專利名稱：一種依諾肝素鈉的純化生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種低分子肝素鈉的純化生產(chǎn)方法，特別地，涉及一種依諾肝素鈉的純化生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
依諾肝素鈉英文名為enoxaparin sodium，根據(jù)歐洲藥典4的定義，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下 其中，n為1-21的整數(shù)，R為H或SO3Na，R’為H或SO3Na或CO-CH3，當(dāng)R2為H時(shí)R3為CO2Na或者當(dāng)R2為CO2Na時(shí)R3為H。
根據(jù)歐洲藥典4的規(guī)定，依諾肝素鈉屬于低分子肝素家族中的一員，系用豬腸黏膜中提取的肝素鈉鹽經(jīng)芐基酯化后堿性解聚而得，平均分子量為4500道爾頓左右，主要特征為在分子的非還原端有一個(gè)4-烯醇吡喃糖醛酸結(jié)構(gòu)。
依諾肝素的主要作用機(jī)制在于本品通過與抗凝血酶III及其復(fù)合物結(jié)合，加強(qiáng)對(duì)Xa因子和凝血酶(IIa因子)的抑制作用。但由于本品分子鏈較短，對(duì)抗Xa活性較強(qiáng)而久，對(duì)凝血酶抑制作用較弱，抗血栓形成活性強(qiáng)于抗凝血活性。與普通肝素相比，本品具有抗血栓作用強(qiáng)，出血危險(xiǎn)性小，生物利用度高，半衰期長，使用方便等優(yōu)點(diǎn)，因而深受醫(yī)生和患者青睞。依諾肝素現(xiàn)在全球肝素類藥物市場(chǎng)中擁有最多的適應(yīng)證，包括
(1)預(yù)防因病而致活動(dòng)有限患者發(fā)生的深度靜脈血栓(此適應(yīng)證雖遲至2001年才在美國獲得批準(zhǔn)，但這類患者人數(shù)估計(jì)卻高達(dá)每年1300萬人左右)；(2)預(yù)防腹部手術(shù)后存在血栓栓塞并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)的患者發(fā)生的深度靜脈血栓；(3)預(yù)防髖部置換術(shù)后患者發(fā)生的深度靜脈血栓；(4)預(yù)防膝置換術(shù)后患者發(fā)生的深度靜脈血栓；(5)與阿司匹林(aspirin)合用預(yù)防不穩(wěn)定型心絞痛和無Q波心肌梗塞患者發(fā)生的動(dòng)脈血栓(此類患者人數(shù)全球估計(jì)有200萬人)；(6)與華法林(warfarin)合用用于有或無肺栓塞之急性深度靜脈血栓的住院患者；(7)與華法林合用用于無肺栓塞之急性深度靜脈血栓的門診患者。
另外，安萬特(Aventis)公司來我國申請(qǐng)了兩個(gè)依諾肝素在治療大腦缺血(CN01803471.3)和預(yù)防及治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷(CN98805489.2)的方法專利。
目前世界上生產(chǎn)低分子肝素鈉的方法有物理分級(jí)法(FR2440376、US4692435、FR2453875等)、化學(xué)裂解法(EP14184、EP37319、EP347588、US4629699、EP380943等)和酶法(EP64452、US4826827、EP244236等)。依諾肝素由于其特殊的結(jié)構(gòu)，采用的是堿裂解法。有關(guān)依諾肝素的生產(chǎn)工藝，已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道。例如，US4692435公開了肝素的前期制備工藝，主要用于去除肝素原料中的硫酸軟骨素。US4440926報(bào)道了利用季銨鹽酯化肝素的生產(chǎn)工藝。US5389618報(bào)道了一種依諾肝素的生產(chǎn)工藝，主要過程包括肝素鈉的預(yù)處理、肝素鈉季銨鹽的制備、肝素芐基酯的制備(酯化程度在9.5％-14％之間)以及在堿性條件下解聚肝素芐基酯衍生物得到依諾肝素成品。
但是，上述文獻(xiàn)均未提及一個(gè)重要的生產(chǎn)工藝問題，即在依諾肝素生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生一些有色雜質(zhì)，目前還不清楚這些雜質(zhì)的物質(zhì)結(jié)構(gòu)，而且很難用常規(guī)手段分離出這些有色雜質(zhì)。而依諾肝素鈉的色素問題是影響依諾肝素鈉成品質(zhì)量的重要指標(biāo)，藥物溶液的顏色及其與規(guī)定顏色的差異能在一定程度上反映藥物的純度。歐洲藥典4規(guī)定依諾肝素10％水溶液(重量體積比)的溶液顏色為黃色標(biāo)準(zhǔn)5號(hào)色((有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)色的規(guī)定，可參考European Pharmacopoeia 4中2.2.2節(jié)“degree of coloration of liquids”中的有關(guān)規(guī)定)，這對(duì)依諾肝素鈉的生產(chǎn)工藝提出較高的要求。由于依諾肝素是親水性多糖，一般的純化工藝如活性炭吸附盡管可以脫掉部分色素，但殘留色素?zé)o法再進(jìn)一步分離，無法達(dá)到歐洲藥典4的標(biāo)準(zhǔn)；而化學(xué)脫色法則容易破壞依諾肝素的結(jié)構(gòu)，從而影響依諾肝素成品的質(zhì)量。因此，需要采用新的純化工藝來解決這一技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種依諾肝素鈉的純化生產(chǎn)方法，應(yīng)用該方法生產(chǎn)出的依諾肝素鈉符合歐洲藥典4的規(guī)定。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)在水媒介中用長鏈季銨鹽鹽化肝素，芐基酯化上述被鹽化的肝素，控制其酯化程度在9.5％-14％之間，然后在堿性條件下解聚上述酯化程度在9.5％-14％之間的肝素，得到依諾肝素鈉粗品。
根據(jù)上述工藝制備的依諾肝素鈉粗品，其顏色為黃褐色，需要進(jìn)行脫色。發(fā)明人經(jīng)過對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，將依諾肝素鈉粗品上樹脂柱脫色可以有效解決依諾肝素鈉的色素問題，尤其大孔吸附樹脂脫色效果明顯。大孔吸附樹脂中脫色效果較好的種類如羅門哈斯公司(Rohm Haas)生產(chǎn)的AMBERLITE系列，如極性大孔聚烷酯吸附樹脂XAD-7HP，非極性大孔聚苯乙烯吸附樹脂XAD-1600等；南開大學(xué)化工廠生產(chǎn)的非極性大孔聚苯乙烯吸附樹脂H1020、H103和D4006等，其中優(yōu)選非極性大孔聚苯乙烯吸附樹脂H103。
進(jìn)一步的，可將樹脂脫色和活性炭脫色結(jié)合起來，能夠?qū)σ乐Z肝素鈉中的色素進(jìn)行有效分離。例如，先將粗品用活性炭進(jìn)行吸附，再上柱用大孔吸附樹脂脫色；或者粗品先上柱用大孔吸附樹脂脫色，再用活性炭吸附脫色。
本發(fā)明的有益效果是，利用活性炭和大孔吸附樹脂組合法對(duì)依諾肝素鈉進(jìn)行脫色，可有效分離有色雜質(zhì)，使依諾肝素鈉成品達(dá)到或優(yōu)于歐洲藥典4規(guī)定的黃色標(biāo)準(zhǔn)5號(hào)色，而常規(guī)方法如僅用活性炭脫色無法使依諾肝素鈉成品達(dá)到歐洲藥典4規(guī)定的黃色標(biāo)準(zhǔn)5號(hào)色；另外，該方法經(jīng)濟(jì)實(shí)用，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，而且不會(huì)對(duì)依諾肝素鈉的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，這要比化學(xué)脫色法優(yōu)越的多。
具體實(shí)施例方式
肝素鈉首先需要經(jīng)過解聚成為平均分子量在3500-5500道爾頓之間的依諾肝素鈉粗品，其技術(shù)方案為肝素鈉先通過乙醇沉淀，利用雜質(zhì)和肝素鈉在乙醇中沉淀溶解度不同，減少肝素鈉原料中硫酸軟骨素和硫酸乙酰肝素的含量。然后，在水介質(zhì)中用長鏈四價(jià)銨鹽(例如芐乙銨)鹽化肝素鈉，生成肝素鈉季銨鹽沉淀。肝素鈉季銨鹽在二氯甲烷中和氯芐發(fā)生酯化反應(yīng)，控制酯化程度在9.5％-14％之間，酯化率的測(cè)定可參考US5389618說明書第五欄44-48行的方法，即取m克肝素芐基酯水解，測(cè)定生成的苯甲醇含量為n克，n/m所得的比值即為酯化率，經(jīng)沉淀、過濾、洗滌、干燥后得到肝素芐基酯。將肝素芐基酯溶于水，加入適量氫氧化鈉，于60-65℃反應(yīng)1-3個(gè)小時(shí)，用鹽酸中和，加入氯化鈉，乙醇沉淀后，過濾干燥即得依諾肝素鈉粗品，其顏色為褐黃色。
依據(jù)該生產(chǎn)工藝，最后得到的依諾肝素鈉為硫酸肝素多糖的不同種類的混合物，混合物的基本組成為9％-20％的多糖鏈分子量小于2000道爾頓，5％-20％的多糖鏈分子量大于8000道爾頓，60％-86％的多糖鏈的分子量在2000-8000道爾頓之間，其平均分子量在3500-5500道爾頓之間。
進(jìn)一步的，根據(jù)歐洲藥典4標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)選依諾肝素鈉中混合物的基本組成為12％-20％的多糖鏈分子量小于2000道爾頓，，68％-88％的多糖鏈的分子量在2000-8000道爾頓之間，其平均分子量在3500-5500道爾頓之間。
根據(jù)上述工藝生產(chǎn)出的依諾肝素鈉，不可避免的會(huì)產(chǎn)生色素問題。脫色可采用活性炭脫色法和樹脂脫色法組合進(jìn)行。將依諾肝素鈉加水溶解后，經(jīng)活性炭脫色，再上樹脂柱，凍干后，即可得到符合歐洲藥典4標(biāo)準(zhǔn)的依諾肝素鈉成品；或者將依諾肝素鈉樣品先上樹脂柱，經(jīng)收集目標(biāo)組分、沉淀、過濾后，再經(jīng)活性炭脫色，經(jīng)沉淀凍干后，即可得到符合歐洲藥典4標(biāo)準(zhǔn)的依諾肝素鈉成品，各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)可參考?xì)W洲藥典4依諾肝素標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定。
上述的樹脂可選用大孔吸附樹脂中脫色效果較好的種類，如羅門哈斯公司(Rohm Haas)生產(chǎn)的AMBERLITE系列，如極性大孔聚烷酯吸附樹脂XAD-7HP，非極性大孔聚苯乙烯吸附樹脂XAD-1600等；南開大學(xué)化工廠生產(chǎn)的非極性大孔聚苯乙烯吸附樹脂H1020、H103和D4006等。其中，優(yōu)選南開大學(xué)化工廠生產(chǎn)的非極性大孔聚苯乙烯吸附樹脂H103，其各項(xiàng)技術(shù)參數(shù)如下所示


為進(jìn)一步闡明本發(fā)明，提供以下利用大孔吸附樹脂和活性炭對(duì)依諾肝素鈉進(jìn)行脫色的實(shí)例。
實(shí)施例1、依諾肝素鈉的制備1.1在水媒介中用長鏈季銨鹽鹽化肝素稱取肝素原料100g和20g氯化鈉溶于1L水，室溫下慢慢加入800ml 95％的乙醇，沉淀過夜后，去上清，沉淀加1L水溶解。稱取250g的芐乙銨溶于1L水中，將其慢慢加入肝素溶液中，攪拌。沉淀過濾，用水清洗后，過濾烘干，約得到327g的肝素鈉季銨鹽。
1.2芐基酯化肝素將上述肝素鈉季銨鹽溶于1.2L二氯甲烷中，緩慢加入350ml氯芐，在35℃下攪拌25小時(shí)。另外稱取200g醋酸鈉溶于2L甲醇中，慢慢加入到上述二氯甲烷溶液中，待沉淀析出后，過濾，用甲醇清洗2遍，過濾烘干，約得到116g肝素芐基酯，根據(jù)上述方法，測(cè)得其酯化率為13.4％。
1.3堿性條件下解聚將116g肝素芐基酯溶于2.5L水中，加熱到62℃，加入10.8g氫氧化鈉，攪拌裂解1.5個(gè)小時(shí)，降溫到20℃，加入鹽酸調(diào)節(jié)溶液pH至7.0。然后加入氯化鈉使終濃度為10％，加入8L甲醇，攪拌30分鐘，待沉淀析出后，過濾，用甲醇濾洗兩次，真空干燥，所得樣品為褐黃色，稱重約為43.6g。經(jīng)檢測(cè)，重均分子量為4718，其中分子量小于2000道爾頓的多糖分子含量為12.6％，分子量在2000-8000道爾頓之間的多糖分子含量為74.5％，分子量大于8000道爾頓的多糖分子含量為12.8％實(shí)施例2、脫色法一稱取23克依諾肝素粗品，加水溶解，比色相當(dāng)于歐洲藥典4規(guī)定的黃色3號(hào)色。加入活性炭，100rpm攪拌40分鐘，先用濾紙過濾除去活性炭，然后再用微孔濾膜過濾除去殘余的活性炭，比色介于歐洲藥典4定義的黃色4號(hào)色和5號(hào)色之間。將依諾肝素鈉溶液上H103非極性大孔聚苯乙烯吸附樹脂柱(南開大學(xué)化工廠生產(chǎn))，柱床體積150ml，用水洗脫，收集目標(biāo)峰。收集液再上柱洗脫2次，收集目標(biāo)峰，比色優(yōu)于歐洲藥典4規(guī)定的黃色5號(hào)色，接近于黃色6號(hào)色。將收集液用乙醇沉淀，經(jīng)過濾、凍干后，稱重得18.8克。經(jīng)檢測(cè)，所得依諾肝素鈉成品各項(xiàng)指標(biāo)如下重均分子量4604；分子量分布分子量小于2000道爾頓的多糖分子含量為13.8％，分子量在2000-8000道爾頓之間的多糖分子含量為75.1％。
抗Xa/抗II4.1；抗Xa108IU/mg；231nm吸收值14.06。
實(shí)施例3脫色法二稱取30克依諾肝素粗品，加水溶解，比色接近于歐洲藥典4規(guī)定的黃色3號(hào)色。將依諾肝素溶液上XAD-7HP極性大孔聚烷酯吸附樹脂柱(Rohm Haas公司生產(chǎn))，柱床體積為120ml，用水洗脫，收集目標(biāo)峰。再上柱洗脫2次，收集目標(biāo)峰，比色為歐洲藥典4定義的黃色4號(hào)色。加入活性炭，100rpm攪拌40分鐘，先用濾紙過濾除去活性炭，然后再用微孔濾膜過濾除去殘余的活性炭，比色優(yōu)于歐洲藥典4規(guī)定的黃色5號(hào)色。收集液經(jīng)乙醇沉淀，過濾、凍干后，稱重得26.4克。經(jīng)檢測(cè)，所得依諾肝素鈉成品各項(xiàng)指標(biāo)如下重均分子量4653；分子量分布分子量小于2000道爾頓的多糖分子含量為13.4％，分子量在2000-8000道爾頓之間的多糖分子含量為75.8％。
抗Xa/抗II4.3；抗Xa112.4IU/mg；231nm吸收值14.56。
上述實(shí)施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對(duì)本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種依諾肝素鈉的純化生產(chǎn)方法，其特征在于，包括如下步驟(1)在水媒介中用長鏈季銨鹽鹽化肝素。(2)芐基酯化上述被鹽化的肝素，其酯化程度在9.5％-14％之間。(3)堿性條件下解聚上述酯化程度在9.5％-14％之間的肝素，制得依諾肝素鈉粗品。(4)將上述解聚所得依諾肝素鈉粗品經(jīng)活性炭和大孔吸附樹脂進(jìn)行脫色。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的依諾肝素鈉的純化生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述的長鏈季銨鹽為芐乙銨。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的依諾肝素鈉的純化生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟(4)中，依諾肝素鈉先經(jīng)活性炭吸附脫色，再經(jīng)大孔吸附樹脂脫色。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的依諾肝素鈉的純化生產(chǎn)方法，其特征在于，所述步驟(4)中，依諾肝素鈉先經(jīng)大孔吸附樹脂脫色，再經(jīng)活性炭吸附脫色。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的依諾肝素鈉的純化生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的大孔吸附樹脂為極性大孔聚烷酯吸附樹脂XAD-7HP、非極性大孔聚苯乙烯吸附樹脂XAD-1600、非極性大孔聚苯乙烯吸附樹脂H1020、非極性大孔聚苯乙烯吸附樹脂H103或非極性大孔聚苯乙烯吸附樹脂D4006。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的依諾肝素鈉的純化生產(chǎn)方法，其特征在于，所述的大孔吸附樹脂為非極性大孔聚苯乙烯吸附樹脂H103。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種依諾肝素鈉的純化生產(chǎn)方法，在水媒介中用長鏈季銨鹽鹽化肝素，經(jīng)氯芐酯化后，在堿性條件下解聚得到分子量在3500－5500道爾頓之間的依諾肝素粗品，將上述解聚所得依諾肝素鈉粗品經(jīng)活性炭和大孔吸附樹脂進(jìn)行脫色后，得到能達(dá)到或優(yōu)于歐洲藥典4規(guī)定的顏色標(biāo)準(zhǔn)的依諾肝素成品，該方法經(jīng)濟(jì)實(shí)用，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，而且不會(huì)對(duì)依諾肝素鈉的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞。
文檔編號(hào)B01J20/26GK1850865SQ200610051609
公開日2006年10月25日 申請(qǐng)日期2006年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月24日
發(fā)明者金飛, 李輝, 阮德桂, 施吉順, 陳巍, 徐飛虎 申請(qǐng)人:杭州九源基因工程有限公司