一種制備及純化依諾肝素鈉的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體地涉及一種依諾肝素鈉的生產(chǎn)及純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肝素自上世紀(jì)80年代以來一直是預(yù)防和治療血栓類藥物的首選藥物。低分子肝素是由普通肝素通過特異性的化學(xué)切割和純化分離制成，由于其療效確切，副作用小而且可預(yù)測等優(yōu)點(diǎn)，逐步取代了傳統(tǒng)肝素的市場地位。
[0003]依諾肝素鈉(Enoxaparin Sodium)屬于低分子肝素，主要特征為分子中有一個(gè)4_烯吡喃糖醛酸結(jié)構(gòu)。本品抗血栓作用強(qiáng)、出血危險(xiǎn)性小，是目前抗凝血、抗血栓形成的主要治療藥物之一。
[0004]依諾肝素鈉通過對豬腸黏膜肝素的芐基酯衍生物進(jìn)行堿解聚而獲得，其基本步驟為:以豬黏膜肝素為起始原料，經(jīng)肝素季銨鹽制備、肝素芐酯制備、對肝素芐酯進(jìn)行堿解聚，以酸中和、醇沉淀，精制、脫色，脫水干燥，得到依諾肝素鈉成品。其中，在酸中和、醇沉淀后得到的依諾肝素鈉中間體，其澄清度往往很差，如果不加以精制純化，就無法達(dá)到藥典中澄清度的要求。
[0005]現(xiàn)有的純化方法主要分為以下幾種:(1)將依諾肝素鈉用活性炭脫色，經(jīng)大孔樹脂過濾，濾液凍干得到純化依諾肝素鈉，該方法脫色效果較好，但缺點(diǎn)是會有大量的產(chǎn)品吸附在活性炭和樹脂中，收率僅能達(dá)到60%左右；(2)將依諾肝素鈉用氫氧化鈉調(diào)pH，用雙氧水脫色，經(jīng)氯化鈉和乙醇洗滌后凍干，得到純化依諾肝素鈉，該方法需要用到氧化性極強(qiáng)的雙氧水，在除去色素的同時(shí)容易導(dǎo)致其他副產(chǎn)物的產(chǎn)生，并且對環(huán)境污染較大，很難達(dá)到環(huán)評要求;(3)將依諾肝素鈉依次通過疏水層析柱和陰離子交換樹脂，經(jīng)納濾脫鹽后，沉淀、干燥獲得純化的依諾肝素鈉，該方法需過多次層析柱，產(chǎn)品損耗很大；(4)將依諾肝素鈉依次通過過濾、微濾和超濾裝置，凍干后得到純化依諾肝素鈉，該方法產(chǎn)品損失較小，但這種分級超濾的操作壓力較大，不適宜在工業(yè)上應(yīng)用；(5)將依諾肝素鈉用氯化鈉溶液和甲醇反復(fù)處理，最終獲得澄清度達(dá)標(biāo)的依諾肝素鈉，該方法操作簡便，容易在工業(yè)上實(shí)現(xiàn)，但其純化效果較差，而且每次反復(fù)處理的次數(shù)難以準(zhǔn)確確定，不利于生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的建立。
[0006]由于依諾肝素鈉廣闊的市場前景和現(xiàn)有純化技術(shù)存在諸多弊端，開發(fā)一種能夠適合工業(yè)生產(chǎn)使用的、快速簡便的純化依諾肝素鈉的方法就成為了亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種收率高、操作簡便的提高依諾肝素鈉純度的方法。
[0008]—種依諾肝素鈉制備及純化的方法，其特征在于，包括以下步驟:
(1)將依諾肝素鈉粗品，放入氯化鈉溶液中溶解，得到依諾肝素鈉粗品溶液，過濾；
(2)將步驟(1)所得濾液經(jīng)離心分離，得上清液和沉淀物；
(3)將乙醇或甲醇加入到步驟(2)中獲得的上清液中，攪拌并靜置后得到沉淀物；
(4)將沉淀物用純化水溶解成10wt?15wt%的溶液，用0.Ιμπι濾膜過濾后，噴霧干燥得依諾肝素鈉成品。
[0009]步驟(I)中氯化鈉溶液的濃度為5-15%，依諾肝素鈉粗品與氯化鈉溶液的重量/體積比為1:5-10。
[0010]步驟(2)中離心分離的轉(zhuǎn)速為100CK3000 r/min，離心時(shí)間為1min?60min。
[0011]步驟(3)中乙醇或甲醇與上清液的體積比為1-5:1，攪拌時(shí)間為I?3h，靜置時(shí)間為3-10ho
[0012]研究發(fā)現(xiàn)，影響依諾肝素鈉澄清度的雜質(zhì)主要來源于肝素鈉中的大分子蛋白和小分子的寡糖，這些雜質(zhì)在依諾肝素鈉的制備過程中，其分子中的醛基經(jīng)“美拉德反應(yīng)”會產(chǎn)生有色物質(zhì)。本發(fā)明先采用高速低溫離心除去了大分子的蛋白，再通過醇沉法除去寡糖等小分子雜質(zhì)，從而達(dá)到了純化依諾肝素鈉的目的。
[0013]與現(xiàn)有純化方法相比，本發(fā)明所述方法收率可達(dá)90%以上，且產(chǎn)品澄清度好，純化操作簡便，非常適合制藥工業(yè)生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
實(shí)施例1:依諾肝素鈉粗品的制備步驟(I):肝素芐索氯銨鹽的制備
在反應(yīng)罐中投入肝素鈉Ikg和純化水20L，攪拌約20分鐘，溶解完全后，轉(zhuǎn)移到消去罐中。在反應(yīng)罐中投入芐索氯銨2.5kg和純化水20L，攪拌約20分鐘，溶解完全后，將芐索氯銨溶液抽入消去罐中，攪拌反應(yīng)30分鐘。將補(bǔ)充的純化水60L加入消去罐中，繼續(xù)攪拌10分鐘，靜置30分鐘。將反應(yīng)混合液過濾，濾餅用純化水打漿3次(50kg、50kg、60kg)。收集濾餅，在600C 土 2°C熱水、真空度大于0.0SMPa下真空干燥10小時(shí)，得肝素芐索氯銨鹽2.lkg。
[0015]步驟(2):肝素芐基酯的制備
在潔凈干燥的酯化罐中投入肝素芐索氯銨鹽2.1kg和二氯甲烷20L，攪拌狀態(tài)下升溫至35°C ± 1°C，保溫反應(yīng)I小時(shí)。投入氯化芐9kg，繼續(xù)保溫反應(yīng)25小時(shí)。反應(yīng)畢，加入醋酸鈉-甲醇溶液，加畢繼續(xù)反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)液過濾，濾餅用甲醇打漿2次，再洗滌一次。收集濾餅，在室溫下真空干燥10小時(shí)，得肝素芐基酯1.3kg。
[0016]步驟(3):肝素芐基酯的降解
在降解罐中投入肝素芐基酯1.31^和純化水101^攪拌狀態(tài)下升溫至60°〇±2°〇。在配堿罐中投入氫氧化鈉150g和純化水1L，攪拌溶解，控溫至60°C±2°C。將配堿罐中的氫氧化鈉溶液抽入降解罐中，保溫反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)畢，冷卻至室溫，滴加2N鹽酸酸化，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至6?7，繼續(xù)攪拌5分鐘，過濾。濾液中加入氯化鈉0.5kg，攪拌30分鐘，溶解完全后轉(zhuǎn)移到沉淀罐中，加入5L甲醇，加畢，繼續(xù)攪拌5分鐘，過濾，收集濾餅，干燥得依諾肝素鈉粗品1.1kg。
[0017]實(shí)施例2依諾肝素鈉的純化
將實(shí)施例1制備得到的依諾肝素鈉粗品1.1kg放入5L 10%的氯化鈉溶液中攪拌溶解，得到依諾肝素鈉粗品溶液，過濾得到濾液。將濾液在2000 r/min的離心機(jī)中30min，得上清液和沉淀物。將1L乙醇加入到上清液中，攪拌Ih后靜置3h，得沉淀物。將沉淀物用純化水溶解成1wt?15wt%的溶液，用0.Ιμπι濾膜過濾后，噴霧干燥得依諾肝素鈉成品1.02kg，純化收率92.7%0
[0018]實(shí)施例3依諾肝素鈉的純化
將實(shí)施例1制備得到的依諾肝素鈉粗品1.lkg放入10L 5%的氯化鈉溶液中攪拌溶解，得到依諾肝素鈉粗品溶液，過濾得到濾液。將濾液在2000 r/min的離心機(jī)中30min，得上清液和沉淀物。將10L甲醇加入到上清液中，攪拌1.5h后靜置5h，得沉淀物。將沉淀物用純化水溶解成10wt?15wt%的溶液，用0.Ιμπι濾膜過濾后，噴霧干燥得依諾肝素鈉成品1.01 kg，純化收率91.8%0
[0019]實(shí)施例4成品檢驗(yàn)
按照歐洲藥典8.0(EP 8.0)記載的方法對本發(fā)明制備得到的依諾肝素鈉成品進(jìn)行了檢測:重均分子量:4350-4500
小于2000的分子量:14%-18%
2000-8000 分子量:72%-77%
抗Xa效價(jià):106-120 IU/mg 抗Ila效價(jià):25-29 IU/mg 抗Xa與抗Ila的比為:3.5-4.0 pH:6.5-7.0 231nm 吸光度:17-18 苯甲醇?xì)埩?〈0.05%
鈉含量:11.5%-12.5%
澄清度:淺于1號濁度標(biāo)準(zhǔn)液
以上指標(biāo)均達(dá)到了EP 8.0的標(biāo)準(zhǔn)，尤其是澄清度一項(xiàng)，遠(yuǎn)高于EP 8.0中記載的不高于6號濁度標(biāo)準(zhǔn)液的要求。
[0020]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種依諾肝素鈉制備及純化的方法，其特征包括如下步驟: (1)將依諾肝素鈉粗品放入氯化鈉溶液中溶解，得到依諾肝素鈉粗品溶液，過濾； (2)將步驟(I)所得濾液經(jīng)離心分離，得上清液和沉淀物； (3)將乙醇或甲醇加入到步驟(2)中獲得的上清液中，攪拌并靜置后得到沉淀物； (4 )將沉淀物用純化水溶解成I Owt?15的％的溶液，用0.Ιμπι濾膜過濾后，噴霧干燥得依諾肝素鈉成品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種依諾肝素鈉制備及純化的方法，其中的依諾肝素鈉粗品制備方法為: (1)肝素芐索氯銨鹽的制備:在反應(yīng)罐中投入肝素鈉Ikg和純化水20L，攪拌約20分鐘，溶解完全后，轉(zhuǎn)移到消去罐中；在反應(yīng)罐中投入芐索氯銨2.5kg和純化水20L，攪拌約20分鐘，溶解完全后，將芐索氯銨溶液抽入消去罐中，攪拌反應(yīng)30分鐘;將補(bǔ)充的純化水60L加入消去罐中，繼續(xù)攪拌10分鐘，靜置30分鐘；將反應(yīng)混合液過濾，濾餅用純化水打漿3次，收集濾餅，在60°C 土 2°C熱水、真空度大于0.0SMPa下真空干燥10小時(shí)，得肝素芐索氯銨鹽2.lkg； (2)肝素芐基酯的制備:在潔凈干燥的酯化罐中投入肝素芐索氯銨鹽2.1kg和二氯甲烷20L，攪拌狀態(tài)下升溫至35°C 土 1°C，保溫反應(yīng)I小時(shí)，投入氯化芐9kg，繼續(xù)保溫反應(yīng)25小時(shí)，反應(yīng)畢，加入醋酸鈉-甲醇溶液，加畢繼續(xù)反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)液過濾，濾餅用甲醇打漿2次，再洗滌一次，收集濾餅，在室溫下真空干燥10小時(shí)，得肝素芐基酯1.3kg; (3)肝素芐基酯的降解:在降解罐中投入肝素芐基酯1.3kg和純化水10L，攪拌狀態(tài)下升溫至60°C±2°C;在配堿罐中投入氫氧化鈉150g和純化水1L，攪拌溶解，控溫至60°C±2°C;將配堿罐中的氫氧化鈉溶液抽入降解罐中，保溫反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)畢，冷卻至室溫，滴加2N鹽酸酸化，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至6?7，繼續(xù)攪拌5分鐘，過濾，濾液中加入氯化鈉0.5kg，攪拌30分鐘，溶解完全后轉(zhuǎn)移到沉淀罐中，加入5L甲醇，加畢，繼續(xù)攪拌5分鐘，過濾，收集濾餅，干燥得依諾肝素鈉粗品1.lkg。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種依諾肝素鈉制備及純化的方法，其特征在于:步驟(I)中氯化鈉溶液的濃度為5-15%，依諾肝素鈉粗品與氯化鈉溶液的重量與體積比為1:5-10。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種依諾肝素鈉制備及純化的方法，其特征在于:步驟(2)中離心分離的轉(zhuǎn)速為1000?3000 r/min，離心時(shí)間為1min?60min。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種依諾肝素鈉制備及純化的方法，其特征在于:步驟(3)中乙醇或甲醇與上清液的體積比為1-5:1，攪拌時(shí)間為I?3h，靜置時(shí)間為3-10h。6.根據(jù)權(quán)利要求所述的一種依諾肝素鈉制備及純化的方法，生產(chǎn)出的精品肝素鈉的特征為:重均分子量:4350-4500；小于2000的分子量:14%_18%;2000-8000分子量:72%-77% ；抗Xa效價(jià):106-120 IU/mg；抗IIa效價(jià):25-29 IU/mg；抗Xa與抗IIa的比為3.5-4.0; pH:6.5-7.0 231nm;吸光度:17-18 ;苯甲醇?xì)埩?〈0.05% ;鈉含量:11.5%_12.5%;澄清度:淺于I號濁度標(biāo)準(zhǔn)液。
【專利摘要】本發(fā)明是一種依諾肝素鈉制備及純化的方法，依諾肝素鈉的粗品在經(jīng)離心分離和醇沉除雜后，就可以得到滿足藥典標(biāo)準(zhǔn)的依諾肝素鈉成品。本發(fā)明收率高、操作簡便，產(chǎn)品澄清度好，可以滿足制藥工業(yè)的需要。
【IPC分類】C08B37/10
【公開號】CN105440163
【申請?zhí)枴緾N201510882503
【發(fā)明人】劉冠男, 劉忠凱, 遲培升
【申請人】青島九龍生物醫(yī)藥有限公司
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2015年12月7日