改善纖維素轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)率的方法
【專利說明】改善纖維素轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)率的方法
[0001 ]本申請是申請人于2007年11月13日提交的題為“改善纖維素轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)率的方法”的中國專利申請200780042148.X的分案申請。
[0002]1.由聯(lián)邦政府資助研究開發(fā)的發(fā)明權(quán)利聲明
[0003]本工作部分由美國能源部基本合同號DE-AC36-99G0 10337下的國家可再生能源實驗室分包合同號ZC0-0-30017-01的合同提供資金。因此，美國政府可擁有本申請的某些權(quán)利。
[0004]2.相關(guān)申請的交叉引用
[0005]本申請要求于2006年11月13日提交的、美國臨時申請系列號60/858,579、題為“改善纖維素轉(zhuǎn)化過程產(chǎn)率的方法(Mehtod for Improving Yield of Cellulose Convers1nProcess)”的臨時申請的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容在此通過引用并入本文。
3.發(fā)明領(lǐng)域
[0006]本發(fā)明涉及改善纖維素物質(zhì)的酶促轉(zhuǎn)化中期望的糖的產(chǎn)率的方法。
[0007]4.發(fā)明背景
[0008]由纖維素物質(zhì)生產(chǎn)糖，以及其后的發(fā)酵和將這些糖蒸餾進入乙醇中的技術(shù)在一段時間前即為已知。其較早的發(fā)展主要出現(xiàn)在二次世界大戰(zhàn)期間，當(dāng)時燃料對于德國、日本和蘇聯(lián)這樣的國家非常珍貴。早期的方法主要集中在酸水解上，但其工程和設(shè)計相當(dāng)復(fù)雜，且對于過程變量如溫度、壓力和酸濃度上小的變化非常敏感?！癙roduct1n of Sugars FromWood Using High-Pressure Hydrogen Chloride,>,B1technology and B1engineering，卷XXV，2757-2773(1983)中對這些早期方法有廣泛討論。
[0009]二次世界大戰(zhàn)到1970年代早期，石油的豐富供應(yīng)減緩了對乙醇轉(zhuǎn)化的研究。然而，由于1973的石油危機，研究者更多地致力于研發(fā)用木材和農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品生產(chǎn)乙醇作為替代能源的方法。此研究對于將乙醇發(fā)展為汽油添加物以減輕美國對于外國石油生產(chǎn)的依賴、提高燃料的辛烷值、降低作為環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)的排氣污染物尤為重要。
[0010]隨著當(dāng)前所知的“石油危機”，美國環(huán)境保護局(the Environmental Proctect1nAgency of the United States)公布了必須減少鉛添加物的條例，以減少空氣污染。在乙醇實質(zhì)上可以取代鉛的情況下，一些精煉廠選擇了乙醇作為代用品，特別是它可以輕易地引入精煉廠的操作中，而無須昂貴的資本設(shè)備投入。
[0011]除了改善幾十年前研發(fā)的高壓高溫的氣體糖化作用方法之外，當(dāng)前的研究主要集中在酶促轉(zhuǎn)化過程。這些方法使用來自多種生物、可將纖維素降解為可發(fā)酵的糖的酶，這樣的生物如嗜中溫和嗜熱真菌、酵母和細菌。對于這些方法和其擴大至商業(yè)化的能力以及乙醇生產(chǎn)的低效率，都仍存在不確定性。
[0012]纖維素和半纖維素是由光合作用產(chǎn)生的最豐富的植物材料。其可以被許多微生物降解而用作能量來源，這樣的微生物包括細菌、酵母和真菌，它們產(chǎn)生的胞外酶能夠?qū)⒕酆系孜锼鉃閱误w糖(Aro等人，2001)。生物體對于使用哪些糖通常是有限制的，這決定了在轉(zhuǎn)化過程中最好生產(chǎn)哪些糖。隨著對不可再生資源的限制的鄰近，纖維素成為主要的可再生能源的潛力是巨大的(Krishna等人，2001)。通過生物學(xué)方法有效利用纖維素是克服食物、飼料和燃料短缺的的一個途徑(Ohmiya等人，1997)。
[0013]纖維素酶是水解纖維素(β-1，4_葡聚糖或即_糖苷鍵)使之形成葡萄糖、纖維二糖、纖維寡糖等的酶。纖維素酶慣例上分為三個主要類別:內(nèi)切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)( “EG” )、外切葡聚糖酶或稱纖維二糖水解酶(EC 3.2.1.91)( “CBH”)和β-葡糖苷酶([i3]-D-葡糖苷葡糖水解酶([P]-D_glucoside glucohydrolase) ；EC 3.2.1.21)( “BG” )。(Knowles等人，1987和Shulein，1988)。內(nèi)切葡聚糖酶主要作用于纖維素纖維的非結(jié)晶部分，而纖維二糖水解酶還可以降解晶態(tài)纖維素。
[0014]在處理機械紙漿(Pere等人，1996)、用作飼料添加物(W0 91/04673)和在谷物濕磨中，纖維素酶也已被證實可用于將纖維素生物質(zhì)降解為乙醇(其中纖維素酶將纖維素降解為葡萄糖，酵母或其它微生物再將葡萄糖發(fā)酵為乙醇)。單獨糖化和發(fā)酵為這樣的過程，其中生物質(zhì)例如玉米秸桿中的纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖，然后酵母菌株將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇。同時糖化和發(fā)酵為這樣的過程，其中生物質(zhì)例如玉米秸桿中的纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖，同時在同一反應(yīng)器中，酵母菌株將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乙醇。由輕易可得的纖維素來源所生產(chǎn)的乙醇提供了穩(wěn)定、可更新的燃料來源。
[0015]已知有許多細菌、酵母和真菌產(chǎn)生纖維素酶。某些真菌產(chǎn)生能夠降解結(jié)晶形式纖維素的完整纖維素酶系(即完整纖維素酶)。為了將晶態(tài)纖維素有效地轉(zhuǎn)化為葡萄糖，需要完整纖維素酶系包含各來自CBH、EG和BG類別的成分，還包含對于水解晶態(tài)纖維素作用較少的單獨的成分(Filho等人，1996)。特別地，EG型纖維素酶和CBH型纖維素酶的組合相互作用，比單獨使用任一種酶能更有效地降解纖維素(Wood，1985; Baker等人，1994;及Nieves等人，1995)。
[0016]此外，本領(lǐng)域已知纖維素酶可用于處理紡織品以提高洗滌劑組合物的清潔能力，用作軟化劑，用于改善棉織物的觸感和外觀等(Kumar等人，1997)。對于清潔性能提高的(美國專利號4，435，307;英國申請?zhí)?，095，275和2，094，826)和用于處理織物改善紡織品觸感和外觀的含纖維素酶的洗滌劑組合物(美國專利號5，648，263、5，691，178和5，776，757，及英國申請?zhí)?，358，599)已有所描述。
[0017]因此，真菌和細菌中產(chǎn)生的纖維素酶受到了重大關(guān)注。特別地，已證實木霉屬物種(Trichoderma spp.)(例如長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)或里氏木霉(Trichoderma reesei))的發(fā)酵產(chǎn)生能夠降解結(jié)晶形式纖維素的完整纖維素酶系。多年來，木霉屬纖維素酶的生產(chǎn)已通過經(jīng)典誘變、篩選、選擇和高度改進的、大規(guī)模廉價發(fā)酵條件的發(fā)展得到了改進。木霉屬物種的多成分纖維素酶系能將纖維素水解為葡萄糖，還有來自其它微生物，特別是細菌菌株的具有不同性質(zhì)、用于有效水解纖維素的纖維素酶，并且在絲狀真菌中表達這些蛋白質(zhì)用于工業(yè)規(guī)模的纖維素酶生產(chǎn)將十分有利。然而，許多研究結(jié)果表明絲狀真菌中細菌酶的產(chǎn)率低(Jeeves等人，1991)。
[0018]可溶性糖，如葡萄糖和纖維二糖，在工業(yè)中對于生產(chǎn)化學(xué)產(chǎn)品和生物產(chǎn)品有許多用途。纖維素水解的優(yōu)化使得可以使用更少量的酶，提高生產(chǎn)可溶性糖的成本效益。盡管研發(fā)了許多方法，本領(lǐng)域中仍需改善由纖維素物質(zhì)獲得的可溶性糖的產(chǎn)率。
[0019]5.發(fā)明簡述
[0020]本發(fā)明提供了通過在處于或約為纖維素酶的熱變性溫度的溫度下，將纖維素底物或預(yù)處理的纖維素底物與纖維素酶進行孵育，提高由纖維素起始材料的酶促糖化作用得到的可溶性糖的產(chǎn)率的方法。本發(fā)明還提供了通過在處于或約為纖維素酶的熱變性溫度的溫度下，將纖維素底物或預(yù)處理的纖維素底物與纖維素酶進行孵育，提高由纖維素起始材料的酶促糖化作用得到的葡萄糖產(chǎn)率的方法。
[0021]本發(fā)明還提供了將纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖的方法，其通過組合纖維素物質(zhì)與纖維素酶，將纖維素物質(zhì)和纖維素酶的組合在高于約38°C的溫度進行孵育，以引起水解反應(yīng)，將至少20%所述纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可溶性糖，其中葡萄糖的組分相對于可溶性糖至少為
0.75。本發(fā)明還提供了將纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化為纖維二糖的方法，其通過組合纖維素物質(zhì)與包含內(nèi)切葡聚糖酶1的酶混合物，孵育纖維素物質(zhì)和纖維素酶的組合以引起水解反應(yīng)，將達50%的纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可溶性糖，其中葡萄糖的組分相對于所述可溶性糖少于約0.5。
[0022]纖維素酶可以是由微生物產(chǎn)生的完整纖維素酶、纖維素酶混合物或其組合，所述微生物來自曲霉屬(Aspergillus )、木霉屬、鐮孢屬(Fusarium)、金小孢子屬(Chrysosporium)、青霉屬(Penicillium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、脈抱菌屬(Neurospora)、或其可選的有性型如裸孢殼屬(Emericella)和肉座菌屬(Hypocrea)(見Kuhls等人，1996)。優(yōu)選地，可以使用物種如解纖維熱酸菌(Acidothermus cellulolyticus)、嗜熱放線菌(Thermobif ida fusca)、灰腐質(zhì)霉(Humicola grisea)或里氏木霉。
[0023]本文提供了本發(fā)明的這些特點和其它特點。
[0024]6.附圖簡述
[0025]技術(shù)人員會理解附圖目的僅為舉例說明，而非旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。