專利名稱：一種清真依諾肝素鈉及其生產(chǎn)純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種清真依諾肝素鈉及其生產(chǎn)純化方法。
背景技術(shù)：
肝素鈉(Heparin)是一類分布廣泛的硫酸化程度較高的糖胺聚糖 (glycosaminoglycans, GAGS),廣泛存在于人和哺乳動物器官和組織中，其化學(xué)結(jié)構(gòu)由右旋葡萄糖醛酸和右旋葡萄糖胺交替連接而成，分子量分布5，000 - 30, 000道爾頓(平均分子量為20，000道爾頓)。肝素鈉是迄今為止人類已知的分子結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的有機(jī)化合物之一。肝素鈉具有很強(qiáng)的抗凝血、抗血栓等功能，即抗II a和抗Xa功能，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病防治領(lǐng)域。但是長期使用普通肝素鈉有誘導(dǎo)血小板減少癥的風(fēng)險(xiǎn)(3%)，而血小板減少癥能導(dǎo)致血栓癥和死亡率的增加，因此應(yīng)用受到一些限制。依諾肝素鈉(EnoxaparinSodium)為低分子肝素類(low molecular weight heparin,簡稱LMWH)品種之一，是普通肝素鈉化學(xué)降解產(chǎn)物。歐洲藥典(EP) 7. O版對依諾肝素鈉制備方法簡要描述為依諾肝素鈉是一種低分子肝素鈉鹽，它通過對肝素的芐基酯衍生物進(jìn)行堿解聚而獲得。美國專利US005389618A即采用這種堿解聚的β -消除法，其基本步驟為以豬粘膜肝素為起始原料，經(jīng)肝素季銨鹽制備、肝素芐酯的制備、對肝素芐酯進(jìn)行堿解聚、以酸中和、醇沉淀，精制、脫色，脫水干燥，得到依諾肝素鈉成品。與普通肝素鈉相比，依諾肝素鈉具有更強(qiáng)的抗凝效能，引起血小板減少的副作用明顯降低，出血并發(fā)癥亦減少、皮下注射吸收好、生物利用度高、體內(nèi)半衰期較長，使用方便等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此市場占有率約占肝素類產(chǎn)品2/3以上。根據(jù)2009年全球人口統(tǒng)計(jì)，全世界人口 68億，其中穆斯林有15. 7億，占世界人口 23. 4%，分布在200多個國家和地區(qū)。根據(jù)宗教的要求，所有的穆斯林吃喝及使用的藥品必須是清真的，這將催生了一個日益增長的清真產(chǎn)品市場，考慮到人口增長率和人均收入的增長，估計(jì)在未來的時間里，清真來源的肝素鈉和依諾肝素鈉將有非常廣闊的市場需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從清真牛肝素鈉粗品出發(fā)連續(xù)生產(chǎn)出肝素鈉精品和依諾肝素鈉。 在工藝上，改進(jìn)了常規(guī)技術(shù)對殘留蛋白質(zhì)分離存在的工藝繁瑣、純度低、收率差等不足。本發(fā)明采用牛肝素鈉粗品，采用胰蛋白酶除蛋白、氧化純化、乙醇沉淀、干燥，制備牛肝素鈉精品。該方法簡單可靠，操作方便，收率較高，所制的肝素鈉精品具有產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、純度好、 效價高等優(yōu)點(diǎn)。然后將制備的肝素鈉精品通過鹽化、酯化、降解、純化，最終制的依諾肝素鈉
鮮口
不目口口 ο本發(fā)明采用源于清真牛肝素鈉粗品為原料，連續(xù)制備了牛肺肝素鈉精品和依諾肝素鈉，滿足了穆斯林國家和地區(qū)廣闊市場的迫切需求，適合在東南亞，中東及穆斯林國家銷售及使用，為穆斯林國家及世界醫(yī)藥行業(yè)十分需求的制品。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種清真依諾肝素鈉，平均分子量在于CN 102585038 A 3500-5500道爾頓之間，溶血栓生物活性100-125 IU/mg，抗Xa與抗II a的比值在3. 3-5. 3 之間；該依諾肝素鈉為不同種類的混合物，混合物的基本組成為多糖鏈分子量小于2000 道爾頓的占12% 20%，多糖鏈分子量在2000 8000道爾頓的占68% 88%，多糖鏈分子量大于8000道爾頓少于18% ;其余各項(xiàng)均符合歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明公開的一種清真依諾肝素鈉的生產(chǎn)純化方法，依次包括以下步驟
I.肝素納精品的制備
室溫條件下，將I重量份的牛肺肝素鈉粗品溶解在8 12重量份的3%的氯化鈉溶液中，抽濾，除去不溶雜質(zhì)，在上述濾液中加入2-3%重量份的胰蛋白酶，用2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH值，使溶液的PH值為7-9，在35-45°C水浴中反應(yīng)3_7小時，之后，用2 mol/L 鹽酸調(diào)節(jié)pH值，使溶液的PH值為I. 5-2.0，過濾，除去雜蛋白，在上述清液中加I重量份的 2% 3%的雙氧水，用2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，使溶液的PH值為8. 5-9. 5，在25°C 恒溫水浴鍋中氧化10-20小時，抽濾，濾液中加入3-4倍濾液體積量的乙醇，沉淀12小時， 濾出上清液，得沉淀，將沉淀用丙酮研磨脫水2-3次，抽濾，沉淀真空干燥得肝素鈉精品， 肝素鈉精品的生物活性為120-170 IU/mg。2.肝素芐索氯銨鹽的制備
室溫條件下，將上述I重量份的肝素鈉精品溶解在10 15重量份的去離子水中，形成肝素鈉水溶液，將2 3重量份的芐索氯銨溶解在4 6重量份的去離子水中混合攪拌均勻，形成芐索氯銨水溶液，將芐索氯銨水溶液加入到肝素鈉水溶液中，充分反應(yīng)I小時， 靜置，抽濾，固體用2 4重量份的去離子水?dāng)嚢柘礈旌蟪闉V，操作兩次，所得固體在40 600C UO 20 mbar真空條件下干燥20 30小時，得到干燥的肝素芐索氯銨鹽。3.肝素芐酯的制備
將上述I重量份的肝素芐索氯銨鹽溶解在5 8重量份的干燥二氯甲烷中，加入I 3重量份的氯化芐，在25 45°C條件下，攪拌反應(yīng)20 30小時后停止，將反應(yīng)液加入到反應(yīng)液I倍體積量的10%醋酸鈉甲醇溶液中，固體析出，減壓抽濾，得到的固體物用I重量份的甲醇攪拌洗滌過濾兩次，固體于50 60°C條件下恒溫干燥，得肝素芐酯。4.依諾肝素鈉的制備
將上述I重量份的肝素芐酯溶解在15 20重量份的去離子水中，將O. 2 N氫氧化鈉水溶液加入，于55 70°C溫度下反應(yīng)30 70分鐘，冷卻至室溫，取O. 2 N稀鹽酸，調(diào)節(jié)至中性,并在上述稀鹽酸中加入15%氯化鈉，溶解過濾，將濾液加入到I. 6 2. O重量份的甲醇中，析出固體，離心，洗滌，固體于45 60°C干燥，得依諾肝素鈉粗品。5.依諾肝素鈉的純化
將上述I重量份的依諾肝素鈉粗品溶解在40 60°C的8 11重量份的去離子水中， 用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的PH值，使溶液的PH值為9 11，過濾，向上述濾液中加入濾液體積量的1% 3%的雙氧水，調(diào)節(jié)溶液的pH值，使溶液的pH值為9 11，再進(jìn)行保溫反應(yīng)，反應(yīng)時間為I 3小時，之后加入由氯化鈉制備成的10%氯化鈉溶液，調(diào)節(jié)溶液的pH值，使溶液的PH值為6 8，過濾，將所得的濾液加入到I. 6 2. O重量份的甲醇溶劑中，析出沉淀，離心，產(chǎn)品冷凍干燥，得依諾肝素鈉精品。本發(fā)明能有效的降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量，簡化生產(chǎn)工藝，依據(jù)該生產(chǎn)工藝， 最終得到的依諾肝素鈉精品為不同種類的混合物，符合歐洲藥典質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品滿足穆斯
4林世界的市場需求。


圖I為本發(fā)明為本發(fā)明工藝流程示意圖。
具體實(shí)施例方式為了加深對本發(fā)明的理解，下面將結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，該實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。具體實(shí)施，例一
稱取20g牛肺肝素鈉粗品備用。I.肝素鈉精品的制備
室溫條件下，將I重量份的牛肝素鈉粗品溶解在10重量份的3%的氯化鈉溶液中，抽濾，除去不溶雜質(zhì)。上述濾液中加入2 3%重量份的胰蛋白酶，用2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 7 9，在40°C水浴中反應(yīng)5小時，用2 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH I. 5 2. 0，過濾，除去蛋白。在上述清液中加肝素鈉粗品重量份2% 3%雙氧水，用用2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 8. 5 9. 5，在25°C恒溫水浴鍋中氧化15小時，抽濾，濾液中加入3 4倍濾液體積量的乙醇，沉淀12小時，濾出上清液，得沉淀。沉淀用丙酮研磨脫水2 3次，抽濾，沉淀真空干燥得肝素鈉精品。2.肝素芐索氯銨鹽的制備
室溫條件下，將上述肝素鈉精品溶解在10重量份去離子水中，將2. 5重量份的芐索氯銨溶解在4重量份去離子水中混合攪拌均勻。將芐索氯銨水溶液加入到肝素鈉水溶液中， 充分反應(yīng)I小時，靜置，抽濾，固體用2 4重量份的去離子水?dāng)嚢柘礈旌蟪闉V，操作兩次。 所得固體在40°C，10 20 mbar (I 2KPa)真空條件下干燥30小時，得到干燥的肝素芐索氯銨鹽。3.肝素芐酯的制備
將上述肝素芐索氯銨鹽溶解在7重量份干燥二氯甲烷中，加入I. I重量份氯化芐，在 40°C條件下，攪拌反應(yīng)25小時后停止，將反應(yīng)液加入到反應(yīng)液等體積的10%醋酸鈉甲醇溶液中，固體析出，減壓抽濾，得到的固體物用I重量份的甲醇攪拌洗滌過濾兩次，固體于 50 60°C條件下恒溫干燥，得肝素芐酯，酯化率9 14%。。4.依諾肝素鈉的制備
將上述肝素芐酯溶解在20重量份去離子水中，將O. 2 N氫氧化鈉水溶液加入，于62°C 溫度下反應(yīng)60分鐘，冷卻至室溫，取O. 2 N稀鹽酸，調(diào)節(jié)至中性，加入15%氯化鈉，溶解過濾，將濾液加入到I. 8重量份甲醇中，析出固體，離心，洗滌，固體于45 60°C干燥，得依諾肝素鈉粗品。5.依諾肝素鈉的純化
將上述依諾肝素鈉粗品溶解在55°C的10個重量份去離子水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至9. 2，過濾，向上述濾液中加入濾液體積量的2%的雙氧水，調(diào)節(jié)pH值至9. 2，保溫反應(yīng)2 小時，加入由氯化鈉制備成的10%氯化鈉溶液(w/v),鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7,過濾,將濾液加入到I. 8重量份的甲醇溶劑中，析出沉淀，離心，產(chǎn)品冷凍干燥，得依諾肝素鈉精品。
肝素鈉精品測定效價為153IU/mg ;依諾肝素鈉精品的平均分子量為4486，分子量小于2000道爾頓的占16. 2%，多糖鏈分子量在2000 8000道爾頓的占73. 8%，抗Xa生物活性為111.2 IU/mg，抗II a生物活性為26. 2 IU/mg，抗Xa/抗II a比值為4. 24。具體實(shí)施，例二
本實(shí)施例與實(shí)施例一不同之處是肝素鈉粗品200g，參照實(shí)施例I所述步驟，所得肝素鈉精品測定效價為138IU/mg ;依諾肝素鈉精品的平均分子量為4327，分子量小于2000道爾頓的占17. 8%，多糖鏈分子量在2000 8000道爾頓的占72. 5%，抗Xa生物活性為108. O IU/mg，抗II a生物活性為25. 7 IU/mg，抗Xa/抗II a比值為4. 20。。具體實(shí)施，例三
本實(shí)施例與實(shí)施例一不同之處是肝素鈉粗品1kg，參照實(shí)施例I所述步驟，所得肝素鈉精品測定效價為147IU/mg ;依諾肝素鈉精品的平均分子量為4560，分子量小于2000道爾頓的占17. 3%，多糖鏈分子量在2000 8000道爾頓的占71. 7%，抗Xa生物活性為106. 3 IU/mg,抗II a生物活性為25. 8 IU/mg,抗Xa/抗II a比值為4. 12。本發(fā)明產(chǎn)品以清真屠宰場的新鮮牛肺制備的肝素鈉粗品為起始原料，適合在東南亞，中東及穆斯林國家銷售及使用，為穆斯林國家及世界醫(yī)藥行業(yè)十分需求的制品。本發(fā)明的制造工藝采用以清真牛肺提取的肝素鈉粗品為主要原料，經(jīng)胰蛋白酶除去雜蛋白，氧化去色，制備得到精品肝素鈉，然后成鹽，酯化，解聚和純化得到依諾肝素鈉。
權(quán)利要求
1.一種清真依諾肝素鈉，其特征在于所述清真依諾肝素鈉的平均分子量在于 3500-5500道爾頓之間，溶血栓生物活性100-125 IU/mg，抗Xa與抗II a的比值在3. 3-5. 3 之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述清真依諾肝素鈉，其特征在于所述清真依諾肝素鈉為不同種類的混合物，混合物的基本組成為分子量小于2000道爾頓的多糖鏈為12% 20%，分子量在2000 8000道爾頓的多糖鏈為68% 88%，分子量大于8000道爾頓的多糖鏈少于18%。
3.一種清真依諾肝素鈉的生產(chǎn)純化方法，其特征在于，包括以下步驟A.肝素鈉精品的制備室溫條件下，將I重量份的牛肺肝素鈉粗品溶解在8 12重量份的3%的氯化鈉溶液中，抽濾，除去不溶雜質(zhì)，在上述濾液中加入2-3%重量份的胰蛋白酶， 用2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，使溶液的PH值為7_9，在35_45°C水浴中反應(yīng)3_7小時，之后，用2 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值，使溶液的PH值為I. 5-2. 0，過濾，除去雜蛋白，在上述清液中加I重量份的2% 3%的雙氧水，用2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，使溶液的PH 值為8. 5-9. 5，在25°C恒溫水浴鍋中氧化10-20小時，抽濾，濾液中加入3_4倍濾液體積量的乙醇，沉淀12小時，濾出上清液，得沉淀，將沉淀用丙酮研磨脫水2-3次，抽濾，沉淀真空干燥得肝素鈉精品，肝素鈉精品的生物活性為120-170 IU/mg ；B.肝素芐索氯銨鹽的制備室溫條件下，將上述I重量份的肝素鈉精品溶解在10 15重量份的去離子水中，形成肝素鈉水溶液，將2 3重量份的芐索氯銨溶解在4 6重量份的去離子水中混合攪拌均勻，形成芐索氯銨水溶液，將芐索氯銨水溶液加入到肝素鈉水溶液中，充分反應(yīng)I小時，靜置，抽濾，固體用2 4重量份的去離子水?dāng)嚢柘礈旌蟪闉V，操作兩次，所得固體在40 60°C、10 20 mbar真空條件下干燥20 30小時，得到干燥的肝素芐索氯銨鹽；C.肝素芐酯的制備將上述I重量份的肝素芐索氯銨鹽溶解在5 8重量份的干燥二氯甲烷中，加入I 3重量份的氯化芐，在25 45°C條件下，攪拌反應(yīng)20 30小時后停止，將反應(yīng)液加入到反應(yīng)液I倍體積量的10%醋酸鈉甲醇溶液中，固體析出，減壓抽濾，得到的固體物用I重量份的甲醇攪拌洗滌過濾兩次，固體于50 60°C條件下恒溫干燥，得肝素節(jié)酯;D.依諾肝素鈉的制備將上述I重量份的肝素芐酯溶解在15 20重量份的去離子水中，將O. 2 N氫氧化鈉水溶液加入,于55 70°C溫度下反應(yīng)30 70分鐘,冷卻至室溫, 取O. 2 N稀鹽酸，調(diào)節(jié)至中性，并在上述稀鹽酸中加入15%氯化鈉，溶解過濾，將濾液加入到I.6 2. O重量份的甲醇中，析出固體，離心，洗滌，固體于45 60°C干燥，得依諾肝素鈉粗品;E.依諾肝素鈉的純化將上述I重量份的依諾肝素鈉粗品溶解在40 60°C的8 11 重量份的去離子水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液的PH值，使溶液的PH值為9 11，過濾，向上述濾液中加入濾液體積量的1% 3%的雙氧水，調(diào)節(jié)溶液的pH值，使溶液的pH值為9 11， 再進(jìn)行保溫反應(yīng)，反應(yīng)時間為I 3小時，之后加入由氯化鈉制備成的10%氯化鈉溶液，調(diào)節(jié)溶液的PH值，使溶液的pH值為6 8，過濾，將所得的濾液加入到I. 6 2. O重量份的甲醇溶劑中，析出沉淀，離心，產(chǎn)品冷凍干燥，得依諾肝素鈉精品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種清真依諾肝素鈉，清真依諾肝素鈉的平均分子量在于3500-5500道爾頓之間，溶血栓生物活性100-125IU/mg，抗Xa與抗Ⅱa的比值在3.3-5.3之間；清真依諾肝素鈉生產(chǎn)純化方法，包括肝素鈉粗品純化，肝素鈉鹽化、干燥、酯化、醇沉降、堿降解、醇沉降、氧化、醇沉降、精濾、干燥制得成品。本發(fā)明以牛肺肝素鈉粗品為起始原料，能有效降低生產(chǎn)成本；采用胰蛋白酶純化肝素鈉，操作方便、收率較高，所制的肝素鈉精品具有質(zhì)量穩(wěn)定、純度好、效價高等優(yōu)點(diǎn)；精制肝素芐酯，穩(wěn)定了最終產(chǎn)品質(zhì)量，簡化純化難度，有效解決生產(chǎn)中色素問題，提高產(chǎn)品質(zhì)量。
文檔編號A61P7/02GK102585038SQ201210064430
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月13日
發(fā)明者季春香, 屈建興, 湯慶剛, 牛洪森 申請人:麥科羅夫(南通)生物制藥有限公司