟(2)所述的模板環(huán)化過程具體為:向含目標(biāo)microRNA的體系中加入DNA連接酶緩沖液和5 ’端磷酸化修飾的線性滾環(huán)擴增模板，22?37°C放置0.5?1小時;然后再加入DNA連接酶，16?37°C連接2?24小時，65°C滅活15 min。
[0011 ]步驟(3)所述的滾環(huán)擴增過程具體為:向體系中加入dNTP和DNA聚合酶，37°C擴增4-6 h，80°C滅活 15 min。
[0012]步驟(4)所述的切割過程具體為:向體系中加入與中間區(qū)段互補的限制性內(nèi)切酶互補序列，加水稀釋，95°C退火1個小時，最后加入限制性內(nèi)切酶，37°C酶切12?24小時，80°C滅活15 min。
[0013]步驟(5)所述的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增過程具體為:將環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的四種引物、擴增緩沖液加入到步驟(4)得到的短單鏈中，95°C加熱5 min，接著驟冷到4°C;接著加入dNTP、DNA聚合酶、DNA顯色劑，然后用超純水定容，立即在實時熒光定量PCR上面65°C實時監(jiān)控;根據(jù)出峰時間或者“S”曲線的拐點的時間，進行定量或者定性分析。
[0014]本發(fā)明的檢測原理如圖1所示，含目標(biāo)microRNA的體系中加入線性滾環(huán)擴增模板和DNA連接酶，滾環(huán)擴增模板的兩端分別與部分的microRNA互補配對，并且模板的5端是磷酸基團修飾，滾環(huán)擴增模板在DNA連接酶的作用下與作為連接探針的目標(biāo)microRNA連接成環(huán)，接著以成環(huán)的滾環(huán)擴增模板作為引物，在DNA聚合酶的作用下進行滾換擴增，實現(xiàn)信號的一級放大。
[0015]滾環(huán)擴增是以環(huán)狀DNA為模板，通過一個短的DNA引物(與部分環(huán)狀模板互補)，在酶催化下將dNTPs轉(zhuǎn)變成單鏈DNA，此單鏈DNA包含成百上千個重復(fù)的模板互補片段。因此以成環(huán)的滾環(huán)擴增模板為引物擴增出來的產(chǎn)物是一條包含成百上千個重復(fù)的環(huán)狀DNA模板序列的長單鏈DNA。我們在線性滾環(huán)擴增模板上設(shè)計了一個限制性內(nèi)切酶位點，在其與互補序列互補之后可被限制性內(nèi)切酶切割斷裂。
[0016]我們的第二部分實驗就是將第一次滾環(huán)擴增得到的長單鏈DNA切割成相同的短單鏈DNA，并以切割產(chǎn)生的短單鏈DNA為第二步擴增環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的模板，進行信號的二級放大，此步的信號由實時熒光定量PCR接收和分析。
[0017]本發(fā)明具有以下優(yōu)點和有益效果:
本發(fā)明中滾環(huán)擴增模板的設(shè)計可以根據(jù)不同的microRNA序列設(shè)計特定的模板，達到檢測不同種類的microRNA的檢測的目的。本發(fā)明的檢測方法具有很低的檢出限，可以檢測到濃度低至500 aM的microRNA，較同等條件下單步滾環(huán)擴增的檢出限200 pM而言，檢出限降低了很多。并且，對從Hela細胞中提取的總RNA進行分析，即使存在各種RNA干擾，對microRNA 21依然有很好的檢出能力，說明本發(fā)明的實驗方法具有良好的抗干擾能力，選擇性好。
【附圖說明】
[0018]圖1為利用滾換擴增和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增兩部擴增法檢測microRNA流程示意圖。
[0019]圖2為溫度條件優(yōu)化圖；從左到右依次代表55°C、60 °C、65 °C。
[0020]圖3為DNA聚合酶濃度條件優(yōu)化圖；從左到右依次代表DNA聚合酶的濃度為0.5U、0.25 U、0.125 U、0 U。
[0021]圖4、圖5為體外檢出限測定圖。
[0022]圖6、圖7為單步滾環(huán)擴增檢出限圖。
[0023]圖8、圖9為實際樣品檢出限圖。
【具體實施方式】
[0024]以下通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的說明。為了以示區(qū)分，將滾環(huán)擴增模板與目標(biāo)microRNA聚合所用的DNA聚合酶稱為DNA聚合酶1，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)中所用的DNA聚合酶稱為DNA聚合酶2。
[0025]實施例1
1.本發(fā)明中滾環(huán)擴增模板、限制性內(nèi)切酶切割位點的互補序列以及環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的四條引物的設(shè)計
(1)如圖1所示，DNA由sangon公司合成，滾環(huán)擴增模板為針對mi croRNA 21序列(5’_uagcuuaucagacugauguuga-3’)所設(shè)計，microRNA 21是一種重要的腫瘤標(biāo)志物。滾環(huán)擴增的模板包括三個部分，5’端和3’端分別和一半的microRNA互補區(qū)，該區(qū)域負責(zé)識別相應(yīng)的microRNA，形成DNA-RNA雜交的雙鏈結(jié)構(gòu)并且將滾環(huán)擴增模板首尾相連成環(huán)，模板的5 ’端為磷酸化修飾。滾環(huán)擴增模板的序列為5’-P04-CTG ΑΤΑ AGC TAC GAC TCT AGA GGA TCC CCGGGT ACG TTT CCG TGT GTA AAT TGT TAT CCGCT CAC ATC TCC ACA CAA GTA ACC TCT ATGATA TCG AAT TCT CGC TCC AAA CGC TGC AGGT GTG CGG GCC TCT T